Guide par étapes pour l’isolement et l’analyse de la surface des feuilles et de l’ARN apoplasique à l’aide de rosettes d’Arabidopsis

Résumé

Nous décrivons une méthode simple mais hautement reproductible pour isoler l’ARN extracellulaire de la surface des feuilles et de l’apoplaste des plantes Arabidopsis.

Résumé

La surface des feuilles des plantes et l’espace intercellulaire à l’intérieur des feuilles (l’apoplaste) servent d’interfaces clés pour l’échange moléculaire entre les plantes et leurs microbes en interaction. Dans des travaux précédents, nous avons démontré la présence d’une gamme variée d’espèces d’ARN dans l’apoplast des rosettes d’Arabidopsis. Plus récemment, nos résultats ont révélé que les plantes d’Arabidopsis sécrètent également activement de l’ARN à la surface de leurs feuilles. Pour étudier cela, nous avons développé une méthode hautement reproductible pour collecter à la fois le lavage de la surface des feuilles (LSW) et le liquide de lavage apoplasique (AWF) du même ensemble de plantes Arabidopsis. De plus, nous avons exploré une technique non invasive impliquant l’écouvillonnage de la surface des feuilles (LSS), qui nous a permis de collecter l’ARN en écouvillonnant doucement la surface des feuilles avec des bâtonnets stériles à bout de coton. Pour minimiser le risque de contamination microbienne, nous avons filtré les fractions LSW, AWF et LSS avant d’isoler l’ARN extracellulaire (exARN). En analysant l’exARN purifié à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’ARN dénaturant, nous avons observé un large éventail d’espèces d’ARN longues et petites dans les échantillons d’ARN LSW, LSS et AWF. Une quantification plus poussée et une analyse comparative entre les échantillons d’exRNA et les conditions expérimentales ont été effectuées à l’aide du logiciel ImageJ en libre accès. Ce protocole fournit une approche efficace et rentable pour isoler et analyser de petites quantités d’exARN à partir des feuilles des plantes. Ces préparations d’ARN peuvent être caractérisées davantage par le séquençage et d’autres analyses moléculaires, offrant un aperçu des rôles dynamiques de l’exARN dans les interactions plantes-microbes.

Introduction

Les feuilles sont colonisées par une variété de microbes, notamment des bactéries, des champignons, des oomycètes et des protistes, qui peuvent aider à protéger les plantes contre les facteurs de stress biotiques et abiotiques, favorisant ainsi la croissance et le développement des plantes 1,2,3,4. La feuille de la plante a deux compartiments principaux pour accueillir leurs microbes en interaction : épiphyte (surface de la feuille) et endophyte (apoplaste)². La surface des feuilles est protégée par une couche de cuticule hydrophobe, qui empêche la perte d’eau et comprend des composants tels que la cire et la cutine. La surface supérieure (adaxiale) des feuilles comprend souvent des cellules épidermiques spécialisées ressemblant à des cheveux appelées trichomes, qui protègent contre la lumière UV, régulent la température et servent de moyen de dissuasion à l’herbivorie. En revanche, l’apoplast facilite les échanges gazeux et hydriques pour la photosynthèse et fournit un environnement humide propice à la colonisation microbienne⁵. Malgré ces différences, les deux compartiments foliaires favorisent certains microbes, les réseaux microbiens épiphytes étant plus complexes en termes de diversité par rapport aux réseaux microbiens endophytes⁵. La façon dont la composition de ces communautés microbiennes est régulée dans chaque compartiment extracellulaire reste mal comprise. Nous supposons que la structure de la communauté microbienne peut être déterminée, en partie, par l’ARN extracellulaire (exARN) sécrété par la plante hôte.

Dans notre étude récente, nous avons rapporté la présence de diverses espèces d’ARN à la surface des feuilles qui diffèrent de l’ARN dans l’apoplast ou les lysats cellulaires⁶. Alors que la plupart des recherches sur les exARN chez les plantes se sont concentrées sur les petits ARN non codants, tels que les microARN (miARN) et les petits ARN interférents (siARN), moins d’attention a été accordée à d’autres espèces d’ARN, telles que les fragments dérivés de l’ARNr et de l’ARNt, qui peuvent potentiellement réguler les processus cellulaires indépendamment de la complémentarité des séquences, en particulier chez les espèces dépourvues de mécanismes d’interférence ARN ^{7,8. 9}. Planche à billets

La méthode que nous décrivons ici permet l’isolement séquentiel de l’ARN à partir du lavage de la surface des feuilles (LSW) et du liquide de lavage apoplasique (AWF) en utilisant le même ensemble de plantes Arabidopsis. De plus, nous décrivons une technique orthogonale non invasive impliquant un écouvillon de surface foliaire (LSS), qui permet de collecter l’ARN en tamponnant doucement la surface de la feuille pulvérisée avec des bâtonnets stériles à bout de coton⁶. Pour minimiser le risque de contamination microbienne, nous filtrons à la fois les fractions LSW et AWF avant d’isoler l’ARN extracellulaire. Pour évaluer la distribution de la quantité et de la taille des échantillons d’exARN, nous décrivons un protocole utilisant l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant combinée à l’analyse d’images à l’aide du logiciel ImageJ en libre accès. Ce protocole fournit une approche efficace et rentable pour isoler et analyser de petites quantités d’exARN. Ces préparations d’ARN peuvent être caractérisées davantage par le séquençage et les analyses moléculaires, offrant un aperçu des rôles dynamiques de l’ARN extracellulaire dans les interactions plantes-microbes.

Le protocole décrit ci-dessous diffère de notre protocole précédemment décrit pour isoler l’ARN des vésicules extracellulaires végétales¹⁰. Le protocole actuel ne nécessite aucune étape d’ultracentrifugation et permet d’isoler l’ARN du liquide de lavage extracellulaire total, et pas seulement des vésicules extracellulaires. Plus important encore, il fournit deux méthodes orthogonales pour isoler l’ARN de la surface des feuilles. À notre connaissance, l’isolement de l’ARN à la surface des feuilles n’a pas été décrit avant notre récente publication⁶.

Protocole

1. Préparation du tampon et stérilisation

1. Préparez un tampon d’isolement des vésicules (VIB) comprenant 20 mM d’acide éthanesulfonique (MES), un pH de 6,0, 2 mM de CaCl₂ et 0,01 M de NaCl dans 1 L d’eau distillée.
   REMARQUE : Des ajustements mineurs ont été apportés à la concentration de NaCl dans le VIB, passant de 0,1 M à 0,01 M, afin d’imiter la concentration ionique de l’apoplaste de la feuille.
2. Autoclave le VIB pendant 20 min à 121 °C, cycle liquide. Vous pouvez également stériliser le VIB à l’aide d’un filtre à vide de 0,45 μm.
   REMARQUE : Cette étape consiste à s’assurer que le tampon est stérile, car toute contamination microbienne pourrait entraîner l’obtention de plantes et, par conséquent, une variabilité des résultats. Ce tampon peut être stocké à température ambiante (sans ouvrir le couvercle après la stérilisation) pour un stockage à court terme ou à 4 °C pour un stockage à long terme.

2. Matériel végétal et état de croissance

1. Semez les graines d’Arabidopsis thaliana Col-0 de type sauvage (WT) dans des pots ronds en plastique de 4 pouces contenant un terreau standard. Après le semis, trempez les graines avec un fongicide biologique (600 mg/L), couvrez-les d’un dôme en plastique transparent et maintenez-les à 4 °C dans l’obscurité pendant 3 jours pour induire une germination synchronisée.
2. Transférez les pots contenant les graines dans une chambre de croissance à température contrôlée et à jours courts réglée à 24 °C sous une photopériode de 9 h de lumière et 15 h d’obscurité avec une densité de flux de photons photosynthétiques de 150 μmol·m⁻²·s⁻¹ au niveau de la plante (mélange 50:50 d’ampoules fluorescentes de 32 watts de spectre de 3 500 et 5 000 K).
3. Après environ 10 jours, transférez les semis individuels dans des plateaux de 36 cellules contenant du terreau et couvrez d’un dôme en plastique transparent pendant 1 à 2 semaines.
   REMARQUE : Une expérience typique nécessite ~12-24 plantes saines pour chaque génotype/traitement. Il a été noté que les plantes âgées de 6 à 7 semaines produisent la quantité optimale d’ARN LSW et AWF avec le plus faible risque de contamination cellulaire.
4. Selon le terreau utilisé, arrosez les plantes tous les 10 à 15 jours pour éviter le stress de la sécheresse ou des inondations.

3. Collecte de l’ARN de surface des feuilles

1. Méthode basée sur la centrifugation (Leaf Surface Wash ; LSW)
   1. Pour chaque répétition, utilisez des plantes d’Arabidopsis âgées de 6 à 7 semaines.
   2. Ajouter Silwet-L77 (ci-après appelé agent mouillant) au VIB stérile à une concentration finale de 0,001 % (1 μL dans 100 mL de VIB) avant de commencer l’isolement du LSW.
      REMARQUE : Silwet-L77 est un agent mouillant qui réduit la tension superficielle et permet au tampon de recouvrir les surfaces des feuilles.
   3. Transférez 100 ml de VIB dans un flacon pulvérisateur de 500 ml.
   4. Détachez soigneusement les rosettes d’Arabidopsis de leurs racines à l’aide de ciseaux fins.
   5. Enlevez l’excès de terre du pétiole à l’aide d’une brosse douce.
   6. Placez les rosettes sur un plateau plat avec la surface abaxiale vers le haut.
   7. Vaporisez la surface abaxiale avec VIB + agent mouillant à l’aide de cinq pompes du flacon pulvérisateur.
   8. Retournez les rosettes avec précaution et vaporisez cinq fois la surface adaxiale avec VIB + agent mouillant.
   9. Pour récupérer le LSW, placez soigneusement les rosettes pulvérisées à l’intérieur de seringues sans aiguille de 60 ml avec des trous au fond (un maximum de deux rosettes de 6 semaines peuvent tenir par seringue) placées à l’intérieur de flacons de centrifugeuse de 250 ml. Enroulez la seringue avec un parafilm autour du cou pour suspendre l’embout de la seringue au-dessus du bas de la bouteille (voir la figure 1 pour référence).
      REMARQUE : Pour plus de détails sur la préparation des seringues de 60 mL avec trous, reportez-vous au protocole¹¹ publié précédemment.
   10. Centrifuger les bouteilles chargées à 100 g pendant 10 min à 4 °C (rotor JA-14).
   11. Filtrer le LSW à travers un filtre à seringue de 0,22 μm et recueillir le filtrat dans un tube de centrifugation de 50 mL placé sur de la glace.
       REMARQUE : En règle générale, 12 plantes donneraient environ 30 ml de LSW à la fin en utilisant ce protocole. Cependant, il ne s’agit que d’une estimation basée sur le nombre de pulvérisations effectuées à chaque étape. Ce volume est normalement inférieur au volume pulvérisé, car une partie du tampon pulvérisé est perdue lors de la manipulation.
2. Méthode de l’écouvillonnage de la surface des feuilles (LSS)
   1. Vaporisez les rosettes détachées avec VIB + agent mouillant comme décrit dans la section précédente (étapes 3.1.1-3.1.7).
   2. Pour récupérer le LSS, frottez les surfaces adaxiale et abaxiale à l’aide de bâtonnets stériles à embout de coton et appuyez les pointes trempées contre la paroi intérieure d’un tube de centrifugation de 15 mL pour extraire le liquide.
      REMARQUE : Les échantillons LSS adaxiaux et abaxiaux peuvent être collectés dans des tubes séparés en fonction de la configuration expérimentale et des résultats attendus.
   3. Filtrez les échantillons LSS à travers un filtre à seringue de 0,22 μm dans un tube de centrifugation de 15 mL placé sur de la glace.
      REMARQUE : Selon le nombre de plantes prélevées, des volumes variables de LSS peuvent être prélevés par expérience.

Figure 1 : Outils utilisés pour le lavage de la surface des feuilles et l’isolement du liquide de lavage apoplastique. (A) Pour recueillir les LSW et AWF, deux rosettes entières d’Arabidopsis thaliana sont placées dans une seringue de 60 mL avec huit trous supplémentaires qui sont fondus à l’extrémité de la seringue à l’aide d’une pince chauffée pour créer des canaux permettant au lavage de s’écouler. (B) Cette seringue sans aiguille est ensuite enveloppée d’un parafilm au niveau du cou, comme illustré. (C) Cette étape permet à la seringue de s’insérer dans un flacon à centrifuger de 250 ml sans toucher le fond du flacon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Collecte du liquide de lavage apoplasique (AWF)

1. Placez le même ensemble de plantes que celui utilisé pour l’isolement du LSW ou du LSS dans un bécher et rincez-les doucement deux fois à l’eau distillée.
2. Infiltration sous vide des rosaces avec VIB pendant 20 s comme suit :
   REMARQUE : Bien que le processus d’infiltration sous vide soit bien décrit dans un protocole¹¹ publié précédemment, il a été reproduit ici pour rendre le protocole actuel clair.
   1. Placez soigneusement les rosettes dans une cafetière à piston avec 300 à 500 ml de VIB. Placez le couvercle sur la presse française et abaissez doucement le piston jusqu’à ce que les plantes soient complètement immergées.
   2. Placez la presse française avec les plantes et le tampon dans une chambre à vide. Appliquer un vide pendant 20 s à l’aide d’une pompe à vide. Le tampon doit commencer à bouillir.
   3. Relâchez l’aspirateur et retirez la presse française de la chambre à vide, retirez le couvercle et versez le VIB dans un bécher en plastique séparé de 500 ml. Retirez les rosaces de la presse française.
      REMARQUE :Le VIB peut être réutilisé plusieurs fois le même jour pour un génotype, mais une fois utilisé pour l’infiltration sous vide, le VIB ne doit pas être stocké pour être utilisé un autre jour.
   4. Retirez l’excès de VIB des plantes en secouant doucement, puis en brossant les feuilles sur une serviette en papier.
3. Retirez l’excès de tampon de la surface des feuilles en les tamponnant doucement avec du papier buvard.
4. Pour recueillir le liquide de lavage apoplasique (AWF), placez les rosettes dans des seringues sans aiguille de 60 ml placées dans des flacons de centrifugation de 250 ml comme décrit pour la collecte de LSW et la centrifugation à 4 °C pendant 30 min à 600 × g avec une accélération lente.
5. Filtrez l’AWF groupé à travers un filtre à seringue de 0,22 μm et collectez le filtrat dans un tube à centrifuger de 15 mL placé sur de la glace.
   REMARQUE : En règle générale, 12 plantes donneraient environ 6 ml de FLE à la fin en utilisant ce protocole. Les LSW, AWF et LSS filtrés peuvent être utilisés immédiatement ou stockés à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
6. Consigner le poids frais (FW) des plantes utilisées pour chaque répétition après l’isolement de la FKE. Par la suite, utilisez cette lecture pour normaliser la quantité d’ARN dans chaque échantillon (Figure 2).

Figure 2 : Illustrations schématiques du protocole et de la méthode de l’écouvillonnage de la surface des feuilles. (A) Illustration schématique du protocole par étapes pour l’isolement du lavage de la surface des feuilles et du liquide de lavage apoplasique à l’aide de rosettes d’Arabidopsis. (B) Illustration schématique de la méthode de l’écouvillonnage de la surface des feuilles (LSS) pour isoler l’ARN de la surface des feuilles. Figures adaptées des figures S1 et S4 de Borniego et al., 2025⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Précipitation de l’ARN

1. Précipitez l’ARN en mélangeant le volume requis d’AWF, de LSW ou de LSS avec 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et 1,0 volume d’isopropanol froid dans un tube de centrifugation de 15 mL.
2. Ajouter du glycogène (20 mg/mL) à une concentration finale de 20 μg/mL.
   REMARQUE : Assurez-vous que les tubes de centrifugation utilisés pour précipiter l’ARN peuvent être centrifugés à une vitesse élevée de 13 000 × g. La rupture des tubes à cette étape peut entraîner la perte d’échantillons d’ARN.
3. Incuber le mélange à -20 °C pendant au moins 1 h ou toute la nuit.
4. Centrifuger les tubes à 13 000 × g pendant 30 min à 4 °C (rotor JA-25.50).
5. Lavez le granulé deux fois avec de l’EtOH glacé à 70 % et laissez-le sécher à l’air libre pendant 10 minutes maximum.
6. Remettre les pastilles en suspension dans 100 μL d’eau ultrapure sans DNase/RNase ou VIB, et transférer l’ARN dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL.
   REMARQUE : Après cette étape, l’ARN précipité peut être stocké à -80 °C jusqu’à 2 semaines.

6. Isolement de l’ARN à base de TRIzol

1. Ajouter 1 mL de réactif TRIzol dans chaque tube et mélanger en agitant sur un rotateur.
   ATTENTION : Pour manipuler TRIzol, utilisez-le dans une hotte, portez des gants et des lunettes de protection.
2. Placez les tubes sur un rotateur de table pendant 10 min à température ambiante (RT).
3. Ajouter 200 μL de chloroforme dans chaque tube, suivi d’une brève mais vigoureuse étape de vortex.
   ATTENTION : Pour manipuler le chloroforme, utilisez-le dans une hotte, portez des gants et des lunettes de protection.
4. Laissez les tubes reposer à RT pendant environ 3 min, puis centrifugez-les à 13 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
5. Transférez la phase aqueuse dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL marqués et ajoutez 10 μg de glycogène sans RNase et un volume d’isopropanol froid.
   ATTENTION : Pour les déchets biologiques dangereux générés (tels que les déchets phénoliques), collectez les solvants organiques dans des conteneurs à déchets désignés conformément aux directives institutionnelles.
6. Incuber les tubes pendant 1 h maximum à -20 °C.
   REMARQUE : La précipitation de l’ARN pendant plus de 1 h à cette étape réduit l’efficacité de l’isolement de l’ARN et conduit à une très faible concentration d’ARN.
7. Pour granuler l’ARN, centrifugez les tubes à 13 000 × g pendant 20 min à 4 °C.
8. Lavez les granulés d’ARN deux fois avec de l’EtOH glacé à 70 % et laissez-les sécher à l’air libre avant de les remettre en suspension dans 10 à 20 μL d’eau ultrapure sans DNase/RNase.
9. Stockez l’ARN remis en suspension à -20 °C ou -80 °C pour un stockage à court ou à long terme, respectivement.

7. Élimination de la contamination par le phénol ou la guanidine

1. Pour éliminer la contamination par le phénol ou la guanidine des échantillons d’ARN, effectuez une ou deux précipitations en série avec 96 % d’EtOH et d’acétate d’ammonium.
2. Ajouter 1 μg de glycogène à 10 μL d’échantillons d’ARN et mélanger avec 0,5 volume d’acétate d’ammonium 7,5 M avant l’ajout de 2,5 volumes d’EtOH à 96-100 %.
   REMARQUE : La concentration finale d’EtOH doit être de 70-75 % dans tout le volume à cette étape.
3. Incuber le mélange à -80 °C pendant 30 min et centrifuger à 13 000 × g pendant 20 min à 4 °C.
4. Lavez la pastille d’ARN deux fois avec 70 % d’EtOH et mettez-la en suspension dans 10 μL d’eau ultrapure sans DNase/RNase.

8. Électrophorèse sur gel d’ARN pour la quantification et la comparaison

1. Préparez un mini-gel (7,2 cm x 8,6 cm x 0,75 mm) contenant 10 % ou 15 % de polyacrylamide et 7 M d’urée dans 1 EDTA d’acide tris-borique (TBE, pH 8,4) en utilisant une solution d’acrylamide/Bis à 40 %, 37,5:1. Alternativement, un mini-gel dénaturant commercial (15 % TBE-Urea Gel) peut être utilisé pour analyser les échantillons d’ARN.
2. Mélanger des échantillons d’ARN (1:1) avec 2 tampons de charge dénaturants (95 % de formamide, 10 mM d’EDTA, 0,02 % de SDS, 0,02 % de bleu de bromophénol et 0,01 % de cyanol de xylène), dénaturer à 65 °C pendant 5 min et placer immédiatement sur de la glace.
3. Résoudre les échantillons d’ARN dans un tampon de fonctionnement TBE 0,5x à RT à 220 V pendant environ 1 h et 15 min.
4. Pour les étalons de taille, utilisez un mélange 1:1 de marqueurs d’échelle d’ARNss bas de gamme et de marqueurs d’échelle d’ARNsb de 14 à 30 nt.
5. Teindre le gel avec 1x SYBR gold nucleic gel colorer en 0,5x TBE pendant 10 min, laver deux fois à l’eau distillée et imager à l’aide d’un système d’imagerie (Figure 3).
6. Pour quantifier l’ARN résolu dans chaque voie, utilisez la méthode d’analyse sur gel décrite dans la documentation ImageJ sous le sous-titre « Analyse sur gel » : https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
7. Étant donné que 100 ng/μL d’ARN CL sont chargés à chaque fois pour comparer le modèle de bandes entre les échantillons CL et exARN, estimez la concentration des échantillons exARN par rapport à l’ARN CL (Figure 4).

Figure 3 : Les feuilles des plantes sont recouvertes de divers ARN. 100 ng d’ARN provenant du lysat de cellules foliaires (CL) et 2 μL d’ARN isolés de l’AWF et du LSW ont été séparés sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 15 % et colorés avec un colorant d’acide nucléique SYBR Gold pour visualiser et comparer les modèles de bandes d’ARN. Les normes de taille de l’ARN sont indiquées dans la voie la plus à gauche. Les mesures de densitométrie obtenues à l’aide de l’analyse sur gel ImageJ sont indiquées au bas de chaque voie et indiquent la quantité d’ARN par rapport à l’ARN dans la voie totale de lysat de cellules foliaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Extraction répétée de l’ARN LSW. Le LSW a d’abord été isolé à l’aide de VIB sans Silwet L-77 ou à des concentrations variables de Silwet L-77 (0,001 % ou 0,01 %). L’isolement répété de LSW à l’aide du même ensemble de plantes d’Arabidopsis peut être utilisé pour enrichir l’ARN LSW en utilisant VIB + Silwet L-77 (0,001 %). L1, L2 et L3 désignent des échantillons d’ARN isolés à l’aide de LSW collectés lors de trois cycles successifs de centrifugation après la pulvérisation du même ensemble de plantes. L’augmentation de la concentration de l’agent mouillant de 0,001 % à 0,01 % n’a pas amélioré l’isolement de l’ARN LSW. Les mesures densitométriques obtenues à l’aide de l’analyse sur gel ImageJ sont indiquées au bas de chaque couloir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

9. Autre méthode de quantification de l’ARN à l’aide d’une méthode basée sur une plaque de microtitration

1. Préparez des solutions d’ARN standard en utilisant de l’ARN CL dans de l’eau ultrapure sans RNase/DNase. Déterminer la plage de concentration appropriée pour les étalons en fonction de la concentration prévue des échantillons. Utiliser les concentrations d’ARN suivantes : 0, 6,75, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/μL et préparer un volume suffisant de chaque étalon pour permettre deux répétitions techniques.
2. Préparez 1,5 fois la coloration au gel d’acide nucléique SYBR Gold dans 500 mM Tris HCl pH = 8.
   REMARQUE : SYBR Gold dépend du pH et a une sensibilité optimale à la coloration entre pH = 7,0 et 8,0.
3. Configuration des microplaques :
   1. Ajouter 99 μL de dH₂O dans chaque puits.
   2. Ajouter 1 μL d’ARN dans chaque puits. Utilisez 1 μL pour les échantillons d’ARN et les étalons d’ARN.
   3. Ajouter 50 μL de 1,5x SYBR Gold dans chaque puits.
4. Réglez les paramètres sur le lecteur de microplaques comme suit :
   Secousse - Linéaire ou orbitale : 0:03 (MM :SS)
   Lire - Point final de fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation définie à 496 nm et une longueur d’onde d’émission définie à 540 nm.
5. Construire une ligne d’étalonnage à l’aide des valeurs des étalons. À l’aide de l’équation de la droite d’étalonnage, calculez les concentrations d’ARN dans les échantillons.
   REMARQUE : D’autres colorants peuvent être utilisés pour quantifier l’ARN dans les échantillons isolés par TRIzol. Des résultats similaires ont été obtenus avec le réactif de quantification de l’ARN Ribo488. Un manuel détaillé est fourni par l’entreprise pour ce colorant. Brièvement, diluer le colorant 1000x (1 à 1000) en utilisant 200 mM Tris pH = 8. Ensuite, pour effectuer les mesures, ajoutez 99 μL de dH₂O autoclavé dans chaque puits + 1 μL d’ARN (échantillon ou étalon) + 100 μL de dilution Ribo488, incubez 5 min et quantifiez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaque en utilisant une excitation de 480 nm et une émission de 520 nm. Les courbes standard obtenues à l’aide des deux colorants d’ARN sont illustrées à la figure 5.

Figure 5 : Courbes standard obtenues à l’aide d’une méthode de quantification de l’ARN basée sur une plaque de microtitration. Deux colorants d’ARN différents, SYBR Gold (à gauche) et Ribo488 (à droite) donnent des résultats cohérents avec deux répétitions techniques par échantillon. L’une ou l’autre méthode peut être utilisée pour effectuer la quantification de l’ARN. Cependant, une courbe standard doit être obtenue chaque fois que l’ARN doit être quantifié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

La figure 2A présente un aperçu schématique du protocole par étapes décrit ci-dessus pour l’isolement des fractions de lavage de la surface des feuilles (LSW) et des fractions de lavage apoplasiques (AWF) des plantes d’Arabidopsis. Cette méthode permet d’extraire à la fois le LSW et l’AWF à partir d’aussi peu que trois à six plantes par réplication, tout en produisant constamment des quantités équivalentes d’ARN à partir des deux fractions. Pour mesurer la concentration d’ARN dans les lysats cellulaires, nous utilisons la spectrophotométrie NanoDrop. Cependant, pour les échantillons d’ARN dérivés de LSW, LSS et AWF, nous nous appuyons sur la quantification densitométrique des gels de polyacrylamide colorés à l’or SYBR. Cette étape de quantification est nécessaire car les fractions extracellulaires contiennent un contaminant inconnu - probablement des polysaccharides - qui peuvent parfois copurifier et interférer avec les méthodes de quantification de l’ARN basées sur l’absorbance, conduisant à une surestimation de la concentration d’ARN. Pour surmonter cette limitation, nous prévoyons d’utiliser des méthodes de purification d’ARN non basées sur le phénol dans nos travaux futurs.

L’analyse du gel d’ARN dénaturant a révélé la présence d’un large éventail d’espèces d’ARN dans le LSW et l’AWF, y compris des ARN longs et petits (Figure 3). Notamment, des quantités équivalentes d’ARN ont été isolées avec succès à partir de la surface des feuilles et des fractions apoplasiques, les quantités d’ARN étant normalisées par poids frais (FW) de la plante. Étonnamment, les profils de taille d’ARN des fractions LSW et AWF différaient significativement l’une de l’autre et du profil de l’ARN lysat cellulaire total (CL). Ces différences suggèrent que les fractions d’exARN ne sont pas contaminées par l’ARN cellulaire. Parmi les trois fractions, l’ARN apoplasique (AWF) présentait la plus grande diversité dans la distribution de la taille, ce qui suggère que l’ARN apoplasique est plus dégradé que l’ARN de surface des feuilles.

Pour examiner plus en détail la présence d’ARN à la surface des feuilles d’Arabidopsis, nous avons utilisé des cotons-tiges. Cette méthode nous a permis de collecter séparément et séquentiellement l’ARN des surfaces des feuilles adaxiales (supérieures) et abaxiales (inférieures)⁶. Ces analyses ont révélé que les deux surfaces foliaires contenaient des quantités similaires d’ARN. De plus, la capacité de collecter l’ARN simplement en absorbant le tampon de la surface de la feuille sans avoir besoin de centrifugation soutient davantage la conclusion que l’ARN est effectivement situé à la surface de la feuille, plutôt que d’être extrait à travers les stomates pendant la centrifugation.

L’un des principaux ajustements qui nous a permis d’extraire une quantité abondante d’ARN à la surface des feuilles a été l’ajout de l’agent mouillant. Nous avons récupéré près de deux fois plus d’ARN en ajoutant un agent mouillant (à une très faible concentration de 0,001 %) au VIB. Cette différence de concentration d’ARN obtenue avec et sans Silwet L-77 indique que l’utilisation d’un agent mouillant améliore la dissolution de l’ARN à la surface de la feuille. Cependant, l’augmentation de la concentration de l’agent mouillant de 0,001 % à 0,01 % n’a pas amélioré l’isolement de l’ARN LSW (figure 4). Notamment, la répétition de l’isolement de l’ARN LSW à partir des mêmes feuilles a produit de l’ARN supplémentaire (environ 63 % de la récupération obtenue lors du premier lavage), ce qui suggère que les feuilles sécrètent continuellement de l’ARN à la surface, près des deux tiers de celui-ci étant remplacés dans les 30 minutes environ nécessaires au traitement des feuilles. Pour augmenter les rendements totaux en ARN LSW lorsque le matériel végétal est limitant, il est donc possible de laver les mêmes feuilles plusieurs fois de suite. Cependant, nous ne recommandons pas plus de trois lavages, car la manipulation impliquée peut entraîner des dommages cumulatifs au matériau des feuilles, comme l’indique la coloration verte du liquide de lavage. Pour ces expériences, la concentration d’ARN a été estimée à l’aide d’une analyse densitométrique basée sur le gel d’ARN. Cependant, la méthode de quantification de l’ARN sur plaque de microtitration décrite ci-dessus peut être utilisée pour une quantification précise de l’ARN lors de l’évaluation de plusieurs échantillons à la fois (figure 5).

Discussion

Ce protocole détaille comment isoler le lavage de la surface des feuilles (LSW), l’écouvillon de la surface des feuilles (LSS) et le liquide de lavage apoplasique (AWF) à partir de rosettes d’Arabidopsis saines, suivi d’une extraction de l’ARN. Les étapes critiques comprennent la préparation et la stérilisation du VIB avant la réalisation de l’expérience, la culture des plantes dans des conditions contrôlées et l’utilisation de Silwet-L77 pour assurer un revêtement adéquat de la surface des feuilles par le VIB. Ces procédures devraient produire des quantités égales d’ARN à partir du LSW et de l’AWF, normalisées en fonction du poids frais des feuilles. La récupération de l’ARN à partir de ces fractions extracellulaires nécessite une manipulation soigneuse, notamment en ce qui concerne les pastilles d’ARN après les étapes de précipitation.

Bien que le protocole ci-dessus ait été optimisé pour les feuilles d’Arabidopsis, nous l’avons également utilisé avec succès sur d’autres espèces de plantes avec seulement des modifications mineures. L’extraction de l’ARN à la surface des feuilles peut être optimisée en mettant en œuvre deux ajustements principaux : premièrement, en effectuant plusieurs cycles d’isolement de LSW, et deuxièmement, en augmentant la concentration de l’agent mouillant. Les espèces végétales qui ont des surfaces foliaires très hydrophobes, comme le riz^12,13, peuvent nécessiter des concentrations plus élevées de l’agent mouillant.

De plus, nous avons décrit une méthode non invasive pour collecter l’ARN de surface des feuilles à l’aide d’écouvillons à bout de coton. Avec cette méthode d’isolement de l’ARN à la surface des feuilles, nous veillons à ce que le tube de prélèvement soit placé dans un seau à glace. Étant donné que l’ARN à la surface de la feuille est sécrété et s’accumule à température ambiante, nous supposons qu’il resterait stable même pendant le processus de collecte. Nous avons également comparé les modèles de bandes de l’ARN LSW et LSS, et ils ne montrent pas beaucoup de différence en termes de dégradation.

Le protocole ci-dessus utilise le réactif TRIzol pour purifier l’ARN de LSW, LSS ou AWF. Ce réactif utilise du phénol pour éliminer les protéines. Nous avons cependant constaté que la purification à base de TRIzol n’élimine pas les polysaccharides tels que la pectine, qui sont abondants dans le LSW et l’AWF⁶. De telles molécules copurifiantes peuvent causer des problèmes de quantification de l’ARN à l’aide de la spectrophotométrie ou de la fluorométrie. Nous nous appuyons donc sur l’analyse densitométrique basée sur le gel d’ARN pour évaluer les concentrations d’exARN. Nous étudions actuellement des méthodes de purification en colonne qui devraient permettre une meilleure séparation de l’ARN des polysaccharides. Cependant, ces méthodes limitent souvent la récupération de petits ARN car la membrane de silice est optimisée pour lier les molécules d’ARN de plus de ~200 nucléotides. Les petits ARN peuvent traverser la membrane pendant la liaison ou être perdus dans les étapes de lavage. Par conséquent, jusqu’à présent, nous ne nous appuyons que sur la méthode basée sur TRIzol pour une récupération plus complète de toutes les tailles d’ARN, y compris les petits ARN, bien qu’elle nécessite une manipulation soigneuse et une séparation de phase.

De plus, lors de l’analyse de gel d’ARN, nous ne voyons pas de fragments inférieurs à 80 nt pour les échantillons d’ARN cellulaire totaux par rapport aux ARN AWF et LSW, principalement en raison de la faible abondance par rapport aux grandes quantités d’ARNr et d’ARNt. La présence de bandes plus petites dans l’AWF et le LSW est due à la dégradation de l’abondance des ARNr et des ARNt, qui se produit naturellement après la sécrétion d’ARN dans le compartiment extracellulaire des plantes, et il ne s’agit pas d’un artefact introduit lors de la collecte et de la manipulation des plantes, comme le confirment le séquençage et l’analyse par transfert de Northern⁶.

Notre méthode d’isolation par lavage de la surface des feuilles est un outil polyvalent avec un potentiel important pour un large éventail d’applications de recherche. Il devrait permettre d’isoler des biomolécules de la surface des feuilles, telles que l’ARN, les protéines et d’autres métabolites qui peuvent être essentiels pour comprendre les interactions entre les plantes et les microbes. Si l’identification des microbes présents dans l’AWF et le LSW est souhaitée, cela peut être accompli en éliminant la filtration à travers le filtre de 0,22 μm.

Les plantes interagissent avec un large éventail de microbes, y compris des bactéries, des champignons et des virus, qui forment des communautés complexes à leur surface¹. Ces communautés microbiennes peuvent avoir des effets profonds sur la croissance des plantes, la résistance aux maladies et l’acquisition de nutriments ^2,3,4. En isolant et en analysant le lavage de la surface des feuilles à l’aide de cette méthode, les chercheurs peuvent isoler les exARN, les métabolites microbiens, identifier les communautés microbiennes présentes à la surface des feuilles et étudier comment ces communautés sont régulées au niveau moléculaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
14-30 nt marqueur d’échelle ssRNA	Takara	3416
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	VWR	20170-038
Seringue sans aiguille de 10 ml	BD	303347
Tubes Falcon de 15 mL	VWR	89039-668
15 % Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 10 puits/12 puits, 30 & micro ; L/20 et micro ; L	Bio-Rad	4566053 / 4566055
Inserts de plateau à 36 cellules	Marché des vraies feuilles
solution d’acrylamide à 40 % et de bis-acrylamide, 37,5:1	Bio-Rad	1610148
Pots ronds de 4 pouces	Marché des vraies feuilles
Tubes Falcon de 50 mL	VWR	89039-656
Seringue sans aiguille de 50 ml	BD	309653
Plaque à 96 puits fond noir	Grenier	655090
Acrodisc 0,22 &mu ; Filtre à seringue M	Drap mortuaire	4192
Acrodisque 0,45 &mu ; Filtre à seringue M	Drap mortuaire	4454
Persulfate d’ammonium (APS)  ;	Sigma-Aldrich	A3678
Chlorure de calcium  ;	Sigma-Aldrich	Réf. C1016
Chloroforme (sans RNase)	Macron Chimie fine	MK444110
Dômes en plastique transparent	Hummert International	11 3348	N’importe quel dôme en plastique peut être utilisé pour couvrir les plantes et maintenir l’humidité
Bâton à embout de coton de qualité médicale	Uline	Réf. S-21102
Éthanol (sans Rnase)	Decon Laboratories, Inc.	2716GEA
Cafetière à piston, 24 fl oz	Pic de neige	Le CS-111
Plateau de culture sans trous 10 x 20	Marché des vraies feuilles
Seau à glace  ;	Schuett-Biotech, Spongex	3-680 052
Isopropanol	Thermo Scientific	149320050
Rotor à angle fixe JA-14	Beckman Coulter ; modèle : JA-14	339247
Lingettes Kimwipes	KCWW, Kimberly-Clark	34120
Basse gamme ssRNA lader	ONÉ	N° N0364S
MES hydrater	Sigma-Aldrich	Référence M8250
Lecteur de microplaques	BioTek	; Synergie H1
Miracle-Gro	Miracle-Gro	24-8-16	C’est un aliment végétal tout usage. En fonction de la source de sol utilisée pour faire pousser les plantes, l’application peut être ajustée.
Flacon centifuge Nalgene 250 mL (sans bouchon)	Nalgene	3120
Essuie-tout
ParaFilm  ; M Lab Film	Parafilm	Réf. S-25929
Bécher en plastique (500 mL)	Uline	Réf. S-21658
Glycogène sans RNase (20 mg/mL)	Thermo Scientific	Réf. R0561
Fongicide biologique RootShield Plus WP	BioWorks	68539-9
Ciseaux
Silwet L-77	Les labs Phytotech	S7777	N’importe quelle marque Silwet L-77 peut être utilisée. Cependant, Silwet perd de son efficacité au fil du temps. L’idéal est de le remplacer une fois par an.
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	Réf. S7653
Pinceau en nylon doux pour cheveux	NOUS. Approvisionnement artistique	N° 6
Vaporisateur	Uline	Réf. S-7272	N’importe quel flacon pulvérisateur peut être utilisé, mais les réglages de jet doivent être sur la douche.
Mélange de culture Sungro Professional	Sungro
Mélange de propagation Sungro	Sungro
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (concentré 10 000x dans DMSO)	Thermo Scientific	S11494
TEMED	Thermo Scientific	17919
Réactif TRIzol	Invitrogen	15596026
Eau ultrapure sans Dnase/Rnase	Invitrogen	10977015
Urée	Sigma-Aldrich	Référence U5378
Chambre à vide, 0,20 pi³	SP Scienceware - Produits Bel-Art - H-B Instrument	Référence F42031-0000
Pompe à vide, 3,5 CFM	Produits sous vide idéaux	P101532
Balance	Escali	WBB480535	Ce n’est qu’un exemple. N’importe quelle balance peut être utilisée.