Article de méthode

Ex vivo Analyse d’une molécule unique de l’assemblage du récepteur 2 de la ryanodine dans les tissus cardiaques et neuronaux

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DOI :

10.3791/68408

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15 juillet 2025

 , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente une méthode d’imagerie à molécule unique basée sur des vésicules qui préserve l’organisation des récepteurs natifs, permettant une quantification précise de la stœchiométrie et de vastes applications dans l’assemblage, la fonction et la recherche sur les maladies des récepteurs.

Résumé

La compréhension de l’assemblage des récepteurs est essentielle pour élucider les mécanismes sous-jacents à leur fonction et à leur régulation dans les processus physiologiques. Alors que les études in vitro traditionnelles sur des molécules uniques reposent sur l’isolement de protéines à partir de systèmes d’expression hétérologues, elles ne parviennent souvent pas à saisir la complexité physiologique in vivo impliquée dans l’organisation et l’assemblage des protéines de surface cellulaire. Ce protocole utilise la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM) pour étudier les molécules du récepteur 2 de la ryanodine (RyR2) marquées à la GFP encapsulées dans des vésicules à l’échelle nanométrique. Ces vésicules, générées à partir d’organes rapidement extraits de l’animal, fournissent efficacement un instantané de l’état d’assemblage du récepteur au moment de l’extraction, permettant une analyse détaillée de la stœchiométrie sous-unitaire et de l’organisation du récepteur en réponse aux changements de l’environnement physiologique de l’animal. Cette approche utilise le TIRFM et l’analyse par photoblanchiment par étapes pour fournir une lecture de la stœchiométrie des récepteurs. L’imagerie des récepteurs au niveau de la molécule unique facilite la détection de l’hétérogénéité au sein des populations de récepteurs assemblés chez un animal vivant et permet de surveiller les changements d’assemblage associés aux états pathologiques. Par conséquent, cette méthode offre un outil puissant pour déterminer la distribution des assemblages de récepteurs et leur corrélation avec les changements de leur environnement physiologique.

Introduction

Les récepteurs membranaires jouent un rôle crucial dans les processus physiologiques tout au long du corps humain1. L’une des fonctions principales est d’assurer la communication entre les cellules par le transfert de stimuli extracellulaires pour initier des événements de signalisation intracellulaire. En raison de leur rôle fondamental dans la signalisation, près de 70 % des thérapies existantes ciblent les récepteurs membranaires2. Il s’agit souvent de structures oligomères composées de multiples sous-unités assemblées en formes hétéromères avec de multiples stœchiométries 3,4. Comprendre comment les récepteurs s’organisent en complexes fonctionnels est essentiel pour élucider leurs rôles dans la santé et la maladie 5,6. Les méthodes biochimiques traditionnelles, telles que l’immunoprécipitation et le western blot, fournissent des mesures d’ensemble moyennées, ce qui masque l’hétérogénéité des sous-populations de récepteurs7. En revanche, les techniques à molécule unique permettent l’observation directe de récepteurs individuels, ce qui permet de quantifier l’hétérogénéité au sein des populations de récepteurs 8,9,10. Les techniques à molécule unique sont devenues la norme pour quantifier l’assemblage des récepteurs membranaires, la stœchiométrie et l’oligomérisation11,12. Cette approche a été largement appliquée à de nombreux récepteurs membranaires physiologiquement pertinents en utilisant des protéines isolées ou des conditions de culture cellulaire. Les études sur les molécules uniques reposent principalement sur des systèmes d’expression in vitro, où les protéines peuvent être isolées d’un environnement cellulaire. Cependant, la complexité d’un système vivant n’est pas entièrement reflétée dans ces types de systèmes d’expression hétérologues.

Pour surmonter ces limitations, nous avons développé une approche qui isole et image les récepteurs membranaires dans un état physiologiquement pertinent en les capturant dans des nanovésicules dérivées directement des tissus cardiaques et neuronaux. Cette méthode préserve efficacement l’état d’assemblage du récepteur au moment de la formation des vésicules, permettant la visualisation directe de la stœchiométrie des sous-unités du récepteur, qui est un indicateur pivot de la réponse du récepteur dans différents environnements physiologiques. Cette approche nous permet d’examiner l’assemblage stœchiométrique des récepteurs membranaires qui se produisent avec l’environnement biologique complexe chez les animaux vivants sans nécessiter d’expression ou de reconstitution hétérologue. En utilisant la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM), nous réalisons une imagerie à résolution moléculaire unique des récepteurs encapsulés dans des vésicules et extrayons des traces de photoblanchiment pour déterminer la composition des sous-unités.

TIRFM est bien adapté à l’imagerie des protéines membranaires à molécule unique car il excite sélectivement les fluorophores à ~150 nm de la surface du verre, réduisant ainsi la fluorescence de fond des molécules dans la solution 3,10. Ce confinement améliore considérablement le rapport signal/bruit, permettant une détection précise des complexes de récepteurs membranaires individuels. En analysant le photoblanchiment par étapes des récepteurs marqués par fluorescence, nous pouvons déterminer directement la stœchiométrie sous-unitaire et évaluer l’hétérogénéité potentielle au sein des populations de récepteurs12. Ceci est particulièrement pertinent pour le récepteur 2 de la ryanodine (RyR2), un grand canal de libération intracellulaire de Ca²⁺ qui joue un rôle crucial dans le couplage excitation-contraction dans le cœur, où il ne s’assemble que sous forme d’homo-tétramère, et dans la fonction synaptique dans le cerveau, où son assemblage n’a pas été établi 1,13,14. Étant donné la présence de plusieurs isoformes de RyR dans les tissus neuronaux, il n’est pas clair si RyR2 forme des complexes tétramères purement homomères dans le cerveau, constitués de quatre sous-unités identiques à celles du cœur, ou si des assemblages hétéromériques avec RyR1 ou RyR3 se produisent in vivo 15,16,17,18.

En isolant les vésicules de régions spécifiques du cœur et du cerveau, cette méthode permet d’étudier les différences tissulaires potentielles spécifiques dans l’organisation de RyR2. Nous tirons parti des propriétés de RyR2 dans le tissu cardiaque où il ne peut former que des homotétramères pour fournir une base statistiquement robuste pour la stœchiométrie ex vivo de sous-unités à molécule unique, et l’assemblage connu des tétramères sert de contrôle pour l’étude d’assemblages inconnus dans d’autres organes. La capacité d’imager les récepteurs dans leur état natif tout en préservant leurs interactions physiologiques fournit un cadre solide pour étudier l’assemblage des récepteurs dans différents organes et dans différentes conditions physiologiques. Ce protocole décrit le flux de travail pour l’isolement des vésicules, l’immobilisation et l’imagerie monomoléculaire de RyR2 marqué à la GFP, permettant une caractérisation précise de la stœchiométrie du récepteur. Cette technique permet non seulement de faire progresser notre compréhension de l’organisation de RyR2 dans les tissus cardiaques et neuronaux, mais offre également des applications plus larges pour l’étude de l’assemblage et de la régulation des récepteurs dans divers contextes physiologiques et pathologiques.

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Protocole

1. Préparation de l’échantillon

  1. Perfusion transcardique et extraction d’organes
    1. Anesthésier la souris à l’aide de CO₂ jusqu’à ce que la respiration cesse.
    2. Positionnez la souris en position couchée et sécurisez les membres.
    3. Faites une incision médiane le long de l’abdomen et étendez-la latéralement vers la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique.
    4. Insérez soigneusement une aiguille dans le ventricule gauche et transectez l’oreillette droite pour permettre le drainage perfusé.
    5. Pour la préparation des vésicules, perfuser avec du froid 1x PBS jusqu’à ce que le système circulatoire soit débarrassé du sang.
    6. Pour la cryosection, après la perfusion de PBS, continuer à perfuser avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pour fixer les tissus.
    7. Extrayez soigneusement le cœur et placez-le immédiatement sur de la glace.
    8. À l’aide de ciseaux fins, coupez soigneusement le long de la ligne médiane du cuir chevelu et retirez la peau pour exposer le crâne.
    9. Faites une incision à la base du crâne près du foramen magnum.
    10. À l’aide d’une pince fine, ouvrez soigneusement le crâne le long de la fissure longitudinale, en retirant les fragments d’os pour exposer le cerveau.
    11. Soulevez doucement le cerveau à l’aide d’une pince incurvée, en sectionnant les nerfs crâniens pour l’extraire complètement intact.
    12. En cas d’utilisation pour la cryosection, post-fixer le cerveau dans 4 % de PFA à 4 °C pendant 24 h.
    13. S’il est utilisé pour la préparation de vésicules, placez immédiatement le cerveau sur de la glace sans fixation pour un traitement ultérieur.
  2. Cryosectionnement
    1. Retirez le cerveau ou le cœur de 4 % de PFA et séchez-le.
    2. Intégrez l’organe entier dans le composé OCT dans un cryomoule.
    3. Congelez le tissu incrusté en plaçant le moule dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit complètement solidifié.
    4. Avant la section, équilibrez la chambre du cryostat et la tête de l’échantillon à -20 °C.
    5. Transférez le bloc OCT congelé du congélateur à -80 °C vers la chambre du cryostat et laissez-le s’équilibrer pendant 10 min.
    6. Nettoyez le mandrin avec de l’éthanol à 70 %, séchez-le et appliquez une fine couche d’OCT comme adhésif.
    7. Fixez le bloc OCT gelé sur le mandrin en veillant à ce qu’il soit correctement orienté.
    8. Insérez le mandrin dans le porte-échantillon du cryostat et ajustez la position de la lame.
    9. Coupez l’excès d’OCT jusqu’à ce que la surface du tissu soit exposée.
    10. Sectionnez le tissu à 10 μm d’épaisseur, en recueillant des sections sur des lames de verre.
    11. Après avoir fait sécher les sections à l’air libre à température ambiante pendant 1 h, appliquez un média de montage sur les sections et placez une lamelle pour sceller l’échantillon.
    12. Laissez le support de montage prendre avant de stocker les lames à 4 °C pour l’imagerie.
  3. Préparation des vésicules
    1. Préparation des vésicules cardiaques
      1. Extrayez le cœur après la perfusion transcardique avec 1x PBS et placez-le sur de la glace.
      2. À l’aide d’un scalpel stérile, disséquez environ 30 mg de muscle ventriculaire à partir du bas du cœur.
      3. Transférez le tissu dans un tube à centrifuger contenant 4 à 5 mL de 10 mM de NaHCO₃ avec 5 mM de NaN₃ pour maintenir l’intégrité de la vésicule.
      4. Homogénéiser le tissu à l’aide d’un homogénéisateur jusqu’à ce qu’il soit complètement lysé.
      5. Centrifuger l’homogénat à 10 000 × g pendant 20 min pour éliminer les gros débris et recueillir le surnageant.
      6. Effectuer une ultracentrifugation à 37 000 × g pendant 65 min, puis jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 3 à 4 mL de tampon tris-maléate de 20 mM (pH 6,8) avec 0,6 M de KCl.
      7. Répétez l’ultracentrifugation à 37 000 × g pendant 65 minutes supplémentaires pour éliminer l’actomyosine solubilisée.
      8. Remettre en suspension la pastille finale dans 0,5 mL de tampon tris-maléate de 20 mM (pH 6,8) avec 50 mM de KCl pour obtenir la solution de vésicule cardiaque et la conserver à -80 °C.
    2. Préparation des vésicules cérébrales
      1. Extrayez le cerveau suite à une perfusion transcardique avec 1x PBS et placez-le sur de la glace.
      2. Coupez le cerveau en sections de 1 mm à l’aide d’une matrice coronaire de cerveau de souris de 1 mm.
      3. Identifiez les troisième et quatrième sections du bulbe olfactif et disséquez soigneusement : 1) la couche corticale la plus externe des deux hémisphères ; 2) l’hippocampe, situé dans la région centrale de la section.
      4. À partir de l’extrémité postérieure, isolez le cervelet en faisant une coupe transversale à sa base.
      5. Regroupez les mêmes régions cérébrales de cinq souris pour assurer un rendement adéquat des vésicules.
      6. Homogénéiser immédiatement le tissu à l’aide d’un homogénéisateur Dounce dans 2 mL de tampon d’homogénéisation à froid (0,32 M de saccharose, 10 mM d’HEPES, 2 mM d’EDTA, inhibiteur de protéase, pH 7,4).
      7. Ajouter 3 ml de tampon d’homogénéisation supplémentaire et centrifuger à 200 × g pendant 15 minutes pour éliminer les gros fragments de tissu.
      8. Prélever le surnageant et centrifuger à 1 000 × g pendant 15 min à 4 °C pour éliminer la fraction nucléaire.
      9. Centrifuger davantage le surnageant à 10 000 × g pendant 20 min à 4 °C pour éliminer les mitochondries.
      10. Ultracentrifuger le surnageant résultant à 100 000 × g pendant 2 h à 4 °C pour granuler les vésicules.
      11. Remettez en suspension la dernière pastille vésicule dans 1x PBS pour obtenir la solution de vésicule cérébrale et stockez-la à -80 °C.
  4. Caractérisation des nanovésicules par analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
    1. Assemblez la cellule de détection en suivant les instructions du fabricant.
    2. Allumez l’instrument et lancez le logiciel compatible.
    3. Chargez une seringue de 1 mL avec de l’eau déminéralisée (DI) et rincez manuellement la tubulure du système jusqu’à ce que l’arrière-plan soit exempt de contaminants.
    4. Préparez l’échantillon de nanovésicules en le diluant dans 1x PBS.
    5. Chargez ~1 mL de l’échantillon de nanovésicule dilué dans une seringue propre de 1 mL, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.
    6. Injectez manuellement l’échantillon dans la cellule de détection et ajustez la mise au point jusqu’à ce que les vésicules soient clairement visibles.
    7. Fixez la seringue sur le tire-seringue et réglez le débit à 200 μL/s dans le panneau matériel.
    8. Dans le panneau SOP , réglez la durée de mesure sur 60 s, le nombre de cycles sur 5, et vérifiez que le contrôle de la température est activé et réglé sur 25 °C. Enregistrez les paramètres en tant que nouvelle POS en cliquant sur Enregistrer la POS et en nommant le fichier de manière appropriée (par exemple, « nanovesicle_standard.sop »).
    9. Dans le panneau Acquisition, configurez les paramètres de l’instrument en sélectionnant un niveau de caméra de 13 et un seuil de détection initial de 3.
    10. Cliquez sur Exécuter et sélectionnez la POS précédemment enregistrée. Le logiciel effectuera automatiquement la mesure en fonction des paramètres.
    11. Une fois terminé, cliquez sur Analyser pour traiter chaque vidéo. Ajustez le seuil de détection pour vous assurer que toutes les particules sont clairement visibles, puis cliquez sur Terminer une fois l’analyse par lots terminée. Exportez le résultat en cliquant sur Exporter les données | Toutes les mesures, et enregistrez-les sous forme de fichier CSV pour une utilisation ultérieure.
    12. Une fois l’expérience terminée, rincez le système avec ~ 2 mL d’eau DI jusqu’à ce qu’il ne reste plus de vésicules résiduelles.
    13. Injectez de l’air à travers le tube pour éliminer tout liquide restant, en vous assurant que le système est sec pour la prochaine utilisation.

2. Imagerie

  1. Imagerie confocale des cryosections tissulaires
    1. Allumez le microscope confocal à balayage laser et ouvrez le logiciel associé.
    2. Sélectionnez l’objectif approprié (20x air ou 60x huile) et chargez la lame de cryosection préparée sur la platine du microscope.
    3. Configurez les paramètres laser pour l’excitation GFP à l’aide d’une ligne laser de 488 nm avec un filtre d’émission de 535/70 nm.
    4. Optimisez les paramètres d’imagerie, y compris la taille du sténopé (28,9 μm), l’intensité laser (17 %) et le gain du détecteur (15,3), afin d’améliorer le rapport signal/bruit tout en minimisant le photoblanchiment.
    5. Si nécessaire, acquérez une pile Z en réglant les plans focaux supérieur et inférieur et en définissant la taille de pas appropriée (0,275 μm).
    6. Activez l’assemblage automatique des images avec un chevauchement d’image de 15 % lors de l’acquisition d’images de grande surface.
    7. Ajustez la résolution de l’image et appliquez la moyenne d’image si nécessaire pour réduire le bruit de fond.
    8. Capturez des images et enregistrez-les au format « .nd2 » pour une analyse plus approfondie.
  2. Imagerie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)
    1. Immobilisation vésiculaire par ancrage biocompatible pour membrane (BAM)méthode 22
      1. Nettoyez la vaisselle à fond de verre de 35 mm en la sonisant dans 5 M NaOH pendant 1 h à 45 °C, suivie de trois rinçages approfondis à l’eau DI.
      2. Sonicer la vaisselle dans 0,1 M HCl pendant 1 h supplémentaire à 45 °C, suivie de trois rinçages supplémentaires à l’eau DI.
      3. Traitez la surface en verre nettoyée avec 2 % de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) dans de l’éthanol pendant 30 minutes à température ambiante pour introduire des groupes fonctionnels amines.
      4. Rincez le plat 3 fois avec de l’eau DI et de l’éthanol pour éliminer l’excès d’APTES et laissez-le sécher.
      5. Incuber la parabole avec 100 μM Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) en 1x PBS pendant 10 min.
      6. Lavez le plat avec du PBS pour éliminer le réactif qui n’a pas réagi.
      7. Introduire les vésicules à la concentration souhaitée et incuber pendant 15 min pour permettre la liaison des vésicules.
      8. Rincez doucement le plat avec du PBS pour éliminer les vésicules non liées tout en vous assurant que les vésicules immobilisées restent attachées.
    2. Configuration et acquisition de l’imagerie TIRF
      1. Allumez le microscope à fluorescence inversée, la source laser 488 nm et la caméra EMCCD.
      2. Lancez les logiciels Metamorph et CellSens pour initialiser le contrôle d’imagerie.
      3. Nettoyez l’objectif à immersion dans l’huile 60x (1,49 NA APO) avec du méthanol pour éliminer la poussière et l’huile résiduelle.
      4. Appliquez une petite goutte d’huile d’immersion correspondant à l’indice de réfraction (IR) sur la lentille de l’objectif.
      5. Placez la boîte à vésicules préparée sur la platine du microscope, en vous assurant qu’elle est centrée pour un alignement optimal.
      6. Ajustez la focalisation du faisceau laser en centrant le faisceau d’excitation au milieu de l’ouverture arrière de l’objectif en mode épifluorescence.
      7. Utilisez le moteur pas à pas pour ajuster l’angle d’incidence du laser jusqu’à ce que l’angle critique soit atteint, assurant ainsi une réflexion interne totale à la surface du verre.
      8. Identifiez le plan focal en balayant l’axe Z, en distinguant : 1) le premier plan de mise au point, correspondant à la surface du fond en verre ; 2) le deuxième plan de mise au point, correspondant à la surface immobilisée par la vésicule.
      9. Une fois que les vésicules sont nettes, appliquez la mise au point automatique dans CellSens pour verrouiller la position de l’objectif sur ce plan, empêchant ainsi la dérive pendant l’imagerie.
      10. Éteignez temporairement le laser et déplacez la platine du microscope vers un nouveau champ de vision qui n’a pas encore été exposé à la lumière d’excitation.
      11. Démarrez l’enregistrement tout en allumant simultanément le laser, ce qui garantit la capture de l’ensemble du processus de photoblanchiment sans exposition préalable.
      12. Acquisition d’images avec les paramètres suivants : Temps d’exposition : 100 ms par image, Mode d’acquisition : 900 images continues par champ de vision, Réglage du gain : 1 400.
      13. Répétez le processus pour plusieurs champs de vision afin d’assurer une collecte de données suffisante.
      14. Enregistrez les piles d’images au format TIFF pour un traitement ultérieur.

3. Traitement d’images et analyse de données

  1. Traitement d’image confocal
    1. Ouvrez les images confocales acquises dans le logiciel lié.
    2. Ajustez les paramètres de la table de correspondance (LUT) pour optimiser la luminosité et le contraste.
    3. Appliquez les mêmes réglages de LUT uniformément sur toutes les images pour maintenir la cohérence visuelle.
  2. Traitement vidéo TIRF et analyse de l’intensité de fluorescence
    1. Traitement vidéo pour la visualisation
      1. Ouvrez les piles d’images TIRF acquises (format TIFF) dans ImageJ pour les visualiser.
      2. Ajustez la luminosité et le contraste pour améliorer la clarté du signal, en veillant à ce que les vésicules fluorescentes soient facilement distinguables de l’arrière-plan.
      3. Exportez des images ajustées pour une présentation ou une analyse qualitative plus approfondie.
    2. Analyse des étapes de photoblanchiment
      1. Extraction de traces temporelles
        1. Ouvrez le script MATLAB (voir Fichier supplémentaire 1) nommé « getTimeTraces.m » et exécutez-le. Dans l’interface utilisateur graphique (GUI), cliquez sur Charger le film et sélectionnez le fichier .tiff d’imagerie TIRF pour importer la pile de films vésiculaires.
        2. Cliquez sur Trouver des pics pour identifier automatiquement les signaux de fluorescence d’une molécule unique. Les régions du signal seront marquées par des cercles dans la fenêtre d’aperçu.
        3. Cliquez sur Remplir les données. Cela permet d’exporter la trace d’intensité temporelle de chaque point dans un fichier .xlsx pour l’analyse en aval.
      2. Comptage manuel des pas
        1. Exécutez le script « simpleGraph.m » (voir Fichier supplémentaire 1) pour lancer l’interface graphique, cliquez sur Charger les fichiers de données et sélectionnez le fichier .xlsx généré à l’étape 3.2.2.1.3.
        2. Inspectez les étapes de blanchiment de chaque trace temporelle affichée dans le panneau de gauche. S’assurer que seules les traces répondant aux critères suivants sont acceptées pour l’analyse : 1) la trace temporelle contient au moins une étape de blanchiment distincte. 2) La durée d’un pas est d’au moins 1 s. 3) La différence d’intensité entre les niveaux de pas est d’au moins 3 fois l’écart-type de l’intensité post-blanchiment.
        3. Sur la droite, localisez le champ Étape # et utilisez les boutons + ou - pour saisir le nombre d’étapes de photoblanchiment pour chaque trace.
        4. Après avoir terminé chaque entrée, cliquez sur Suivant pour passer à la trace suivante. Une fois toutes les traces traitées, le logiciel génère et enregistre automatiquement un fichier .txt enregistrant le nombre de pas de chaque trace.
      3. Résumé du nombre d’étapes
        1. Exécutez le script « CombinedFiles.m » (voir Fichier supplémentaire 1) pour ouvrir l’interface graphique.
        2. Entrez le nom souhaité pour la sortie récapitulative dans la zone de texte.
        3. Cliquez sur Combiner plusieurs résultats simpleGraph dans un seul fichier. Dans l’explorateur de fichiers, sélectionnez un ou plusieurs fichiers .txt souhaités générés à partir de l’étape 3.2.2.2.3. Le script compile automatiquement toutes les données de comptage d’étapes et génère un fichier .xlsx combiné résumant la fréquence de 1 étape et 2 étapes,... Traces.

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Résultats

Pour confirmer l’applicabilité de cette méthode, nous avons d’abord vérifié l’expression et la localisation de GFP-RyR2 par imagerie confocale de cryosections de tissus cardiaques et neuronaux (Figure 1). Le signal de fluorescence dans le tissu cardiaque a montré un motif strié transversal compatible avec la localisation attendue de RyR2 dans les cardiomyocytes, mais a montré une intensité élevée dans certaines régions du cerveau, à savoir le cortex, l’hippoc...

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Discussion

Cette étude établit un protocole détaillé et reproductible pour l’encapsulation ex vivo et l’imagerie monomoléculaire des récepteurs membranaires en utilisant RyR2 marqué GFP comme système modèle. Le protocole fait progresser considérablement les méthodes actuelles en permettant l’analyse stœchiométrique des complexes récepteurs directement à partir du tissu natif, préservant ainsi le contexte physiologique des protéines membranaires. Par rapport aux systèmes d’expression in vit...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le noyau de microscopie optique UKY et le Centre de bioélectronique et de nanomédecine pour l’utilisation de leurs installations. Ce travail a été soutenu par les NIH (GM138837 et GM138882). La figure 2 (https://BioRender.com/s69w811) et la figure 3 (https://BioRender.com/y54b47) ont été créées dans BioRender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plat de 35 mm | N° 1.5 Recouvrement | Verre de 14 mm de diamètreMattekP35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  ; Tissue-Tek Cryomold Moules/Adaptateurs FisherScientificNC9542860
APTESMillipore Sigma440140-100ML(3-Aminopropyl)triethoxysilane
Bio-Gen PRO200 Homogénéisateur de laboratoirePro Scientific1204B59
cellSENSOlympus Scientific Solutionsn/a
EMCCD caméraAndorn/aiXon Ultra 897
Éthanol absolu &ge ; 100 % (v/v) USP pour la biologie moléculaire (200 preuves)VWR71006-012
Leica CM1860Leican/acryostat
MetaMorph AdvancedMolecular Devicesn/a
Nanosight NS300 (avec logiciel Nanosight NTA)Malvern Panalyticaln/a
Nikon AXR Microscope confocal inverséNikonn/a
Olympus IX83 Microscope à fluorescence inversée autofocus motoriséOlympusn/aTIRFM
Paraformaldéhyde 4 % dans PBS réactif fixateur prêt à l’emploiVWR76221-378
Saline tamponnée au phosphate (PBS) 20x, Ultra Pure GradeVWR97062-950
Hydroxyde de sodium, billes, Réactif GradeVWR97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +NOF America Corporationn/aOleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakuraM71484
VectaMount AQ Montage aqueuxMedium Vector LaboratoriesH-5501-60

Références

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  3. Levitz, J., et al. Mechanism of assembly and cooperativity of homomeric and heteromeric metabotropic glutamate receptors. Neuron. 92 (1), 143-159 (2016).
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