Ce protocole décrit la méthode CTAB pour extraire de l’ADN de haute qualité des mycobactéries, surmontant les défis posés par leurs parois cellulaires solides et riches en acide mycolique. Le processus implique la digestion enzymatique, la lyse cellulaire avec CTAB, et la purification de l’ADN par extraction organique et précipitation d’éthanol. Cette méthode produit de l’ADN adapté à des études moléculaires et fiable pour la recherche sur les mycobactériens.
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Article de méthode
Extraction d’acides désoxyribonucléiques par génome entier à partir d’espèces de Mycobacterium via la technique du bromure de cétyltriméthylammonium
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une extraction efficace et fiable de l’ADN est une étape fondamentale en biologie moléculaire, fournissant un matériel génétique de haute qualité pour des applications ultérieures telles que la PCR, le séquençage et les analyses génomiques. Cependant, la composition unique de la paroi cellulaire des mycobactéries, riches en lipides et en acides mycoliques, pose d’importants défis pour une isolation efficace de l’ADN. La méthode du bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) est largement utilisée en raison de son efficacité pour extraire l’ADN de haute pureté d’espèces mycobactériennes, y compris des souches à croissance rapide et lente. La technique consiste à perturber enzymatiquement les cellules bactériennes à l’aide de la lysozyme et de la protéinase K, suivie de la lyse des composants cellulaires à l’aide de la CTAB, qui se lie sélectivement et forme un complexe avec des polysaccharides et des protéines. La purification et la concentration de l’ADN sont réalisées par extraction par solvant organique et précipitation à l’éthanol. Selon nos données, le protocole CTAB produit de grandes quantités d’ADN (200 - 1000 ng/μL) avec une contamination de haute qualité et minimale, comme l’ont prouvé l’électrophorèse sur gel et l’analyse NanoDrop. L’ADN extrait de différentes espèces mycobactériennes est de haute pureté et convient à diverses études moléculaires. Cette étude démontre les étapes procédurales de la méthode CTAB, soulignant son utilité pour surmonter les défis uniques liés à l’extraction d’ADN mycobactérien.
Introduction
L’extraction d’ADN de haute qualité est une étape fondamentale en biologie moléculaire, essentielle pour des applications ultérieures telles que la PCR, le séquençage du génome entier et d’autres études génomiques. Pour Mycobacterium, un genre qui comprend à la fois des espèces pathogènes, telles que Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), et des espèces environnementales non pathogènes comme Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), l’extraction d’ADN peut être difficile en raison de leurs parois cellulaires épaisses, riches en lipides ethydrophobes 1,2,3. Cette paroi cellulaire dure nécessite l’utilisation de méthodes de lyse spécialisées pour perturber les cellules et libérer efficacement l’ADN génomique.
La méthode du bromure de cétyltriméthammonium (CTAB) s’est avérée fiable pour isoler de l’ADN de haute qualité provenant de diverses espècesmycobactériennes 4,5. Le CTAB, un tensioactif cationique, se lie aux polysaccharides et autres composants cellulaires, facilitant leur élimination lors du processusd’extraction 6. Même avec des échantillons difficiles, le protocole basé sur le CTAB assure l’isolation efficace de l’ADN intact et pur, en particulier lorsqu’il est combiné à la lyse enzymatique, au traitement thermique et à l’extraction par solvantorganique 7,8. La méthode CTAB a joué un rôle crucial dans l’extraction efficace de l’ADN d’espèces mycobactériennes, notamment pour la recherche impliquant le séquençage du génome entier, la métagénomique et le diagnostic moléculaire, qui nécessitent un matériau d’entrée d’ADN pur et de hautequalité 9,10. Comparé à d’autres techniques d’extraction d’ADN telles que le battage de perles ou les kits commerciaux, le protocole CTAB présenté ici offre un avantage distinct dans la préservation de l’intégrité de l’ADN, un facteur essentiel pour le séquençage à longue lecture et les applications épigénétiques. Bien que des études antérieures aient rapporté des rendements d’ADN plus faibles avec le CTAB par rapport aux méthodes de perturbation mécanique, elles soulignent également sa capacité à minimiser le cisaillement de l’ADN et à maintenir l’intégritéde l’ADN 11,12. Pour répondre aux limites de pureté et de rendement, le protocole actuel a été optimisé avec des temps d’incubation réduits et une meilleure cohérence entre différents types d’échantillons. Cet affinement a été soutenu par les résultats d’Opperman et al., qui ont démontré que l’ADN extrait par CTAB à partir de cultures de Mycobacterium avium était suffisamment concentré et de qualité pour des applications en aval telles que le séquençage du 16S rRNA et les tests par sonde de ligne, soutenant ainsi l’application du protocole CTAB comme outil polyvalent et évolutif pour la recherche sur les mycobactériens, en particulier dans les études nécessitant un ADN génomique intact pour des analyses moléculairesavancées 13. De plus, le séquençage de nouvelle génération (NGS) nécessite généralement entre 100 et 1000 ng d’ADNgénomique de haute qualité 14 et, dans le cas du séquençage à longue lecture, comme le séquençage PacBio, nécessite ≥5 μg d’ADN15 de haute qualité, donc lorsque de grandes quantités d’ADN de haute qualité et intact sont requises, le CTAB reste une méthodeefficace 16.
Établir des méthodologies d’extraction d’ADN efficaces, cohérentes et efficaces à partir de microbes difficiles à lyser est nécessaire pour garantir la reproductibilité et la fiabilité dans les laboratoires, en particulier pour l’identification des souches et les étudesépidémiologiques 5,7. Ce protocole fournit des détails pour extraire l’ADN du génome complet des mycobactéries en utilisant la méthode CTAB. Le protocole actuel vise à permettre aux chercheurs d’obtenir des résultats cohérents et fiables dans leurs flux de travail en biologie moléculaire en abordant les pièges et en surmontant les défis posés par la distinctive paroi cellulairemycobactérienne 17.
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Protocole
Les résultats représentatifs ont été obtenus avec l’approbation du comité d’éthique REC : BES de l’Université de Stellenbosch (BES-2024-22504). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Préparation de la suspension en culture mycobactérienne
REMARQUE : Selon l’espèce examinée, cette étape doit être réalisée soit dans un laboratoire de biosécurité niveau 2 (BSL-2), soit dans un laboratoire de biosécurité niveau 3 (BSL-3). Le temps d’incubation et les conditions de la culture dépendent également des besoins de croissance des espèces mycobactériennes en raison de leurs taux de croissance distincts et de leurs caractéristiques physiologiques.
- Préparez 5 mL ou 8 mL de culture bactérienne dans un milieu liquide Middlebrook 7H9 ou un milieu MGIT, respectivement, complété avec de l’OADC, et incubez à 37 °C pendant la période nécessaire pour permettre la croissance bactérienne. Les mycobactéries à croissance lente nécessitent 10 à 14 jours, tandis que les mycobactéries à croissance rapide nécessitent environ 2 à 5 jours.
REMARQUE : Une suspension de cellules mycobactériennes peut être préparée en grattant une boucle de colonies dans de l’eau stérile doublement distillée si la culture de départ provient de plaques d’agar solides (par exemple, agar Middlebrook 7H10). - Versez la culture liquide dans des tubes de 15 mL.
- Réduire la culture à 80 °C pendant 1 heure dans un incubateur.
- Dans le cas de Mycobacterium tuberculosis ou d’autres espèces pathogènes nécessitant la BSL-3, transférez les cultures tuées thermiquement au laboratoire de BSL-2.
2. Digestion de la paroi cellulaire et extraction d’ADN
REMARQUE : Une fois la culture inactivée par la chaleur, les étapes suivantes peuvent être réalisées en toute sécurité dans un laboratoire de biosécurité niveau 2 (BSL-2). Si l’objectif est l’extraction pour le séquençage à longue lecture ou des applications alternatives nécessitant de l’ADN de haute masse moléculaire, veillez à utiliser des pointes de pipette à large calibre, et aux étapes du vortex, remplacez le vortex par un mélange d’inversion ou de pipette.
- Centrifugez le tube de 15 mL à 3220 x g pendant 15-30 minutes à température ambiante (RT). Jetez le surnageant transparent (assurez-vous que tous les supports sont retirés).
- Resuspendez soigneusement la pastille de culture dans 300 μL de tampon Tris-EDTA (TE).
- Transférez la pastille remise dans un tube de 2 mL.
- Ajoutez 100 μL de lysozyme (10 mg/mL) et mélangez en pipettant de haut en bas 5 fois, puis tapez doucement le tube pour assurer une dispersion uniforme.
- Incubez le mélange à 37 °C sur un incubateur rotatif toute la nuit (~16 h ; un temps d’incubation plus court peut réduire l’efficacité de la lyse et donc entraîner un faible rendement en ADN).
- Le lendemain, préparez un mélange de 5 μL de protéinase K (10 mg/mL) et 70 μL de SDS à 10 %. Par exemple, s’il y a cinq échantillons, préparez 350 μL de SDS à 10 % et 25 μL de protéinase K. Mélangez en inversant le tube pour éviter la formation de mousse.
- Ajoutez 75 μL de mélange à chaque échantillon.
- Mélangez en tapotant et incubez à 65 °C pendant 10 minutes dans un incubateur ou un bloc chauffant, avec un mélange intermittent par inversion.
- Ajoutez 100 μL de 5 M NaCl.
- Ajoutez 100 μL de solution CTAB/NaCl préchauffée à 65 °C.
REMARQUE : Chauffez la solution CTAB/NaCl à 65 °C avant d’assurer la précision du pipetage, en tenant compte de la viscosité de la substance à la RT. - Mélangez en tapotant jusqu’à ce que la solution devienne laiteuse.
- Incubez à 65 °C pendant 10 minutes dans un incubateur ou un bloc chauffant, avec un mélange intermittent par inversion.
- Ajouter un volume égal (~ 675 μL) de solution chloroforme/alcool isoamylique (24:1) à chaque échantillon et mélanger en tapotant.
REMARQUE : Effectuez cette étape dans une hotte à fumée car le chloroforme est toxique s’il est inhalé et nécessite une manipulation prudente. - Centrifugez les échantillons à 12000 x g pendant 10 minutes à température ambiante.
- Aspirez soigneusement 550 à 600 μL de la phase aqueuse (top) dans des tubes stériles de 1,5 mL et marquez-les de manière appropriée.
REMARQUE : Faites attention à ne pas déranger les autres couches. Si des couches sont accidentellement perturbées, centrifugez à nouveau le tube.
3. Précipitation et élution de l’ADN
- Ajoutez un volume égal (550-600 μL) d’isopropanol glacé et mélangez en inversant les tubes.
REMARQUE : Si la concentration d’ADN est élevée, des précipitations blanches peuvent se former lors du mélange. - Incubez les tubes à -20 °C pendant 30 minutes à 1 heure.
REMARQUE : Des temps d’incubation plus longs peuvent augmenter la précipitationd’ADN 18 mais peuvent aussi entraîner la coprécipitation de sels. Ainsi, une incubation nocturne peut être réalisée si une faible concentration d’ADN est attendue. - Centrifugez à la vitesse maximale (~21130 x g) pendant 30 minutes à température ambiante pour pelleter l’ADN insoluble.
REMARQUE : Assurez-vous que la face avant des tubes 1,5 soit orientée vers l’intérieur dans le rotor de centrifugeuse. À cette étape, l’ADN précipite au fond et le long de l’arrière des tubes. C’est important pour éviter de déranger la pellete potentiellement invisible à l’étape suivante. Un précipité ou une pellete blanche peut être visible si la concentration d’ADN est élevée. L’absence de pellet n’indique pas une extraction ratée ; Poursuivez les étapes restantes. - Aspirez le surnageant par la face avant du tube sans déranger la pelote d’ADN ni la décanter rapidement, tout en veillant à ce que la pelote reste intacte.
REMARQUE : Il est préférable d’aspirer le surnageant si la culture de départ est petite et qu’une faible concentration d’ADN est attendue. - Ajoutez 1000 μL d’éthanol à 75 % bien froid.
- Mélangez en inversant les tubes plusieurs fois.
- Centrifugez à 12000 × g pendant 30 minutes (dans la même orientation qu’à l’étape 3).
- Aspirez ou décantez tout l’éthanol sans déranger le pellet.
REMARQUE : Les étapes 5 à 8 peuvent être répétées si une coprécipitation élevée en sel est anticipée. - Laissez les tubes sécher à l’air au RT pendant la nuit ou pendant au moins 30 minutes.
- Ajoutez 25 à 50 μL de tampon TE (pH 8) à chaque tube pour resuspendre l’ADN.
REMARQUE : L’ADN peut être resuspendu dans un tampon Tris (10 mM, pH 8) ou dans de l’eau sans nucléase si les applications en aval sont sensibles à l’EDTA. - Laissez la pellete d’ADN se resuspendre toute la nuit à 4 °C.
- Conservez à 4 °C pendant 2 à 3 jours avant d’effectuer une évaluation de contrôle qualité.
- Conservez à -80 °C sur le long terme.
4. Quantification de l’ADN et contrôle qualité
REMARQUE : Le contrôle de la qualité de l’ADN est généralement réalisé à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume et d’électrophorèse sur gel. Un système de quantification basé sur la fluorescence peut également être utilisé pour quantifier l’ADN extrait.
- Méthode du spectrophotomètre
- Mesurez la concentration d’ADN et déterminez la qualité en suivant les instructions du fabricant.
REMARQUE : Un échantillon d’ADN a idéalement un rapport de 260/280 entre 1,7 et 2,0. Une valeur de 1,8 est généralement considérée comme pure pour l’ADN. Les valeurs inférieures à cette plage indiquent une contamination par des protéines résiduelles, de la guanidine ou d’autres réactifs qui absorbent fortement à 280 nm ou à proximité. Un ratio de 260/230 entre 2,0 et 2,2 est idéal. Si le ratio est inférieur à ce qui était attendu, cela peut indiquer la présence de contaminants absorbants à 230 nm, tels que l’EDTA, le phénol et les glucides. Vérifiez aussi les graphiques d’absorbance obtenus pour l’échantillon.
- Mesurez la concentration d’ADN et déterminez la qualité en suivant les instructions du fabricant.
- Électrophorèse
- Effectuer l’électrophorèse en geld’agarose 19 pour évaluer l’intégrité de l’ADN et déterminer si une fragmentation ou une dégradation a eu lieu.
- Pour visualiser l’ADN dans le système de documentation du gel UV, utilisez un gel d’agarose à 1,0 % contenant un colorant SYBR Safe. Faites tourner le gel à 80 V pendant 45 minutes.
REMARQUE : L’objectif est d’avoir des bandes claires, distinctes et à fort poids moléculaire au-dessus de la bande la plus haute de l’échelle de l’ADN. Utilisez un tampon TAE 1× neuf à chaque fois.
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Résultats
Ce protocole d’extraction d’ADN utilisant la méthode CTAB (Figure 1) a été évalué chez diverses espèces mycobactériennes telles que M. tuberculosis, M. abcessus et M. chelonea. L’ADN a été extrait et comparé en termes de rendement, de pureté et d’intégrité de l’ADN extrait entre les échantillons.
La concentration d’ADN variait selon les espèces mycobactériennes et variait entre 190-600 ng/μL et >1000 ng/...
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Discussion
Des résultats représentatifs démontrent l’utilité de la méthode CTAB pour extraire l’ADN des espèces mycobactériennes et relever les défis liés à l’extraction de l’ADN de ces organismes. Les mycobactéries sont bien connues pour leurs parois cellulaires complexes et riches enlipides 2. Les résultats actuels mettent en lumière plusieurs aspects critiques qui contribuent au succès de cette technique, car elle fournit un ADN intact de haute concentration et de haute q...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Les auteurs expriment leur sincère gratitude à l’équipe de génomique de la tuberculose : Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa et Rob M Warren, pour leurs contributions au développement et à l’optimisation de ce protocole, ainsi que pour leur soutien inestimable tout au long de cette étude. Ce travail et les personnes impliquées ont été soutenus par des subventions et des financements du Conseil sud-africain de la recherche médicale (SAMRC), de la National Research Foundation (NRF) et de l’Université de Stellenbosch (SU). Les bailleurs de fonds n’ont eu aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte des données, l’analyse ou la préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pointes de pipette de 1 mL | N’importe quel fournisseur | ||
| 10 & micro ; Pointes de pipette en L | N’importe quel fournisseur | ||
| Dodécyle sulfate de sodium à 10 % (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 71736-100 ML | |
| Tubes en polypropylène de 15 mL | N’importe quel fournisseur | ||
| Tubes de 2 ml et tubes de 1,5 ml | N’importe quel fournisseur | ||
| 200 & micro ; Pointes de pipette l | N’importe quel fournisseur | ||
| 2-PROPANOL, BIORÉACTIF, POUR LA B& MOLÉCULAIRE | Merck (Sigma-Aldrich) | I9516-1L ; | Magasiner à -20 °C ; C |
| 37° ; Incubateur C | N’importe quel fournisseur | ||
| 5 M NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S6546 - 100 ML | |
| 65 degrés Incubateur C | N’importe quel fournisseur | ||
| Gel d’agarose | Merck (Sigma-Aldrich) | ||
| Système de documentation du gel UV Bio-Rad, | BioRad | ||
| Centrifuge (pour tubes de 15 ml de 50 ml) et Microfuge (pour tubes de 2 ml) | N’importe quel fournisseur | ||
| CHLOROFORME POUR ANALYSE EMPARTA & reg ; ACS | Merck (Sigma-Aldrich) | 1070242500 | |
| Alcool chloroforme/isoamyl (24:1) | Dans une hotte à fumée, mélangez 384 ml de chloroforme et 16 ml d’alcool isoamylique | ||
| Solution CTAB/NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 52370-100 G | Dissoudre 4,1 g de NaCl dans 80 ml d’eau distillée. Pendant le remuage, ajoutez 10 g de CTAB. Solution thermique à 65°°C ; Incubateur C. Ajustez le volume à 100 ml avec de l’eau distillée. Conserver à température ambiante jusqu’à 6 mois. |
| Échelle ADN 1 Kb | Thermo Fisher Scientific | ||
| ALCOOL ÉTHYLIQUE, PUR, 200 PROOF, POUR MOL& | Merck (Sigma-Aldrich) | E7023-500ML | Mélangez 75 ml d’éthanol absolu et 25 ml d’eau distillée |
| Lysozyme (10 mg/ml) | Merck (Sigma-Aldrich) | 10837059001 | Reconstituez la lysozyme lyophilisée (portée à température ambiante) avec de l’eau distillée à 10 mg/ml |
| Médias de Middlebrook 7H9 | Merck (Sigma-Aldrich) | M0178 | Suivez les directives du fabricant pour la préparation du média liquide |
| ENRICHISSEMENT MIDDLEBROOK OADC 6 x 100 ml F ; | BD | 212240 | |
| Média du Tube Indicateur de Croissance des Mycobactéries (MGIT) | BD | 245122 | |
| Système NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pipette P10 | N’importe quel fournisseur | ||
| Pipette P1000 | N’importe quel fournisseur | ||
| Piquette P200 | N’importe quel fournisseur | ||
| Protéinase K, recomb, PCR grd 2x250mg ; | Merck (Sigma-Aldrich) | 3115801001 | Reconstituez le flacon de protéinase lyophilisée K avec de l’eau distillée à 10 mg/ml. Congelez les aliquotes dans des tubes de 2 ml à -20 °F ; C |
| SYBR-safe | Thermo Fisher Scientific | ||
| Tampon Tris/EDTA (TE) pH 8,0 | Merck (Sigma-Aldrich) | 8890-OP ou 382499997 | |
| Vortex | N’importe quel fournisseur |
Références
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Réimpressions et autorisations
