Système d’expression double basé sur la complémentation GFP pour évaluer le contact cellule-cellule médié par les cytonèmes dans des disques imaginaux vivants d’aile de drosophile

Summary

Nous décrivons un protocole de mesure des contacts entre les cellules des couches épithéliales adjacentes dans les disques imaginaux vivants des ailes de drosophile en utilisant une approche basée sur la reconstitution de la GFP.

Abstract

La croissance et la structuration des tissus embryonnaires sont en grande partie contrôlées par des signaux échangés localement entre les populations cellulaires à l’intérieur des tissus eux-mêmes. Les cytonèmes sont un type de filopode de signalisation identifié pour la première fois chez la drosophile qui relie et médie l’échange entre les cellules productrices et réceptrices de signaux. Dans le disque imaginal de l’aile de la drosophile en développement, les cytonèmes sont impliqués dans l’échange de signaux entre des populations distinctes de cellules à l’intérieur de l’épithélium du disque proprement dit (DP), qui formera l’aile adulte, ainsi qu’entre les cellules DP et les cellules des tissus adjacents associés au disque. Les cytonèmes font synapse avec les cellules cibles pour former des contacts membranaires intimes.

Ici, nous présentons un protocole pour quantifier le contact médié par le cytonème entre les cellules DP et les cellules de l’épithélium de la membrane péripodiale adjacente (PerM), qui est séparé des cellules DP par la lumière du disque, en utilisant une approche de reconstitution GFP dans des disques d’ailes vivants. À l’aide des systèmes GAL4-UAS et LexA-LexAop, des fragments complémentaires de GFP divisée (spGFP1-10, spGFP11), chacun fusionné au domaine transmembranaire de CD4, sont exprimés de part et d’autre de la lumière du disque. L’imagerie de la fluorescence GFP reconstituée dans des préparations de disques alaires vivants par microscopie confocale est ensuite utilisée pour générer des piles d’images à partir desquelles la fluorescence GFP reconstituée peut être localisée et quantifiée. En utilisant ce système, il est possible de co-exprimer des transgènes codant pour des protéines ou interférant avec l’ARN dans des cellules productrices de cytonème ou des cellules cibles afin d’évaluer leur effet sur les contacts cellulaires DP-PerM. Ce système, facilement adaptable à d’autres tissus, permet ainsi d’identifier des facteurs importants pour la formation ou la fonction du cytonème.

Introduction

Le développement des tissus embryonnaires est contrôlé par des cellules situées dans des « centres d’organisation » qui signalent à des cellules distantes au sein d’un tissu, contrôlant leurs décisions de proliférer (c’est-à-dire de croître et de se diviser) ou d’adopter des destins particuliers¹. Cette signalisation cellulaire non autonome est médiée par des ligands produits par l’organisation des cellules centrales qui forment des gradients de concentration à travers les tissus et suscitent des réponses dépendantes de la concentration. Dans de nombreux cas, ces ligands sont soit délivrés, soit captés par de l....

Protocol

Le pilote nubbin-GAL4 est utilisé pour exprimer CD4-spGFP1-10 spécifiquement dans la région de la poche d’aile du DP (Figure 1A). Le pilote PerM-LexA²¹ est utilisé pour exprimer CD4-spGFP11 spécifiquement dans le PerM (Figure 1A). Ces deux systèmes d’expression sont indépendants l’un de l’autre, permettant l’expression simultanée et spécifique de différents transgènes dans DP et PerM (Figure 1B,C).

Le schéma génétique de base consiste à croiser des mouches pour générer des larves du génotype nub-GAL....

Results

Pour tester l’utilité de la procédure GRASP pour mesurer les contacts entre les cellules DP et PerM, nous avons examiné des disques alaires de quatre génotypes différents : des disques de contrôle négatif de type sauvage (génotype : w¹¹¹⁸) qui n’afficheront que des niveaux de fond d’autofluorescence dans le canal GFP ; disques exprimant le CD4-spGFP1-10 dans la couche DP, mais dépourvus du transgène CD4-spGFP11, qui montrera le niveau de fluorescence produit par GFP1-10 seul (que nous pensions néglige.......

Discussion

Les cytonèmes jouent un rôle important dans la distribution des ligands, contrôlant la croissance et l’organisation des tissus en développement. L’échange de signaux a lieu là où les extrémités des cytonèmes établissent des contacts membranaires intimes avec leurs cibles. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple d’analyse des contacts médiés par le cytonème entre les couches épithéliales du disque alaire en utilisant la technique GRASP.

La techniqu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope de dissection Discovery V12	Zeiss		microscope de dissection
Pince Dumont #55, Conseils de biologie	Outils scientifiques fins	11255-20	Pince à dissection
EP-Slik (slik20358)	BDSC	Panneton et al., 2015	souche de mouche pour l’expression de Slik
FIDJI		Schindelin J. et al. (2012)  ;	Logiciel d’analyse d’images
Hoechst 33342  ;	ThermoFisher Scientific	H3570  ;	Imagerie en direct Coloration nucléaire  ;
LexAop-CD4-spGFP11  ;	BDSC	93018	souche de mouche
Microscope confocal LSM 700	Zeiss		Microscope confocal
nub-GAL4	Centre de stock de drosophile de Bloomington (BDSC)	86108	souche de mouche
PerM-LexA		Rambaud, Joseph et al., 2025	souche de mouche
PYREX 9-dépression verre spot platesell	Corning Sciences de la vie	7220-85	pour la collecte et le lavage des larves
Milieu de drosophile de Schneider	ThermoFisher Scientific	21720024	support d’imagerie en direct
Entretoises d’imagerie SecureSeal, 8 puits, 0,12 mm d’épaisseur	Grace Bio-Labs	654008	entretoise
Kit élastomère de silicone SYLGARD 184	Sylgard	3097358-1004	pour la fabrication de plaques de dissection
UAS-CD4-spGFP1-10  ;	BDSC	93017	souche de mouche
Noir Zen	Zeiss		logiciel d’acquisition