Nous décrivons un protocole de mesure des contacts entre les cellules des couches épithéliales adjacentes dans les disques imaginaux vivants des ailes de drosophile en utilisant une approche basée sur la reconstitution de la GFP.
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Article de méthode
Système d’expression double basé sur la complémentation GFP pour évaluer le contact cellule-cellule médié par les cytonèmes dans des disques imaginaux vivants d’aile de drosophile
Dans cet article
Résumé
Résumé
La croissance et la structuration des tissus embryonnaires sont en grande partie contrôlées par des signaux échangés localement entre les populations cellulaires à l’intérieur des tissus eux-mêmes. Les cytonèmes sont un type de filopode de signalisation identifié pour la première fois chez la drosophile qui relie et médie l’échange entre les cellules productrices et réceptrices de signaux. Dans le disque imaginal de l’aile de la drosophile en développement, les cytonèmes sont impliqués dans l’échange de signaux entre des populations distinctes de cellules à l’intérieur de l’épithélium du disque proprement dit (DP), qui formera l’aile adulte, ainsi qu’entre les cellules DP et les cellules des tissus adjacents associés au disque. Les cytonèmes font synapse avec les cellules cibles pour former des contacts membranaires intimes.
Ici, nous présentons un protocole pour quantifier le contact médié par le cytonème entre les cellules DP et les cellules de l’épithélium de la membrane péripodiale adjacente (PerM), qui est séparé des cellules DP par la lumière du disque, en utilisant une approche de reconstitution GFP dans des disques d’ailes vivants. À l’aide des systèmes GAL4-UAS et LexA-LexAop, des fragments complémentaires de GFP divisée (spGFP1-10, spGFP11), chacun fusionné au domaine transmembranaire de CD4, sont exprimés de part et d’autre de la lumière du disque. L’imagerie de la fluorescence GFP reconstituée dans des préparations de disques alaires vivants par microscopie confocale est ensuite utilisée pour générer des piles d’images à partir desquelles la fluorescence GFP reconstituée peut être localisée et quantifiée. En utilisant ce système, il est possible de co-exprimer des transgènes codant pour des protéines ou interférant avec l’ARN dans des cellules productrices de cytonème ou des cellules cibles afin d’évaluer leur effet sur les contacts cellulaires DP-PerM. Ce système, facilement adaptable à d’autres tissus, permet ainsi d’identifier des facteurs importants pour la formation ou la fonction du cytonème.
Introduction
Le développement des tissus embryonnaires est contrôlé par des cellules situées dans des « centres d’organisation » qui signalent à des cellules distantes au sein d’un tissu, contrôlant leurs décisions de proliférer (c’est-à-dire de croître et de se diviser) ou d’adopter des destins particuliers1. Cette signalisation cellulaire non autonome est médiée par des ligands produits par l’organisation des cellules centrales qui forment des gradients de concentration à travers les tissus et suscitent des réponses dépendantes de la concentration. Dans de nombreux cas, ces ligands sont soit délivrés, soit captés par de longues filopodes de signalisation basées sur l’actine appelées cytonèmes qui relient les cellules émettrices et réceptrices de signaux dans les tissus 2,3. Découverts pour la première fois dans le disque imaginal4 de l’aile de drosophile, des cytonèmes ont également été identifiés chez des mammifères et d’autres vertébrés 5,6,7,8,9. Une meilleure compréhension du rôle des cytonèmes dans la signalisation cellulaire non autonome, à un stade précoce, est cruciale pour déchiffrer comment les cellules communiquent pour s’organiser en tissus et comment ces lignes de communication sont modifiées dans diverses conditions pathologiques, y compris les malformations du développement et le cancer.
Les cytonèmes peuvent s’étendre à partir des cellules sources pour délivrer des ligands aux cellules cibles ou à partir des cellules cibles pour recevoir des ligands proches de leurs sources 2,3. Les cytonèmes établissent des contacts intimes avec leurs cibles, où l’on pense qu’ils forment des structures semblables à des synapses, où le transfert de ligands peut se produire 3,10,11. Ce contact peut se produire entre les extrémités des cytonèmes source et cible ou entre les cytonèmes et les corps cellulaires3. Bien qu’elle ne soit pas largement caractérisée, l’adhésion cellulaire par des molécules d’adhésion ou par des interactions récepteur-ligand est, dans certains cas, nécessaire à l’activation correcte des événements de signalisation en aval 12,13,14, ce qui en fait un aspect important de la biologie du cytonème.
Plusieurs études ont appliqué la technique GRASP (« GFP reconstitution across synaptic partners » (GRASP) à l’analyse des contacts du cytonème. Cette méthode a été développée pour identifier et cartographier les partenaires synaptiques dans les systèmes nerveux complexes15. Elle est basée sur l’expression des deux fragments complémentaires de la GFP divisée (spGFP1-10 et spGFP11), chacun fusionné à la région extracellulaire d’un domaine transmembranaire (par exemple de CD4), dans différentes populations de cellules. Si les membranes plasmiques des cellules de ces deux populations entrent en contact direct, cela rapproche les domaines complémentaires de spGFP, conduisant à la reconstitution de la fluorescence GFP. Cette approche a été utilisée chez la drosophile pour identifier l’existence de contacts de cytonème entre les cellules du disque alaire et entre le disque alaire et d’autres tissus étroitement apposés 12,16,17,18,19,20,21.
Cet article décrit l’application de GRASP à la caractérisation des contacts entre deux couches épithéliales morphologiquement distinctes du disque imaginal de l’aile de la drosophile, le disque proprement dit (DP) et la membrane péripodiale (PerM). Ces couches épithéliales forment un sac entourant une lumière centrale, avec les cellules DP cylindriques pseudostratifiées situées d’un côté et les cellules PerM squameuses de l’autre, toutes deux avec leurs membranes apicales tournées vers l’intérieur vers la lumière (Figure 1A). Il existe des preuves de signalisation transluménale entre les deux couches22, 23, 24, 25, et nous avons récemment documenté la signalisation du DP pour contrôler la prolifération des cellules PerM qui est médiée par les cytonèmes apicaux dans le DP21. Ce protocole implique l’utilisation des systèmes d’expression des transgènes GAL4/UAS et LexA/LexAop pour exprimer des fragments complémentaires de spGFP fusionnés à CD4 sur les membranes des cellules DP et PerM. Il utilise la fluorescence GFP reconstituée pour lire le contact membranaire entre les deux populations cellulaires.
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Protocole
Le pilote nubbin-GAL4 est utilisé pour exprimer CD4-spGFP1-10 spécifiquement dans la région de la poche d’aile du DP (Figure 1A). Le pilote PerM-LexA21 est utilisé pour exprimer CD4-spGFP11 spécifiquement dans le PerM (Figure 1A). Ces deux systèmes d’expression sont indépendants l’un de l’autre, permettant l’expression simultanée et spécifique de différents transgènes dans DP et PerM (Figure 1B,C).
Le schéma génétique de base consiste à croiser des mouches pour générer des larves du génotype nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10 ; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. En tant que contrôle négatif, nous laissons de côté le transgène LexAop-CD4-spGFP11 . D’autres transgènes (par exemple, codage protéique, ARN double brin) peuvent être exprimés à volonté dans la couche DP (sous le contrôle de séquences UAS ) ou dans le PerM (sous le contrôle de l’opérateur LexA).
Il s’agit d’un protocole d’imagerie en direct qui ne peut pas être interrompu. La préparation du matériel est estimée à ~10 min. Les dissections ne doivent pas être effectuées pendant plus de 20 minutes à la fois avant l’imagerie. L’imagerie dure ~30 min et ne devrait pas durer plus de ~1 h. Pour plusieurs conditions ou un grand nombre d’échantillons, la procédure doit être effectuée en plusieurs cycles pour garantir les meilleurs résultats.
1. Préparation du matériel
- Avant la dissection, une pince à épiler propre, une plaque de dépression en verre à 9 puits (ou un autre récipient adapté à la collecte et au nettoyage des larves) et une boîte de Pétri réutilisable recouverte de Sylgard (silicone) utilisée pour la dissection avec 70 % d’éthanol.
- Préparez les lames de microscope en effectuant un lavage à l’éthanol à 70 %, puis en collant un espaceur d’imagerie sur la lame séchée. Découpez des puits individuels dans la bande de 8 puits à l’aide de ciseaux et coupez-les en deux (figure 2A). Retirez le support de protection d’un côté de chaque moitié et collez les entretoises sur la glissière, légèrement espacées pour créer un espace abrité au milieu où les disques seront placés (Figure 2B).
REMARQUE : D’après notre expérience, cela simplifie le montage de l’échantillon car le volume précis de fluide transféré sur la lame est moins critique. Tout petit volume excédentaire s’écoulera simplement par l’espace lors de la lamelle. Comme nous n’imaginons que pendant une période relativement courte (généralement ~1 h), nous n’avons rencontré aucun problème avec le séchage moyen. - Décongelez le milieu d’imagerie en direct (milieu de drosophile de Schneider non supplémenté stocké dans des aliquotes congelées de 10 ml) et gardez-le facilement accessible dans un seau à glace.
- Dans un tube de microcentrifugation de 2 mL, mélanger 1,5 mL de milieu avec 20 μL de 200 μg/mL de Hoechst 33342 (concentration finale de 2,7 μg/mL). Gardez le tube sur de la glace.
REMARQUE : Cette forme spécifique de colorant Hoechst est utilisée car elle est hautement perméable à la membrane. ATTENTION : Des gants doivent être utilisés lors de la manipulation de Hoechst 33342. Les outils doivent être lavés après utilisation.
2. Dissection du disque de l’aile et préparation de la glissière
- Après le croisement génétique et l’élevage à 25 °C, prélevez les larves errantes du troisième stade dans le tube et lavez-les dans un milieu d’imagerie en direct froid dans une plaque de dépression en verre à 9 puits.
REMARQUE : Les cytonèmes sont très fragiles. Dans les étapes suivantes, il faut prendre soin de manipuler les tissus autour des disques, en essayant d’éviter tout contact direct entre les disques et les outils de dissection. Nous préparons trois ou quatre larves à la fois, car il est inévitable d’endommager quelques disques, et cela ne peut devenir perceptible qu’au cours des étapes d’imagerie. - Sous le microscope de dissection, transférez les larves dans une goutte de support d’imagerie en direct sur une boîte de Pétri recouverte de silicone et commencez à disséquer à l’aide de deux pinces à dissection. Pour ce faire, maintenez d’abord la tête et la partie antérieure du corps stables en pinçant les larves avec une paire de pinces à environ un tiers de la longueur du corps (à partir de la partie antérieure). À l’aide de la deuxième paire de pinces, pincez le corps juste en arrière de la première pince. Ensuite, retirez la partie postérieure des larves pour isoler la « moitié » antérieure.
- Inversez la moitié antérieure en la fixant avec une pince à épiler de chaque côté de l’extrémité coupée et en poussant la tête avec l’autre paire (comme si vous retourniez une chaussette), pour exposer les structures internes, y compris les disques imaginaux, la trachée, les glandes salivaires, le corps adipeux et l’intestin.
- Retirez soigneusement les glandes salivaires, le corps adipeux et l’intestin, en prenant soin de ne pas déranger les troncs latéraux de la trachée, qui doivent recouvrir et protéger les disques alaires.
- À l’aide d’une pince, transférez avec précaution les moitiés antérieures nettoyées avec les disques alaires attachés dans une goutte de support d’imagerie en direct propre avec du Hoechst, placée entre les entretoises sur une lame préparée (Figure 2C). Isolez les disques alaires du reste des tissus en les disséquant doucement loin des fines branches de la trachée qui se connectent au disque, à l’aide d’une lame de la pince de dissection ou d’un fil de tungstène fin attaché à un porte-aiguille de dissection. Jetez le reste de la carcasse.
- Orientez les disques à l’aide d’une lame de la pince à dissection ou de l’aiguille de dissection en fil de tungstène. En raison de leur forme aplatie en forme de goutte d’eau, les disques alaires tomberont avec le DP ou le PerM vers le haut. Pour ce protocole, orientez tous les disques avec le côté PerM vers le haut.
- Ajustez le volume du support pour remplir entièrement le puits, légèrement au-dessus du niveau de l’espaceur d’imagerie, en ajoutant ou en retirant le support au besoin. Retirez le support de protection de la face supérieure de chaque moitié d’espaceur d’imagerie, puis abaissez soigneusement une lamelle sur l’échantillon. Appuyez doucement sur la lamelle à l’endroit où elle entre en contact avec les entretoises d’imagerie (par exemple, avec l’extrémité arrondie de la pince de dissection) pour vous assurer que la lamelle adhère à l’entretoiseur.
REMARQUE : Le niveau moyen doit être légèrement au-dessus de la hauteur de l’entretoise pour éviter de piéger les bulles d’air, mais pas trop haut pour ne pas générer un débit important lorsque la lamelle est abaissée.
3. Imagerie
- Imagez des échantillons à température ambiante à l’aide d’un microscope confocal (laser argon ion avec une longueur d’onde de 488 nm pour GFP, laser UV avec une longueur d’onde de 350 nm pour Hoechst) équipé d’une lentille d’immersion dans l’huile 40x/1,30 NA et d’un logiciel de microscopie. Acquérez des piles d’images avec une taille de pas de 1 μm qui s’étendent juste au-dessus du niveau le plus élevé de la PerM (où la fluorescence de Hoechst diminue) à la face basale du DP, ce qui équivaut généralement à plus de 100 images par pile. Acquérez des piles d’images répétées pour générer des vidéos timelapse.
REMARQUE : Nous imaginons une diapositive pendant pas plus de ~1-2 h. - Pour les paramètres du logiciel du microscope, acquérez des images à l’aide d’un codage 8 bits, d’une moyenne de ligne de 2, d’un gain de détecteur généralement compris entre 650 et 750 et de pistes de canaux séparés pour réduire le débordement du signal. Utilisez des paramètres laser et de détecteur identiques pour toutes les conditions, prédéterminés en effectuant des tests sur chaque condition au préalable.
REMARQUE : À un grossissement de 40x, nos images ont une résolution de 5,0386 pixels par μm (taille de pixel : 0,1985 x 0,1985 μm2). Dans notre configuration, les paramètres optimaux du microscope confocal comprenaient l’intensité laser la plus élevée possible (sans endommager les tissus) pour capturer autant de signal que possible, tout en produisant peu ou pas de saturation ; et le bruit le plus bas possible, tel qu’évalué sur les commandes négatives, obtenu en réduisant le décalage du détecteur et la vitesse d’acquisition (si nécessaire). Nous utilisons généralement moins de 5 % de puissance laser et la vitesse maximale de la tête de balayage ('9' dans les paramètres du logiciel Zen). L’acquisition d’une seule pile d’images prend généralement ~1 min 45 s, et les images sont prises toutes les 2 à 3 minutes pour des analyses en accéléré.
4. Analyse d’images
- Piles de projets à l’aide de la fonction de projection d’intensité maximale du progiciel ImageJ (cliquez sur l’image | Piles | Z, sélectionnez Intensité maximale dans le menu).
- Dans les images MIP, déterminez la surface de la poche alaire en fonction du motif de pliage du disque alaire (à l’aide du canal Hoechst) à l’aide de la sélection de polygones. Utilisez la même sélection sur le canal GFP avec la fonction Effacer l’extérieur (cliquez sur Modifier | Clear outside) pour définir la valeur de chaque pixel extérieur à 0.
- Dans les images MIP, utilisez le canal Hoechst pour nettoyer les images GFP, en supprimant spécifiquement tous les points artéfactuels qui apparaissent dans les deux canaux en réglant la valeur de pixel concernée à 0 (cliquez sur Sélection de polygones, puis Modifier | effacer).
- Dans les images MIP nettoyées, utilisez la fonction Histogramme (cliquez sur Analyser | Histogramme | List) pour obtenir et copier la liste de toutes les valeurs de pixel dans un tableau d’une feuille de calcul.
- Définissez une valeur seuil basée sur l’analyse du signal de fond dans les contrôles négatifs (puis vérifiée dans d’autres échantillons ; voir la discussion).
- Calculez le pourcentage de surface positive à la GFP à l’aide de la formule suivante :
% surface positive à la GFP =
× 100 - Normalisez les données à la fin en divisant chaque valeur par la moyenne de la condition de référence (qui est définie sur 1).
REMARQUE : Pixel valide = pixel dont la valeur est ≥ 1, ignorant ainsi tout pixel supprimé dont la valeur a été définie sur 0. Les valeurs de pixel de 0 ne se produisent pas naturellement. - Pour déterminer où dans les disques se localise le signal GFP reconstitué, utilisez des recoupes XZ d’empilements d’images pour regarder l’axe apicobasal de l’épithélium du disque. Effectuez les recoupes aux Fidji sans interpolation et augmentez la hauteur de l’image sur l’axe Z à l’aide de la fonction Scale avec interpolation bilinéaire pour améliorer la visibilité.
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Résultats
Pour tester l’utilité de la procédure GRASP pour mesurer les contacts entre les cellules DP et PerM, nous avons examiné des disques alaires de quatre génotypes différents : des disques de contrôle négatif de type sauvage (génotype : w1118) qui n’afficheront que des niveaux de fond d’autofluorescence dans le canal GFP ; disques exprimant le CD4-spGFP1-10 dans la couche DP, mais dépourvus du transgène CD4-spGFP11, qui montrera le niveau de fluorescence produit par GFP1-10 seul (que nous pensions néglige...
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Discussion
Les cytonèmes jouent un rôle important dans la distribution des ligands, contrôlant la croissance et l’organisation des tissus en développement. L’échange de signaux a lieu là où les extrémités des cytonèmes établissent des contacts membranaires intimes avec leurs cibles. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple d’analyse des contacts médiés par le cytonème entre les couches épithéliales du disque alaire en utilisant la technique GRASP.
La techniqu...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.
Remerciements
Ces travaux ont été soutenus par une subvention des IRSC (PJT-162109) à D.H. M.J. titulaire d’une bourse de doctorat de la Fondation de l’Institut de recherches cliniques de Montréal et du Programme de biologie moléculaire de l’Université de Montréal. Les auteurs tiennent à souligner l’aide de la plateforme de microscopie et d’imagerie de l’IRCM.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscope de dissection Discovery V12 | Zeiss | microscope de dissection | |
| Pince Dumont #55, Conseils de biologie | Outils scientifiques fins | 11255-20 | Pince à dissection |
| EP-Slik (slik20358) | BDSC | Panneton et al., 2015 | souche de mouche pour l’expression de Slik |
| FIDJI | Schindelin J. et al. (2012) ; | Logiciel d’analyse d’images | |
| Hoechst 33342 ; | ThermoFisher Scientific | H3570 ; | Imagerie en direct Coloration nucléaire ; |
| LexAop-CD4-spGFP11 ; | BDSC | 93018 | souche de mouche |
| Microscope confocal LSM 700 | Zeiss | Microscope confocal | |
| nub-GAL4 | Centre de stock de drosophile de Bloomington (BDSC) | 86108 | souche de mouche |
| PerM-LexA | Rambaud, Joseph et al., 2025 | souche de mouche | |
| PYREX 9-dépression verre spot platesell | Corning Sciences de la vie | 7220-85 | pour la collecte et le lavage des larves |
| Milieu de drosophile de Schneider | ThermoFisher Scientific | 21720024 | support d’imagerie en direct |
| Entretoises d’imagerie SecureSeal, 8 puits, 0,12 mm d’épaisseur | Grace Bio-Labs | 654008 | entretoise |
| Kit élastomère de silicone SYLGARD 184 | Sylgard | 3097358-1004 | pour la fabrication de plaques de dissection |
| UAS-CD4-spGFP1-10 ; | BDSC | 93017 | souche de mouche |
| Noir Zen | Zeiss | logiciel d’acquisition |
Références
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Réimpressions et autorisations
