Modèle de rejet de greffe de rat de transplantation intestinale avec iléostomie extériorisée pour l’évaluation du pronostic longitudinal

La défaillance d’un organe est une condition dans laquelle un ou plusieurs organes vitaux fonctionnent de manière sous-optimale et ne peuvent pas maintenir la santé. Les soins médicaux tardifs sont souvent mortels ou associés à des complications secondaires telles que des infections¹. Pour la plupart des organes, le remplacement de l’organe défectueux est la seule option viable pour une récupération prolongée. Depuis la découverte de la réacquisition de la souche par les cellules somatiques², il a été postulé que ces cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pourraient permettre une organogenèse complète et fournir une source pratiquement illimitée d’organes pour le remplacement. En combinant la connaissance du développement embryonnaire avec un contrôle minutieux des signaux de signalisation, on a réussi à générer plusieurs tissus à l’échelle des organoïdes. Pour la génération d’organes à grande échelle, bien que des progrès significatifs aient récemment été réalisés dans des organes spécifiques tels que les yeux ^3,4, l’allo-transplantation à partir de donneurs humains reste l’approche dominante pour la plupart des organes vitaux.

Parmi les organes internes, la transplantation intestinale continue de montrer des résultats pronostiques insatisfaisants et nécessite un raffinement chirurgical supplémentaire ou une intervention médicamenteuse⁵. Les nouvelles interventions sont rarement testées directement sur des sujets humains et sont souvent évaluées d’abord dans des modèles animaux de transplantation intestinale. Le présent article détaille un modèle de rat de rejet de greffe intestinale pour servir de plate-forme d’évaluation de ces avancées thérapeutiques potentielles.

Pour imiter la subtile discordance de l’antigène leucocytaire humain (HLA) observée chez l’homme, un segment d’iléon sexuel apparié (mâle) isolé d’un rat Fischer 344 (F344) a été transplanté dans un rat Lewis (LEW), suivi de l’administration de doses sous-optimales de l’immunosuppresseur tacrolimus pendant la phase aiguë pour induire le rejet du greffon en phase chronique. Cette paire donneur-receveur partage les mêmes loci du complexe d’histocompatibilité majeur, mais diffère par les antigènes d’histocompatibilité mineurs⁶. Dans cette méthode, une partie de la muqueuse greffée a été extériorisée sous forme d’iléostomie pour permettre un suivi visuel de l’évolution temporelle du pronostic de transplantation et de l’état de rejet. De plus, une méthode complémentaire basée sur l’image de l’iléostomie pour la quantification de l’état de rejet, validée par les modifications histologiques correspondantes dans le greffon transplanté, est présentée.

Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la Graduate School of Medicine de l’Université d’Osaka, sous le numéro de référence 04-018-003 et ont été effectuées conformément aux directives de l’Université d’Osaka. Des rats Lewis mâles receveurs (LEW) (pesant de 200 à 250 g, âgés de 7 à 9 semaines) et des rats mâles donneurs Fischer 344 (F344) (pesant de 200 à 250 g, âgés de 10 à 12 semaines) ont été utilisés. Avant l’opération, la région abdominale a été rasée et stérilisée avec de l’éthanol à 70 %. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Chirurgie du donneur

1. Faites jeûner le rat donneur pendant 12 heures avant la chirurgie.
2. Anesthésier le rat donneur avec de l’isoflurane inhalé (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Positionnez le rat perpendiculairement à l’opérateur. Réglez le stéréomicroscope sur un grossissement de 5x pendant la procédure. Utilisez de la soie 5-0 pour la ligature.
   REMARQUE : Le débit d’isoflurane était de 1,5 L/min. L’isoflurane a été administré à 2,5 % lors de l’incision abdominale initiale et maintenu à 1,5 % pendant la chirurgie. Une anesthésie adéquate a été confirmée par l’absence de réflexe de l’orteil sur pincement de l’orteil. Si nécessaire, appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse après confirmation de l’anesthésie.
3. Effectuez une incision médiane de 8 cm pour ouvrir la cavité abdominale. Étendez l’incision supérieure au processus xiphoïde pour assurer une visualisation claire de la veine porte (PV).
4. Disséquez le ligament de Treitz et faites pivoter l’intestin grêle de 180 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre pour inverser la rotation intestinale.
5. Observez les anses vasculaires mésentériques et choisissez un site de greffe bien vascularisé, à environ 10 cm de longueur de l’iléon (Figure 1A1).
6. Disséquez le mésentère distal et ligaturez l’artère mésentérique supérieure (SMA) et la veine mésentérique supérieure (SMV) de l’iléon distal. Assurez-vous que l’AS et le SMV sont coupés de la ligature proximale. Une ligature inappropriée peut provoquer des saignements et compromettre la perfusion du greffon.
7. Déplacez l’estomac et la rate vers le crâne pour exposer clairement le PV.
8. Disséquer et ligaturer l’artère/veine colique moyenne et l’artère/veine colique droite, situées du côté gauche de l’AMS/SMV.
9. Disséquez le mésentère du côté droit de la SMA/SMV et ligaturez la branche jéjunale. Évitez de ligaturer trop près du SMV pour éviter qu’il ne se plie (Figure 1A2).
10. Séparez délicatement la base de l’AS à l’aide d’un coton-tige et ligaturez le mésentère entre l’aorte au-dessus de l’AS et le PV. Cette zone contient les ganglions lymphatiques mésentériques supérieurs et de nombreux vaisseaux lymphatiques.
11. Identifier et ligaturer l’artère rénale droite, située du côté droit de l’aorte (Figure 1A3).
12. Injecter une solution saline héparinisée (200 U / 2 mL) dans la veine du pénis.
13. Déterminez la longueur finale du greffon et ligaturez les branches mésentériques en excès. Ligaturer les artères droites aux extrémités proximale et distale du greffon.
14. Lister l’aorte sous l’AS, puis ligaturer l’aorte au-dessus de l’ALES et exciser la base de l’ALES ainsi qu’une tache circulaire de l’aorte. Coupez la veine porte au niveau du hile hépatique, en assurant une coupe oblique pour créer une grande ouverture anastomotique.
    1. Procédez à la coupe des anses vasculaires proximales et distales et de l’intestin. Placez le greffon extrait dans une solution saline froide (4 °C) (Figure 1A4).
15. Retirer la ligature de l’aorte proximale pour induire l’exsanguination et euthanasier le rat donneur (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).

2. Traitement des greffons

1. Identifiez l’artère mésentérique supérieure (SMA) et la veine porte (PV).
2. Perfuser doucement le greffon avec 15 mL de solution saline froide via le SMA (Figure 1B1). Confirmez que tout le sang est remplacé et que la couleur du greffon devient pâle ou blanche.
3. Lavez la lumière de la greffe intestinale et éliminez le contenu fécal.
4. Maintenez le greffon immergé dans une solution saline fraîche et froide jusqu’à la transplantation.

3. Chirurgie du receveur

1. Anesthésier le rat receveur avec de l’isoflurane inhalé (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Placez le rat perpendiculairement à l’opérateur.
   1. Réglez le stéréomicroscope à 5 × pour les procédures générales et à 12,5 × lors de l’anastomose vasculaire. Utilisez de la soie 5-0 pour la ligature et 8-0 Suture en polypropylène synthétique pour l’anastomose vasculaire. Placez le rat sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie pendant l’opération.
      REMARQUE : Le débit d’isoflurane était de 1,5 L/min. L’isoflurane a été administré à 2,5 % lors de l’incision abdominale initiale et réduit à 1,5 % lors de la chirurgie. L’anesthésie a été confirmée par l’absence de réflexe de l’orteil suite à un pincement de l’orteil. Si nécessaire, appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse après confirmation de l’anesthésie.
2. Avant la chirurgie, injecter 0,5 mg/kg de tacrolimus par voie intramusculaire. Faites une incision médiane (~5 cm) et ouvrez la cavité abdominale.
3. Déplacez l’intestin et le côlon vers le crâne et disséquez le ligament de Treitz. Enveloppez l’intestin et le côlon dans de la gaze humide et placez-les sur le corps du rat.
4. Disséquer le péritoine sur la veine cave inférieure (CVI) et l’aorte (Figure 1B2). Identifiez et ligaturez l’artère et la veine gonadiques droites. Localisez l’uretère droit.
5. Faites pivoter le rat de 90° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour que la tête soit tournée vers la gauche de l’opérateur. Clampez la VCI au-dessus de la veine rénale droite à l’aide d’une pince vasculaire Bulldog incurvée.
6. Incisez la paroi IVC avec des ciseaux pour créer une ouverture ovale. Rincer avec une solution saline et placer une suture de maintien sur le bord caudal de la VCI (Figure 1B3-1). Assurez-vous que l’ouverture anastomotique veineuse est grande (~1 cm) et étirez la paroi PV de manière adéquate au niveau de l’anastomose.
7. Placez le greffon sur le côté gauche du rat, en positionnant le PV et le SMA près de la CVI et de l’aorte. Orientez l’iléon distal vers la tête. Enveloppez le greffon dans de la gaze froide et humide et appliquez de la glace pour maintenir une température basse.
8. Passez l’aiguille de suture de maintien (suture en polypropylène synthétique 8-0) à travers le bord caudal du PV. Utilisez une pince anti-moustiques pour contrôler la tension des sutures.
9. Suturez et attachez le bord crânien du PV à la VC (PV à IVC). Anastomose de la paroi PV postérieure (IVC à PV) (Figure 1B3-2). Attachez la suture de maintien sur le bord droit du PV. Ensuite, anastomose la paroi PV antérieure (PV à IVC).
   1. Avant de terminer l’anastomose, clampez le greffon PV et injectez une solution saline héparinisée. Attachez la suture et relâchez la pince IVC (Figure 1B3-3).
      REMARQUE : Le saignement initial peut se produire au niveau de l’anastomose, mais il est généralement contrôlé spontanément.
10. Clampez l’aorte au-dessus de la bifurcation de l’artère iliaque à l’aide d’une pince Bulldog incurvée.
11. Inciser la paroi aortique. Placez une suture de maintien (suture en polypropylène synthétique 8-0) sur le bord crânien de l’aorte et de la SMA (~4-5 mm) (Figure 1B4-1). Tenez la suture de maintien à l’aide d’une pince anti-moustiques pour contrôler la tension.
12. Passer un autre 8-0 aiguille à travers le bord caudal de l’AS et de l’aorte. Attachez et commencez l’anastomose sur le côté droit du rat (figure 1B4-2). Attachez la suture de séjour.
13. Faites pivoter le rat de 180° de manière à ce que la tête soit tournée vers la droite de l’opérateur. Complétez l’anastomose de l’aorte sur le côté gauche. Avant la suture finale, clampez le greffon PV et injectez une solution saline héparinisée. Attachez la suture (Figure 1B4-3).
14. Relâchez les pinces aortique et PV pour la reperfusion (Figure 1B5). Des saignements initiaux peuvent survenir, mais peuvent être contrôlés par une légère pression à l’aide d’un coton-tige. La muqueuse du greffon devrait devenir rose en quelques minutes (Figure 1B6).
15. Faites pivoter le rat de 90° pour que la tête soit tournée vers le côté opposé. Faites deux incisions cutanées de 8 mm sur l’abdomen droit et extériorisez les extrémités proximale et distale du greffon iléal.
    1. Suturez la peau et greffez la séreuse à l’aide de polydioxanone 5-0 (PDS) (Figure 1B7). Fermez l’incision médiane avec 5-0 PDS pour terminer la chirurgie.
       REMARQUE : Les rats postopératoires doivent être surveillés attentivement jusqu’à ce qu’ils reprennent pleinement conscience. Ne retournez pas dans la cage tant que le décubitus sternal n’est pas atteint.

4. Prise en charge postopératoire

1. Pour maintenir le greffon pendant la phase aiguë, injecter du tacrolimus à 0,5 mg/kg par voie intramusculaire les jours postopératoires (POD) 1-13, 20 et 27⁷.
   REMARQUE : Administrer des injections consécutives sur des jambes alternées. Alternativement, le tacrolimus peut être administré par voie sous-cutanée.
2. Injecter du méloxicam à raison de 0,4 mg/kg par voie sous-cutanée sur les POD 1 à 3.
   REMARQUE : Les rats receveurs perdent généralement du poids jusqu’au POD 7, avec récupération au POD 14. Des injections sous-cutanées de solution saline peuvent être administrées pour atténuer la déshydratation due à la perte de liquide de l’iléostomie. Une mortalité inattendue survient dans environ 20 % des cas avant le POD 7. La survie et l’état de santé général sont généralement stables par la suite.

5. Évaluation par image de l’état de santé du greffon intestinal

1. Ouvrez une image de l’iléostomie dans ImageJ. Convertissez l’image en pile RVB en sélectionnant Type de > d’image > Pile RVB.
   REMARQUE : Si l’image n’est pas déjà au format RVB, convertissez-la d’abord en couleur RVB à l’aide du type de > d’image > Couleur RVB.
2. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) qui comprend uniquement la zone muqueuse visible de l’iléostomie.
3. Mesurez l’intensité de chaque canal (rouge, vert et bleu) dans le retour sur investissement sélectionné.
4. Calculez le score de santé du greffon à l’aide de la formule suivante :
   Score =
   REMARQUE : Normalisez le score final de sorte que : Si le score > 10, attribuez une valeur de 10 ; Si le score est < 0, attribuez la valeur 0.

Des images représentatives des principaux points de contrôle chirurgicaux sont présentées à la figure 1. Le taux de réussite de la reperfusion était de près de 100 % et le taux de survie postopératoire était de 80,0 % (20 chirurgies sur 25). Lorsque les procédures ont été correctement effectuées et que le tacrolimus a été administré à la dose et au calendrier spécifiés, l’iléostomie extériorisée est généralement devenue blanchâtre - une indication de rejet du greffon - à partir de la troisième semaine après l’intervention (Figure 2A, B). En revanche, les greffons syngéniques (LEW→LEW), qui ne suscitent pas de réponse de rejet, ont maintenu une bonne santé à long terme (Figure 2B). Le suivi longitudinal de l’aspect de l’iléostomie à l’aide d’un modèle de régression trichromatique (les détails sur les performances d’entraînement et les résultats de la régression sont fournis dans le fichier supplémentaire 1) a fourni des informations quantitatives sur l’état de santé et de rejet du greffon (Figure 2A, C). L’analyse histologique a révélé la perte de structures épithéliales, telles que les villosités et les cryptes - caractéristiques clés de la fonction intestinale et de l’entretien - ainsi que l’épaississement de la sous-muqueuse riche en matrice extracellulaire (MEC) aux jours 28 et 45 postopératoires (Figure 3A, B).

Figure 1 : Images opératoires représentatives d’une transplantation intestinale de rat. (A) Chirurgie du donneur. (1) L’intestin grêle du rat donneur ; La région de greffe prévue est indiquée par les flèches blanches. (2) La greffe suite à dissection de branches mésentériques. PV : nervure porte ; SMV : veine mésentérique supérieure ; SMA : artère mésentérique supérieure. (3) Dissection du péritoine autour de l’aorte et de la racine de l’AMS. L’artère rénale droite (ARR) est identifiée entre l’aorte et la veine cave inférieure (VCI). (4) La greffe avant l’extraction. Les flèches indiquent les extrémités proximale et distale du segment intestinal à extraire ; Des pointillés noirs marquent les sites de transsection. (B) Préparation de la table dorsale et chirurgie du receveur. (1) Le greffon après perfusion de SMA avec une solution saline, mise en évidence par son aspect blanchi. (2) l’aorte et la VCI du receveur ; Les ovales rouges et bleus indiquent les sites d’anastomose visés. (3-1) La VCI du receveur avant l’anastomose, avec une suture de maintien sur le bord caudal de l’ouverture de la VCI. (3-2) Achèvement de l’anastomose de la paroi postérieure entre la veine porte (PV) et la VCI. (3-3) Anastomose complète PV-IVC ; le PV de greffe est serré et l’IVC est ouvert. (4-1) Anastomose entre l’aorte du receveur et l’ALE du donneur, avec une suture de maintien au bord du crâne. (4-2) Achèvement de l’anastomose de la paroi gauche. (4-3) Anastomose complète de l’aorte SMA. (5) Le greffon avant la reperfusion. (6) Le greffon après une reperfusion réussie. (7) Mise en place d’iléostomies à partir des extrémités proximale et distale du greffon, positionnées à droite de l’incision médiane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Surveillance basée sur l’image de la santé du greffon intestinal par l’évaluation de l’iléostomie. (A) Schéma montrant le développement d’un modèle de régression linéaire pour calculer les scores de l’état de santé du greffon basés sur les intensités RVB à partir d’images d’iléostomie. (B) Images représentatives et scores d’état de santé calculés de l’iléostomie pendant la chronologie de rejet. Une image d’un greffon syngénique au jour postopératoire (POD) 127 est présentée comme référence pour la santé à long terme du greffon. Chaque région d’iléostomie représente une zone de 1 cm × 1 cm. Barres d’échelle : 1 mm. (C) Suivi temporel des scores d’état de santé pour deux greffons. POD : jour postopératoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse histologique de la greffe intestinale. (A) Images de microscopie confocale de la distribution de la matrice cellulaire et extracellulaire (ECM) dans des cryosections de 14 μm du greffon aux POD indiqués, avec des inserts sous-muqueux. (B) Coloration Sirius Red du collagène dans des cryosections de 6 μm à partir de greffons collectés sur POD 45. Barres d’échelle : 100 μm ; 20 μm en médaillons. Les astérisques indiquent la surface épithéliale intestinale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Abondance de macrophages intestinaux homéostatiques S1 comme marqueur pronostique de la santé du greffon. (A) Visualisation UMAP de transcriptomes unicellulaires montrant le regroupement des macrophages intestinaux homéostatiques Cx3cr1+, Mrc1+ et Timp2+ (pointes de flèches), sur la base d’un ensemble de données publiques GSE167460. (B) Le score d’identité basé sur MIKA confirme une forte identité de macrophage S1 dans ces populations. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Métriques de performance d’entraînement et données de sortie du modèle de régression trichromatique utilisé pour le suivi longitudinal de l’apparence de l’iléostomie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Ka.T. est un fondateur scientifique, actionnaire et a reçu des fonds de recherche de StemRIM Inc. Tous les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.