Ce protocole fournit une description détaillée de la génération, de la culture et de l’analyse du lymphome à cellules du manteau dans des coupes tumorales d’hydrogel imprimées en 3D.
Article de méthode
Bio-impression de coupes tumorales d’hydrogel comme modèle 3D pour le lymphome à cellules du manteau
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le lymphome à cellules du manteau (LCM) est un néoplasme à cellules B rare et agressif qui récidive fréquemment et ne présente qu’une réponse limitée à la chimiothérapie conventionnelle. L’un des principaux défis de la recherche sur les LCM est la culture de cellules primaires de LCM ex vivo, car les cellules ont tendance à subir une apoptose spontanée lorsqu’elles sont cultivées en culture en suspension 2D. Bien que les modèles 3D soient connus pour mieux récapituler la situation in vivo des tumeurs solides, leur application est encore peu explorée dans les lymphomes. Le développement de modèles 3D qui reproduisent les conditions in vivo du MCL dans le ganglion lymphatique pourrait améliorer leur survie, faciliter l’étude de la diaphonie entre le MCL et le microenvironnement tumoral et imiter la réponse médicamenteuse in vivo . Ici, un modèle imprimé en 3D de MCL sous forme de tranches de tumeur d’hydrogel a été établi, ainsi qu’une méthode de culture optimisée. Un processus standardisé a été mis au point à l’aide de lignées cellulaires MCL ou de cellules MCL primaires, dans lesquelles les cellules sont immergées dans un hydrogel contenant de l’alginate, du collagène de type I et une matrice de membrane basale par bio-impression dans un bain de support de gélatine. Les tranches de tumeur d’hydrogel MCL résultantes sont cultivées sur un support de filtre pour maintenir leur stabilité tout au long de la période de culture. Des traitements médicamenteux peuvent être appliqués au système. La réponse des cellules uniques à l’intérieur de la tranche de tumeur d’hydrogel peut être suivie par imagerie de fluorescence 3D en direct en quadrichromie. Les cellules primaires du MCL ont démontré une viabilité stable lorsqu’elles ont été cultivées dans les tranches de tumeur d’hydrogel. Ce protocole fournit une description détaillée de la génération, de la culture et de l’analyse des cellules MCL dans des coupes tumorales d’hydrogel. En imitant étroitement le microenvironnement tumoral et en utilisant une culture d’interface air-liquide, le modèle présenté améliore la pertinence physiologique par rapport à la culture 2D traditionnelle. Il offre un potentiel important pour faire progresser les études biologiques et thérapeutiques du LCM.
Introduction
Le lymphome à cellules du manteau (LCM) est un lymphome non hodgkinien à cellules B rare et agressif qui prend naissance dans la zone du manteau des ganglions lymphatiques1. La zone du manteau est composée d’un anneau de petits lymphocytes entourant le centre germinatif du follicule des cellules B. En règle générale, le LCM présente une évolution clinique agressive, avec des rechutes fréquentes après la chimiothérapie initiale. Grâce à une meilleure compréhension de la formation de la maladie1 et au développement de nouveaux traitements, notamment l’immunochimiothérapie2, les inhibiteurs de la tyrosine kinase3 de Bruton ou les conjugués anticorps-médicament4, les options de traitement pour les patients atteints de LCM ont permis d’améliorer les taux de réponse et de prolonger la survie sans progression. Cependant, la résistance aux médicaments et les rechutes rendent toujours la maladie incurable5. C’est en partie une conséquence de son hétérogénéité et de l’influence du microenvironnement tumoral sur le développement tumoral et la résistance aux médicaments6. L’un des défis de l’étude du MCL est la difficulté de cultiver des cellules primaires du MCL en culture en suspension7, car les cellules subissent une apoptose spontanée ex vivo 4,5. Cela souligne la nécessité d’approches alternatives pour mieux modéliser le MCL dans les modèles précliniques.
In vivo, les tumeurs sont des structures tridimensionnelles (3D) composées de divers composants cellulaires, notamment des cellules tumorales, des cellules immunitaires et des cellules stromales, ainsi que des composants non cellulaires tels que la matrice extracellulaire (ECM). L’ECM, qui se compose de macromolécules comme le collagène et la laminine, forme un réseau fibreux complexe de fibres élastiques hautement hydrophiles, créant un environnement semblable à un gel 2,8,9,10. Pour mieux reproduire ces conditions in vivo de tumeurs ex vivo, une variété de modèles 3D ont été développés. Ces dernières années, ces modèles sont devenus cruciaux pour l’étude de la pharmacologie et de la biologie du cancer, en se concentrant principalement sur les tumeurs solides11.
À ce jour, ce domaine reste peu exploré dans les lymphomes, car les cellules cancéreuses hématologiques ont la capacité de se développer à la fois en suspension et dans un environnement stromal comme les ganglions lymphatiques, la moelle osseuse ou les tissus lymphoïdes secondaires12. In vivo, les cellules MCL se disséminent de la zone du manteau des ganglions lymphatiques dans le sang ou la moelle osseuse, bien qu’elles prolifèrent principalement dans les ganglions lymphatiques d’où elles proviennent13,14. À l’intérieur des ganglions lymphatiques, les cellules MCL sont entourées de cellules T, de macrophages et de cellules stromales mésenchymateuses, qui contrôlent toutes la survie ou la réponse médicamenteuse des cellules MCL 14,15,16,17,18. De plus, la diaphonie MCL-microenvironnement tumoral, ainsi que la porosité et les propriétés mécaniques, sont des facteurs importants qui peuvent influencer les réponses aux médicaments et la résistance 6,14. Ainsi, des modèles tumoraux 3D standardisés et reproductibles de MCL qui simulent le microenvironnement natif sont nécessaires pour étudier le MCL primaire. Jusqu’à présent, des modèles principalement basés sur des cellules tels que des sphéroïdes ou des organoïdes de cellules primaires MCL ont été établis 6,19. Ils améliorent avec succès la viabilité et la culture à long terme des cellules primaires du LCM. Cependant, la matrice extracellulaire est sous-représentée dans ces modèles. Dans ce contexte, la bio-impression 3D avancée offre une approche prometteuse. En assemblant directement des cellules vivantes et des hydrogels, cette technologie permet de générer des modèles de ganglions lymphatiques 3D à base d’hydrogels physiologiquement pertinents.
Ici, un modèle bio-imprimé en 3D de MCL sous forme de tranches de tumeur d’hydrogel a été établi, ainsi qu’une méthode de culture optimisée. Les cellules sont intégrées dans des tranches d’hydrogel à base de collagène de type I, d’alginate et de Matrigel par incorporation réversible de forme libre d’hydrogels en suspension (FRESH)bio-impression 20. Les tranches tumorales d’hydrogel sont cultivées sur un support filtrant, ce qui permet aux cellules MCL de se développer dans un cadre qui récapitule étroitement les conditions in vivo du ganglion lymphatique.
Ce protocole fournit une description détaillée de la génération, de la culture et de l’analyse des cellules MCL dans des coupes tumorales d’hydrogel. En utilisant l’imagerie de fluorescence 3D en direct en quadrichromie, la viabilité ou la réponse médicamenteuse de cellules uniques à l’intérieur de la tranche de tumeur d’hydrogel peut être suivie. Les cellules primaires du MCL ont montré une meilleure survie lorsqu’elles étaient cultivées dans des tranches de tumeur d’hydrogel. Ce modèle fournit un outil pour étudier la biologie du LCM et la réponse au traitement, ouvrant la voie à la compréhension des influences microenvironnementales et de la variabilité des patients atteints de LCM.
Protocole
Le travail avec les cellules primaires MCL doit être approuvé par le comité d’éthique local. Dans cette étude, le comité d’éthique de la faculté de médecine de l’Université Eberhard-Karls et de l’hôpital universitaire de Tübingen a approuvé la collecte et le traitement d’échantillons de patients et de donneurs sains (numéro de projet 159/2011BO2), et le consentement écrit éclairé a été obtenu des patients conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les cellules primaires du LCM utilisées ici ont été isolées à partir de ganglions lymphatiques entiers du patient et comprenaient donc non seulement des cellules du LCM, mais également d’autres cellules telles que les cellules immunitaires et les fibroblastes.
1. Préparation de la suspension de gélatine pour le bain de support
REMARQUE : La boue de gélatine servira de bain de support pendant le processus de bio-impression 3D. Il induit la réticulation de la bio-encre, permettant la formation d’une structure 3D. La préparation de la suspension de gélatine doit être effectuée dans des conditions stériles à l’intérieur d’une hotte de culture cellulaire.
- Préparez une solution de gélatine à 4,5 % (p/v) dans 10 mM de HEPES et 11 mM de CaCl2 en dissolvant 6,75 g de poudre de gélatine dans 1,5 mL de 1 M HEPES, 15 mL de 110 mM de CaCl2 et 133,5 mL deH2O stérile dans un bocal Mason stérile muni d’un couvercle. Assurez-vous que le pot Mason peut être mélangé dans un mélangeur haute performance.
- Incuber la solution à 37 °C pendant 4 h ou jusqu’à ce qu’aucune trace ne soit observée en remuant la solution, indiquant que la gélatine est complètement dissoute. Refroidir la gélatine à 4°C pendant la nuit ou pendant au moins 12 h.
- Préparez un tampon de lavage stérile composé de 10 mM d’HEPES et de 14,4 mM de CaCl2. Pré-refroidissez le tampon de lavage à 4°C.
- Casser la gélatine solidifiée à 4,5 % en plusieurs morceaux à l’aide d’une cuillère stérile.
- Remplissez complètement le pot Mason contenant la gélatine à 4,5 % avec le tampon de lavage pré-refroidi, en veillant à ce que le tampon reste froid tout au long du processus de préparation de la suspension de gélatine.
- Congelez le pot Mason contenant de la gélatine à -20 °C pendant 45 à 60 min, jusqu’à ce que la suspension de gélatine atteigne 0 °C, mais n’ait pas encore commencé à former des cristaux de glace. Utilisez un thermomètre pour surveiller la température.
- Fixez le couvercle et la lame du mélangeur au pot Mason, puis montez le pot Mason sur le mélangeur. Mélanger la suspension de gélatine pendant 120 s à l’aide du réglage d’impulsion.
REMARQUE : Les paramètres du mélangeur peuvent devoir être ajustés lors de l’utilisation d’un autre type de mélangeur. - Transférez la suspension mélangée dans des tubes pré-refroidis de 50 ml. Centrifugeuse à 3 800 x g pendant 2 min à 4°C. Assurez-vous que la suspension est séparée en une boue de gélatine solide en bas et en tampon de lavage liquide en haut.
- Effectuez l’étape suivante sur de la glace : Lavez la bouillie de gélatine. Aspirez la couche supérieure de liquide, en essayant d’éliminer les bulles visibles sur le dessus du tampon de lavage. Ajoutez 20 ml de tampon de lavage frais à 4 °C dans le tube. Vortex le tube pour mélanger la boue de gélatine avec le tampon de lavage.
- Répétez le processus de centrifugation et de lavage au moins 3 fois, ou jusqu’à ce qu’aucune bulle ne soit visible en haut du tampon de lavage. Après le lavage final, retirez tout résidu de tampon de lavage par aspiration. La suspension de gélatine peut être conservée à 4°C pendant plusieurs semaines.
2. Préparation de la bio-encre chargée de cellules
- Préparez une solution d’alginate stérile à 5 % 1 à 2 jours avant l’impression. Ajouter 1 g d’alginate à 20 ml de PBS stérile dans un tube de 50 ml. Pour éviter les résidus de poudre d’alginate sec, ajoutez le PBS par petits incréments, en tourbillonnant entre les ajouts. Incuber la solution soit dans un bain-marie à 37 °C pendant plusieurs heures, soit toute la nuit sur un rouleau tubulaire à température ambiante. Une fois l’alginate complètement dissous, conservez la solution à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Si vous travaillez avec une lignée cellulaire MCL, cultivez les cellules en suspension dans une fiole T75. Le jour de l’impression, assurez-vous que 1,4 x 107 cellules sont disponibles pour la préparation de 1 mL de bio-encre, ce qui donnera 9-10 tranches de tumeur d’hydrogel.
- Si vous travaillez avec des cellules primaires MCL, les cellules n’ont pas besoin d’être cultivées en suspension avant la bio-impression. Décongelez les cellules primaires MCL cryoconservées directement avant la bio-impression. Transférez les cellules primaires du MCL dans un tube de 50 ml avec un milieu de culture. Pour éliminer le fluide de congélation restant, centrifugez immédiatement le tube à 340 x g pendant 5 min, puis retirez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 20 mL de milieu frais pour le comptage des cellules.
- Le jour de l’impression, préparez la bioencre adaptée aux cellules d’intérêt. Pour les cellules Jeko-1, préparez une bio-encre composée de 0,5 % (p/v) d’alginate, de 20 % (v/v) de collagène de type I, de 1x RPMI et de 2 mM d’HEPES. Mélangez 100 μL d’alginate à 5 %, 200 μL de collagène de type I, 100 μL de 10x RPMI, 200 μL de 10 mM HEPES et 350 μL de PBS pour 1 mL de bio-encre. Des cellules seront ajoutées à l’étape 2.6.
- Pour les cellules primaires MCL, préparez une bio-encre composée de 0,5 % (p/v) d’alginate, de 20 % (v/v) de collagène de type I, de 1x RPMI et de 0,5 mM d’HEPES. Mélangez 100 μL d’alginate à 5 %, 200 μL de collagène de type I, 100 μL de 10x RPMI, 50 μL de 10 mM HEPES et 500 μL de matrice de membrane basale pour 1 mL de bio-encre. Des cellules seront ajoutées à l’étape 2.6. Si vous travaillez avec une lignée cellulaire MCL, transférez la suspension cellulaire du ballon de culture dans un tube de 50 ml.
- Mélangez les cellules avec 0,4 % de bleu de trypan dans un rapport de 1:1. Comptez les cellules viables (non colorées) à l’aide d’un compteur de cellules ou d’une chambre Neubauer. Calculez le volume de suspension cellulaire pour 1 mL de bio-encre, ce qui équivaut à 1,4 x 107 cellules. Transférez le volume calculé dans un nouveau tube de 50 ml. Centrifuger à 340 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant. Remettez en suspension la pastille de cellule dans la bio-encre préparée pour générer la bio-encre finale chargée de cellules.
REMARQUE : On a estimé que la pastille cellulaire a un volume de milieu de 50 μL. Avec la bio-encre préparée à l’étape 2.4, cela donnera 1 mL de bio-encre.
3. Bio-impression dans le bain
REMARQUE : Si possible, effectuez le processus d’impression 3D dans un environnement stérile, par exemple sous une hotte de culture cellulaire. L’imprimante 3D utilisée a été modifiée pour l’impression FRESH par l’ajout d’un prolongateur de pompe à seringue, comme décrit dans Hinton et al.20.
- Allumez la bio-imprimante et connectez-la au logiciel de l’imprimante 3D. Ouvrez le fichier .stl contenant le plan pour les tranches de tumeur d’hydrogel. Jusqu’à 5 tranches peuvent être imprimées simultanément. Assurez-vous que chaque tranche de tumeur d’hydrogel a un diamètre de 8 mm et une hauteur de 1,5 mm. Réglez la densité de remplissage sur 85 %. Placez la tête d’impression.
REMARQUE : Le fichier STL a été conçu avec Fusion 360 et se trouve dans le Fichier de codage supplémentaire 1. Pour l’impression 3D, le logiciel Cura version 15.04.5 a été utilisé. - Transférez la bouillie de gélatine préalablement préparée dans une boîte de Pétri de 35 mm de diamètre jusqu’à ce qu’elle soit à moitié pleine. Assurez-vous qu’il ne reste pas d’espace d’air dans la boue de gélatine. Retirez l’excès d’eau de la boue à l’aide de lingettes de précision jetables pour générer un bain de support de gélatine, qui est pâteux et conserve la forme jusqu’à ce qu’une force suffisante soit appliquée.
- Transférez la bio-encre chargée de cellules dans une seringue en verre de 2,5 ml et connectez-la à une buse émoussée de 0,8 mm. Retournez la seringue et éjectez soigneusement l’excès d’air et les bulles d’air. Une fois la seringue préparée, insérez-la dans la bio-imprimante. À l’aide du logiciel de l’imprimante 3D, extrudez la bio-encre jusqu’à ce qu’elle commence à être éjectée de la buse. Essuyez la goutte de bioencre éjectée à l’aide d’une lingette de précision scientifique jetable pour éviter l’obstruction de la buse.
- Placez le bain de support de gélatine juste en dessous de la buse de la seringue. Abaissez la tête d’impression jusqu’à ce que la buse soit positionnée à l’intérieur de la boue de gélatine, à 2 mm au-dessus du fond du bain de support.
- Démarrez le processus d’impression via le logiciel de l’imprimante 3D.
- Une fois le processus d’impression terminé, retirez tout excès de suspension de gélatine de la buse pour éviter le colmatage. Sortez le bain de soutien contenant les tranches de tumeur d’hydrogel et couvrez-le avec un couvercle pour maintenir la stérilité.
- Incuber le bain de support contenant les tranches de tumeur d’hydrogel imprimées à 37 °C pour permettre à la gélatine de fondre. Cette étape libérera les tranches de tumeur d’hydrogel imprimées du bain de support.
- Préchauffez le tampon de lavage et le milieu de culture cellulaire à 37 °C. Pendant que la gélatine fond, préparez une plaque à 6 puits pour laver les tranches de tumeur d’hydrogel. Remplissez deux puits avec 10 mM d’HEPES, 14,4 mM de tampon de lavage CaCl2 (le même tampon que celui utilisé pour le lavage de la suspension de gélatine) et deux puits avec un milieu de culture cellulaire.
- Une fois que la gélatine a fondu, utilisez une spatule stérile pour transférer les tranches de tumeur d’hydrogel dans le tampon de lavage. Lavez les tranches pendant 1 min chacune, d’abord dans les deux puits contenant du tampon de lavage, puis dans les deux puits contenant du milieu. Les tranches de tumeur d’hydrogel chargées de cellules sont maintenant prêtes pour la culture.
- Conservez la bioencre restante pour répéter le processus d’impression.
4. Culture et traitement de tranches de tumeur d’hydrogel
- Pour cultiver les tranches d’hydrogel, transférez-les sur un support de filtre (taille de pores de 0,4 μm) placé à l’intérieur d’une plaque à 6 puits. Cultivez jusqu’à 5 tranches d’hydrogel sur un seul support de filtre. Ajouter 1,5 mL de milieu de culture cellulaire sous le support du filtre. Ajoutez une goutte de milieu sur les tranches de tumeur d’hydrogel pour éviter qu’elles ne se dessèchent.
- Pour le traitement médicamenteux des tranches de tumeur d’hydrogel, ajoutez la quantité souhaitée du médicament au milieu de culture cellulaire. Ici, des coupes tumorales d’hydrogel ont été traitées avec 0,33 μM-27 μM de Doxorubicine pendant 48 h ou 72 h. Cultivez toujours un ensemble de tranches sans traitement comme contrôle.
- Placez la plaque à 6 puits avec les tranches de tumeur d’hydrogel dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2 pendant la période de culture souhaitée.
5. Analyse de la viabilité des cellules par test d’exclusion au bleu de trypan
- Pour évaluer la viabilité cellulaire après une culture ou un traitement, dissolvez les tranches de tumeur d’hydrogel. Transférez une tranche de tumeur d’hydrogel dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 500 μL par tranche d’un tampon de dissolution contenant 30 mM d’EDTA, 55 mM de citrate de sodium et 150 mM de chlorure de sodium (pH 6,8). Pipette de haut en bas jusqu’à ce que l’hydrogel soit complètement dissous.
- Centrifuger la solution à 340 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de milieu par tranche d’hydrogel dissous.
- Mélangez la suspension cellulaire dans un rapport de 1:1 avec 0,4 % de bleu de trypan. Comptez les cellules viables (non colorées) et mortes (colorées) à l’aide d’un compteur de cellules ou d’une chambre de Neubauer. Enregistrez le nombre de cellules vivantes et mortes pour une analyse plus approfondie.
6. Imagerie par fluorescence 3D en direct en quatre couleurs
REMARQUE : La coloration quadricolore utilisée ici permet la différenciation entre les cellules vivantes (TMRM-positif), les cellules apoptotiques (substrat fluorogénique Caspase-3-positif) et les cellules mortes (PicoGreen-positif)21,22,23. Les noyaux sont détectés avec DRAQ5. Cependant, ce protocole peut être ajusté à tout autre colorant de fluorescence spécifique photostable pour détecter les biomarqueurs, les structures cellulaires ou les types de cellules de choix. Avant la coloration, assurez-vous que le microscope est capable de détecter les longueurs d’onde des fluorophores utilisés pour la coloration.
- Pour une coloration quadricolore d’une tranche de tumeur d’hydrogel, préparez une solution de coloration en ajoutant TMRM, DRAQ5 et un substrat fluorogénique de caspase-3 à 1 mL de milieu de culture cellulaire à une concentration finale de 0,5 μM, 5 μM et 2 μM, respectivement.
- À l’aide d’une spatule stérile, transférez une tranche de tumeur d’hydrogel sur une lamelle en verre chambrée. Ajoutez la solution de coloration préparée sur la tranche d’hydrogel jusqu’à ce qu’elle soit complètement recouverte. Incuber l’échantillon pendant 20 min à 37 °C dans l’obscurité.
- Après l’incubation initiale, prélever la solution de coloration recouvrant la tranche de tumeur d’hydrogel et ajouter 0,7 μL/mL de PicoGreen. Pipetez la solution de coloration dans la tranche d’hydrogel et incubez pendant 10 minutes supplémentaires à 37 °C dans l’obscurité.
- Après l’incubation, retirez soigneusement l’excès de milieu tout en laissant suffisamment de solution de coloration pour garder la tranche d’hydrogel humide.
- Analysez immédiatement la tranche à l’aide d’un microscope confocal. Pour prévenir la phototoxicité et le photoblanchiment, minimisez la dose de photons appliquée en réduisant l’intensité et le temps d’excitation du laser. Les spectres d’excitation/émission des colorants décrits ci-dessus se trouvent dans le tableau 1.
- Pour obtenir une vue d’ensemble de la distribution cellulaire de la cellule dans l’hydrogel, capturez les sections z. Si des sections Z ont été prises pendant l’imagerie, générez des reconstructions 3D des tranches de tumeur d’hydrogel à l’aide du logiciel approprié. Ces reconstructions permettront une analyse approfondie de la distribution spatiale et de l’état cellulaire des cellules dans les tranches tumorales d’hydrogel.
- Suivez les instructions et le script fournis dans les fichiers supplémentaires 1 et 2 pour effectuer la segmentation et la reconstruction des cellules.
Résultats
Les tranches tumorales d’hydrogel contenant des cellules MCL ont été générées avec le protocole décrit ci-dessus. Les étapes du flux de travail pour l’impression 3D et la culture des tranches de tumeur d’hydrogel sont illustrées à la figure 1A. L’imprimante 3D utilisée a été modifiée pour l’impression FRESH par l’ajout d’un prolongateur de pousse-seringue tel que décrit dans Hinton et al.20 (Figure 1B). Jusqu’à cinq coupes ont été imprimées à la fois (figure 1C) et cultivées sur un support de filtre (figure 1D). Un milieu a été ajouté sous le support de filtre pour fournir un apport nutritif aux tranches de tumeur d’hydrogel. Une goutte de milieu a été ajoutée sur chaque tranche de tumeur d’hydrogel pour éviter qu’elles ne se dessèchent. La figure 1E montre une vue d’ensemble de cinq coupes de tumeur d’hydrogel cultivées sur un support de filtre, ainsi que des images en gros plan d’une tranche d’hydrogel. Pendant une période de culture de 3 jours, les tranches de tumeur d’hydrogel étaient stables et conservaient leur structure (Figure 2A). Directement après l’impression, des bulles d’air étaient présentes dans les tranches de tumeur d’hydrogel, mais elles ont disparu pendant la culture (Figure 2A).
La viabilité de la lignée cellulaire MCL Jeko-1 cultivée dans des tranches tumorales d’hydrogel (3D) par rapport aux cellules Jeko-1 cultivées en culture en suspension (2D) a été évaluée par un test d’exclusion au bleu de trypan (Figure 2B). Après 3 jours de culture, 80 % des cellules étaient viables, contre une viabilité initiale de 88 % des cellules Jeko-1 avant l’impression. Les cellules Jeko-1 cultivées en 2D ont maintenu la viabilité initiale de 88 %. Il n’y avait pas de différence significative entre les cellules Jeko-1 cultivées en 2D et en 3D. Pour évaluer si les cellules Jeko-1 prolifèrent dans les tranches d’hydrogel, le nombre moyen de cellules Jeko-1 par tranche d’hydrogel a été déterminé (Figure 2C). Alors que 5x105 cellules Jeko-1 étaient contenues dans chaque tranche directement après l’impression (d0), ce nombre a presque doublé pour atteindre 9,3x105 cellules après 3 jours de culture.
La distribution et l’état des cellules Jeko-1 cultivées en tranches d’hydrogel ont été évalués par imagerie par fluorescence en direct en quadrichromie (Figure 2D) directement après l’impression ou après 3 jours de culture. Après l’impression, des reconstructions 3D des tranches d’hydrogel Jeko-1 ont montré une distribution homogène des cellules. La majorité des cellules étaient positives pour la TMRM, un marqueur du potentiel de membrane mitochondriale22. Une minorité de cellules étaient positives pour l’activité de la caspase-3, un marqueur de l’induction de l’apoptose23, ainsi que pour le marqueur de cellules mortes PicoGreen21. Après 3 jours de culture, une augmentation du nombre de cellules a été observée parallèlement à la formation de grappes de cellules. La plupart des cellules sont restées TMRM positives, tandis que seules quelques cellules étaient positives pour l’activité de la caspase-3 ou du PicoGreen (figure 2C).
Pour analyser si les cellules MCL dans des tranches d’hydrogel répondent aux chimiothérapies, les cellules Jeko-1 cultivées soit en culture en suspension (2D), soit en tranches d’hydrogel (3D) ont été traitées avec le médicament chimiothérapeutique Doxorubicin, qui fait partie du traitement standard pour les patients atteints de LCM24. La structure globale des tranches d’hydrogel a été maintenue pendant le traitement à la doxorubicine (figure 3A). La viabilité des cellules Jeko-1 cultivées dans des tranches d’hydrogel a diminué en fonction de la dose en réponse au traitement à la doxorubicine. La CI50 de la doxorubicine dans les cellules Jeko-1 a été augmentée lorsque les cellules ont été cultivées dans des tranches d’hydrogel (IC50 = 5,8 μM) par rapport aux cellules Jeko-1 cultivées en culture en suspension 2D (IC50 = 2,0 μM ; Figure 3B). L’imagerie par fluorescence en direct en quatre couleurs a montré une réduction de la TMRM et une augmentation du signal PicoGreen dans les cellules Jeko-1 cultivées en tranches d’hydrogel en réponse au traitement à la doxorubicine, confirmant une réduction de la viabilité induite par le traitement. Les images obtenues à partir de l’imagerie par fluorescence en direct en quadrichromie ont été reconstruites en 3D, segmentées en fonction du signal des noyaux DRAQ5 et analysées à l’aide du script Python décrit dans le fichier supplémentaire 1. Un exemple de masque de segmentation est illustré à la figure supplémentaire 1. Le numéro de cellule identifié à partir du signal DRAQ5 a été utilisé pour déterminer le nombre total de cellules. Le nombre de cellules positives pour l’activité TMRM, PicoGreen et Caspase-3 a été utilisé pour identifier le pourcentage de cellules viables, mortes ou apoptotiques, respectivement. Les quantifications de la coloration par fluorescence vivante quadricolore de cellules Jeko-1 cultivées dans des tranches d’hydrogel pendant 3 jours avec ou sans doxorubicine 9 μM ont montré une viabilité comparable à celle de l’essai d’exclusion du bleu de trypan (tableau 2).
En plus des lignées cellulaires MCL établies, les cellules primaires MCL de trois patients MCL différents ont été cultivées soit en culture en suspension 2D, soit en tranches d’hydrogel 3D (Figure 4, Figure supplémentaire 2). Comme l’a vérifié un pathologiste, les trois LCM (patient 1-3) étaient de morphologie classique/commune avec des indices Ki67 de 20 % à 50 %. Les cellules primaires du MCL comprenaient tous les types de cellules isolées des ganglions lymphatiques des patients atteints du MCL et contenaient donc non seulement des cellules du MCL, mais aussi d’autres types de cellules immunitaires ou de cellules stromales. La viabilité des tranches primaires d’hydrogel du LCM a été évaluée par le test d’exclusion au bleu de trypan. Après 4 jours de culture, les cellules primaires du LCM dans les coupes d’hydrogel ont maintenu une viabilité de 43,6 % (45,7 % au jour 3) par rapport à une viabilité de base de 71,0 % avant l’impression (figure 4A). Cela représente une viabilité accrue par rapport aux cellules cultivées en suspension (2D), qui avaient une survie de 19,6 % après quatre jours de culture (28,4 % au jour 3). Cette viabilité a été visualisée par imagerie de fluorescence en direct en quatre couleurs, dans laquelle la plupart des cellules étaient TMRM positives et viables, tandis qu’une sous-population était positive pour l’activité de la caspase-3 et de PicoGreen, indiquant respectivement l’apoptose et la mort cellulaire (Figure 4B). Les données de quantification de la figure 4B sont présentées dans le tableau 2. Les cellules primaires de deux autres patients atteints de LCM ont montré une survie accrue des cellules lorsqu’elles étaient cultivées dans les tranches d’hydrogel (3D) par rapport à la culture en suspension 2D respective (Figure supplémentaire 1).
Figure 1 : Flux de travail de l’impression 3D de coupes de tumeurs d’hydrogel . (A) Flux de travail de l’impression 3D et de la culture de cellules dans des tranches de tumeurs d’hydrogel. (B) Configuration de l’imprimante utilisée pour la bio-impression 3D de tranches d’hydrogel dans un bain de support de gélatine. (C) Impression d’un plan dans le logiciel de l’imprimante 3D. Jusqu’à cinq tranches d’hydrogel ont été imprimées à la fois. (D) Représentation schématique de la culture en tranches d’hydrogel. Des tranches d’hydrogel ont été cultivées sur un support de filtre dans une plaque à 6 puits. Une goutte de milieu a été ajoutée sur chaque tranche d’hydrogel pour maintenir leur humidité. Jusqu’à cinq tranches d’hydrogel peuvent être cultivées sur un support de filtre. (E) Tranches d’hydrogel imprimées en 3D cultivées sur un support de filtre, comme le montre une image de synthèse ou des images en gros plan. Les barres d’échelle représentent 5 mm, 1 mm ou 200 μm comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Culture d’une lignée cellulaire de lymphome à cellules du manteau (LCM) dans des tranches d’hydrogel imprimées en 3D. (A) Gros plan d’une tranche d’hydrogel représentative contenant la lignée cellulaire MCL Jeko-1 après impression (j0) ou après 3 jours de culture (j3). La barre d’échelle représente 1 mm. (B) Viabilité des cellules Jeko-1 cultivées en suspension (2D) ou en tranches d’hydrogel (3D) pendant 2 jours, telle qu’évaluée par un test d’exclusion au bleu de trypan. La ± SD moyenne de trois expériences de bio-impression indépendantes est présentée. (C) le numéro de cellule Jeko-1 contenu dans chaque tranche d’hydrogel directement après l’impression (j0) ou après jusqu’à 3 jours de culture (j1-j3). La ± SD moyenne de trois expériences de bio-impression indépendantes est présentée. Aucune différence statistiquement significative n’a été observée (n.s., p > 0,05, test de Mann-Whitney). (D) Reconstruction tridimensionnelle de tranches d’hydrogel Jeko-1 le jour de l’impression (j0) ou après 3 jours de culture (j3). Le modèle a été généré à partir d’empilements z d’une imagerie de fluorescence 3D en direct en quatre couleurs. Les cellules vivantes sont représentées en rouge (TMRM), les cellules apoptotiques en jaune (activité enzymatique de la caspase-3), les cellules mortes en vert (PicoGreen) et les noyaux en bleu (DRAQ5). La barre d’échelle représente 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Traitement médicamenteux d’une lignée cellulaire de lymphome à cellules du manteau (LCM) dans des tranches d’hydrogel. (A) Gros plan d’une tranche d’hydrogel représentative contenant la lignée cellulaire MCL Jeko-1 traitée avec 3 μM de Doxorubicine pendant 3 jours (j3). La barre d’échelle représente 1 mm. (B) Les cellules Jeko-1 cultivées en suspension (2D) ou en tranches d’hydrogel (3D) ont été traitées avec des concentrations croissantes de l’agent chimiothérapeutique Doxorubicine pendant 2 jours. La viabilité des cellules a été évaluée par le test d’exclusion au bleu trypan. La ± SD moyenne de quatre expériences de bio-impression indépendantes est présentée. (C) Reconstruction tridimensionnelle de coupes d’hydrogel Jeko-1 traitées avec de la doxorubicine 9 μM (Doxo) pendant 3 jours (j3). Le modèle a été généré à partir d’empilements z d’une imagerie de fluorescence 3D en direct en quatre couleurs. Les cellules vivantes sont représentées en rouge (TMRM), les cellules apoptotiques en jaune (activité enzymatique de la caspase-3), les cellules mortes en vert (PicoGreen) et les noyaux en bleu (DRAQ5). La barre d’échelle représente 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Culture de cellules primaires MCL dans des tranches d’hydrogel imprimées en 3D. (A) Viabilité des cellules primaires du LCM cultivées en suspension (2D) ou en tranches d’hydrogel (3D) jusqu’à 4 jours, évaluée par un test d’exclusion au bleu trypan. La viabilité moyenne d’une expérience est démontrée. (B) Reconstruction tridimensionnelle de cellules primaires MCL cultivées en tranches d’hydrogel (3D) pendant 3 jours. Des empilements Z ont été générés à partir de tranches d’hydrogel colorées avec une coloration en direct quadrichromique et analysées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (CLSM). Les cellules vivantes sont représentées en rouge (TMRM), les cellules apoptotiques en jaune (activité enzymatique de la caspase-3), les cellules mortes en vert (PicoGreen) et les noyaux en bleu (DRAQ5). La barre d’échelle représente 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Tache | Mont-Royal | DRAQ5 | Substrat NucView405 Caspase-3 | PicoVert |
| Excitation/émission | 548 NM/574 NM | 647 NM/681 NM | 429 NM/ 469 NM | 488 NM/ 520 NM |
Tableau 1 : Maxima d’excitation/émission des colorants utilisés pour l’imagerie de fluorescence 3D en direct en quadrichromie.
| Échantillon | % des cellules | ||
| TMRM (Cellules viables) | PicoGreen (Cellules mortes) | Caspase-3 (cellules apoptotiques) | |
| Jeko-1 Ctrl | 83 | 23.6 | 18.3 |
| Jeko-1 Doxo 9 μM | 27.6 | 81.3 | 86.6 |
| Patient primaire du LCM 1 | 75.2 | 31.1 | 33.1 |
Tableau 2 : Quantification des reconstructions 3D de la coloration en direct quadricolore de coupes de tumeurs d’hydrogel cultivées. Des coupes tumorales d’hydrogel ont été cultivées pendant 3 jours et contenaient soit des cellules Jeko-1 cultivées avec ou sans traitement avec de la doxorubicine 9 μM, soit des cellules primaires MCL (patient 1).
Figure supplémentaire 1 : Identification de cellules à partir de reconstructions 3D de coloration vivante en quatre couleurs. Des reconstructions 3D d’une image confocale marquée avec DRAQ5 obtenues à partir (A) d’une coloration en direct en quadrichromie et (B) d’une image segmentée sur ce canal générée à l’aide du pipeline d’analyse d’imagerie Python. La barre d’échelle représente 200 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Supplément Figure 2 : Culture de cellules primaires MCL des patients 2 et 3 dans des coupes tumorales d’hydrogel.Viabilité des cellules primaires du LCM du patient (A) 2 ou du patient (B) 3 cultivées en suspension (2D) ou en tranches d’hydrogel (3D) pendant une période allant jusqu’à 4 jours, évaluée par un test d’exclusion du bleu de trypan. La viabilité moyenne d’une expérience est démontrée. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : Instructions pour l’analyse des reconstructions 3D obtenues à partir de la coloration en direct en quadrichromie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : Script Python pour l’analyse des reconstructions 3D obtenues à partir de la coloration en direct en quadrichromie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Codage supplémentaire Fle 1 : Fichier Stl. contenant le plan pour les coupes tumorales d’hydrogel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Les coupes tumorales d’hydrogel décrites dans ce protocole offrent un modèle MCL qui imite la structure des ganglions lymphatiques, permettant l’étude de la survie des cellules MCL et de la réponse aux médicaments dans un microenvironnement tumoral 3D généré par bio-impression.
Les méthodes de bio-impression les plus utilisées sont basées sur l’extrusion, où la bio-encre est éjectée à travers un système de distribution. Dans l’impression à jet d’encre, par exemple, les bio-encres sont rapidement réticulées après le dépôt pour former des structures 3D25. Cependant, cette approche présente des limites, notamment en termes de viscosité des matériaux utilisés et de capacité à empiler des couches. En revanche, la bio-impression 3D par extrusion à base de seringue intégrée, telle que la bio-impression FRESH utilisée dans ce protocole, applique une approche gel-in-gel. Cela permet d’imprimer des bio-encres à faible viscosité, comme le collagène, dans des constructions stables, ce qui permet d’imiter le microenvironnement tumoral complexe20,26. Alors que les imprimantes 3D spécifiquement développées pour la bio-impression peuvent être coûteuses, la méthode présentée ici offre un point d’entrée plus accessible. Il peut être adapté aux imprimantes d’extrusion standard avec des modifications relativement simples. Ces modifications peuvent être imprimées en 3D avec des filaments abordables, et les conceptions sont disponibles en tant que ressources open source, par exemple, par Hinton et al.20. Cependant, il est important de noter que la préparation du bain de support d’hydrogel pour la bio-impression FRESH est très sensible à la température et nécessite une attention particulière lors de la préparation du lisier.
Fréquemment, les modèles de tumeurs imprimés en 3D sont cultivés dans des systèmes flottants, dépourvus du gradient d’oxygène in vivo 25, ou dans des cultures de puces microfluidiques27, qui capturent un haut degré de complexité mais ont un faible débit et nécessitent une maintenance élevée. Ces obstacles peuvent être surmontés avec les tranches de tumeur d’hydrogel décrites ici. La configuration de la culture d’un maximum de cinq tranches de tumeur d’hydrogel sur une interface air-liquide est dérivée de la culture de tranches de tumeur découpées avec précision de tumeurs solides28. La membrane du support de filtre utilisé dans ce protocole est composée d’une membrane en polytétrafluoroéthylène (PFTE) avec des pores de 0,4 μm, qui permet l’échange de nutriments mais empêche la fixation cellulaire ou la migration cellulaire29. La culture sur la membrane PTFE fournit un support physique aux tranches pour maintenir leur stabilité et les empêcher de se rompre ou de se désintégrer. De plus, ils fournissent une interface air-liquide, fournissant de l’oxygène principalement à partir de l’air supérieur et des nutriments à partir du milieu situé en dessous du filtre30. Le système intègre ainsi les variations spatio-temporelles de l’apport en nutriments, de la prolifération cellulaire et de l’oxygénation, telles qu’elles peuvent se produire in vivo25. Cultivées dans les coupes tumorales d’hydrogel sur un support filtrant, les cellules primaires MCL ont maintenu une viabilité de plus de 40 % pendant 4 jours, ce qui était supérieur à la viabilité observée dans la culture en suspension 2D (Figure 3A, Figure supplémentaire 2). D’autres investigations devraient déterminer si une viabilité prolongée peut être obtenue par l’ajout de cytokines ou la co-culture avec des fibroblastes exprimant CD40L, comme cela a été décrit chez les sphéroïdes et les organoïdes de la tumeur du lymphome B primaire 6,19,30 ou les co-cultures de cellules MCL primaires avec les cellules L fibroblastiques exprimant CD40L14. L’incorporation de telles approches dans les coupes tumorales d’hydrogel devrait être envisagée pour améliorer la culture des cellules primaires MCL ainsi que la similitude avec le microenvironnement natif.
Les ganglions lymphatiques contiennent un réseau bien développé de fibres de la matrice extracellulaire. En raison de leur motif, ils sont connus sous le nom de fibres réticulaires. Principalement, ces fibres sont composées de collagène et de composants spécifiques à la membrane basale 31,32,33. Pour générer une matrice ressemblant à la situation in vivo dans les ganglions lymphatiques, la bio-encre utilisée pour générer les tranches de tumeur d’hydrogel est composée de collagène de type I et de Matrigel, qui se compose des quatre principales protéines ECM de la membrane basale laminine, du collagène IV, de l’entactine et du perlecan34. De plus, de l’alginate est ajouté à la bio-encre pour stabiliser les tranches de tumeur d’hydrogel, ce qui permet une culture prolongée et le transport d’un récipient à un autre à l’aide d’une spatule. L’essai de différents hydrogels contenant du collagène et de l’alginate a montré la viabilité cellulaire la plus élevée en combinaison avec une tranche d’hydrogel stable et durable lors de l’utilisation d’une bio-encre contenant 0,5 % d’alginate et 20 % de collagène (données non présentées). Outre les composants, le diamètre de la tranche de tumeur en hydrogel de 0,8 cm ressemble davantage au diamètre moyen des ganglions lymphatiques de 1 cm35. L’imagerie 3D en direct des tranches de tumeur d’hydrogel a en outre montré une distribution uniforme des cellules (Figure 2C).
Ici, la capacité de traiter les tranches d’hydrogel avec des médicaments a été démontrée par le traitement à la doxorubicine, qui fait partie de la thérapie R-CHOP (rituximab, cyclophosphamide, doxorubicine, vincristine, prednisone), une thérapie standard pour les sous-groupes de patients plus âgés atteints de LCM24. Par rapport aux cultures 2D, les influences du microenvironnement tumoral sur les effets du traitement peuvent être étudiées dans les tranches de tumeur d’hydrogel. Comme le montre la figure 3, les cellules Jeko-1 cultivées dans des tranches d’hydrogel étaient plus résistantes au traitement à la doxorubicine que les cellules cultivées en 2D. Cela est conforme aux observations selon lesquelles la matrice extracellulaire peut influencer les réponses aux médicaments et augmenter fréquemment la résistance aux médicaments en modulant la rigidité tumorale36, la communication cellule-cellule37 et l’administration de médicaments38. De plus, l’analyse par cytométrie en flux, ainsi que la coloration immunohistochimique ou par immunofluorescence multiplexe, peuvent donner des informations plus approfondies sur la réponse au traitement des cellules uniques dans les coupes tumorales d’hydrogel.
En conclusion, ce protocole décrit la génération et la culture de tranches de tumeurs d’hydrogel, qui représentent un modèle de ganglion lymphatique 3D imitant la structure tridimensionnelle native des ganglions lymphatiques. Il a le potentiel d’étendre l’application des cellules MCL à d’autres indications primaires du lymphome.
Déclarations de divulgation
Cette étude a été soutenue par la Robert-Bosch Stiftung et le ministère des Sciences, de la Recherche et des Arts du Bade-Wurtemberg (3R-Network BW).
Remerciements
Nous remercions Kerstin Willecke pour son excellente assistance technique et Yang Zhang pour son aide précieuse pour l’analyse d’images 3D.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| µ ;-slide 8 puits fond en verre | ibidi GmbH | 80827 | Lames à fond en verre utilisées pour l’imagerie en direct de tranches d’hydrogel |
| 10 fois par PBS | Carl Roth GmbH + Co.KG | 9150.1 | Composant Bioink |
| 10X RPMI-1640 Moyen | Sigma-Aldrich | R1145 | Composant Bioink |
| Seringue étanche au gaz de 2,5 ml modèle 1002 TLL | Hamilton | 81420 | Seringue pour bio-impression |
| Imprimante 3D extrusion, PrintrBot Simple | Printrbot | Auto-modifié pour permettre l’impression de bio-encres | |
| Plaque à 6 puits | Th. Geyer GmbH & Co.KG | 7696790 | Culture des tranches d’hydrogel |
| Systèmes de filtration sous vide sur bouteille, membrane PES, 500 ml, 0,22 & micro ; m taille des pores, 70 ; mm de diamètre de la membrane | Corning Inc. | 513-3355 | Filtration stérile des tampons |
| Chlorure de calcium déshydraté | Carl Roth GmbH + Co.KG | Réf. T885.2 | Composant du tampon de lavage et de la boue de gélatine |
| Collagène I de rat | Corning Inc. | CLS354249 | Composant Bioink |
| Logiciel Cura version 15.04.5 pour l’impression 3D | Ultimaker | Logiciels utilisés pour l’impression 3D | |
| DRAQ5 | Biostatus Ltd. | DR50050 | Coloration pour l’imagerie en direct de tranches d’hydrogel |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) sel disodique dihydraté | Sigma-Aldrich | E5134 | Composant du tampon de dissolution d’alginate |
| Compteur automatique de cellules EVE | Nano EnTek Inc. | 10027-452 | Compteur de cellules |
| Boîtes de Pétri bactériologiques Falcon avec couvercle, 35 mm de diamètre | Faucon | 351008 | Rempli de boue de gélatine pour former le bain de support pour la bio-impression |
| Tubes Falcon, 50 mL | Sarstedt AG & Co.KG | 62.547.254 | |
| Sérum de veau fœtal | Sigma-Aldrich | Réf. S0615 | Supplément de milieu de culture cellulaire |
| Gélatine de peau de porc | Sigma-Aldrich | G1890 | Composant principal de la suspension de gélatine |
| HEPES, acide libre, grade biologie moléculaire | Merck KGaA | NCA 7365-45-9 | Composant du tampon de lavage et de la boue de gélatine |
| Lignée cellulaire Jeko-1 MCL | ATCC | CRL-3006 | Lignée cellulaire MCL |
| Lingettes de précision KIMTECH Science | Société Kimberly Clark | 7551 | Utilisé pour extraire l’excès d’eau de la boue de gélatine et pour éliminer les gouttelettes de la buse de l’imprimante 3D |
| Logiciel LAS X Version 3.5.7.23225 | Leica | Logiciels utilisés pour les reconstructions 3D | |
| Leica TCS SP8 Microscope confocal à balayage laser | Leica | TCS SP8 | Microscope confocal pour l’imagerie en direct |
| Mason Jar Pinte régulière 16 oz | Société du bal | G001 | Pot dans lequel la bouillie de gélatine est préparée |
| Matrigel à facteur de croissance réduit (DFG) Matrice de membrane basale | Corning Inc. | 356231 | Composant Bioink |
| Insert de culture cellulaire Millicell, 0,4 & micro ; M Taille des pores | Merck KGaA | PICMORG 50 | Support de filtre pour tranches d’hydrogel |
| Substrat NucView 405 Caspase-3, 1 mM dans 1x PBS | Biotium | 10405 | Coloration pour l’imagerie en direct de tranches d’hydrogel |
| Mélangeur Oster Professional Series | Oster | BPST02-B00 | Mélangeur pour générer de la boue de gélatine |
| Pénicilline/Streptamamycine | Gibco | 15140163 | Supplément pour milieu de culture cellulaire MCL |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-Reagenzien | Invitrogen | Réf. P7589 | Coloration pour l’imagerie en direct de tranches d’hydrogel |
| Rotina 35 R | Hettich | 24573 | Centrifugation des cellules |
| Centrifugeuse ROTINA 38/38R | Hettich | Z720109 | Centrifugation de boue de gélatine |
| RPMI-1640+GlutaMAX | Gibco | 61870036 | Base du milieu de culture pour cellules MCL |
| Alginate de sodium | Coopération FMC | GQ9109901 | Composant Bioink |
| Chlorure de sodium | Merck KGaA | 1.06404 | Composant du tampon de dissolution d’alginate |
| Citrate de sodium | Carl Roth GmbH + Co.KG | 3580.1 | Composant du tampon de dissolution d’alginate |
| Canules d’application émoussées Sterican 21G 0.8x22 mm | B.Braun | 9180109 | Buse pour l’impression 3D |
| Tétraméthylrhodamine-ester-méthylester-perchlorat (TMRM) | Sigma-Aldrich | Réf. T5428 | Coloration pour l’imagerie en direct de tranches d’hydrogel |
| Bleu trypan, 0,4 % | Sigma-Aldrich | Réf. T8154 | Coloration pour l’analyse de viabilité |
| Thermomètre étanche | VWR | 620-2099 | Thermomètre pour surveiller la température de la suspension de gélatine |
Références
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Réimpressions et autorisations
