Method Article

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie et des interactions avec les synapses dans la rétine murine malade

DOI:

10.3791/68420

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, San Francisco, 2Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

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Cet article démontre une méthode pour visualiser et quantifier la motilité et le contact de la microglie avec les points postsynaptiques de la rétine à l’aide de la microscopie confocale à disque tournant.

Abstract

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La microglie est constituée par les macrophages résidents du système nerveux central (SNC) qui réagissent aux infections et lésions tissulaires. En plus de leur rôle dans l’inflammation, la microglie joue un rôle dans le raffinement des circuits grâce à la taille synaptique. Cependant, les mécanismes de la taille synaptique dans la neuroinflammation et la neurodégénérescence restent inconnus. Dans ce protocole, nous utilisons un modèle d’explant rétine de souris pour étudier la dynamique de la microglie ex vivo. Pour examiner la motilité des microglies et leurs interactions avec les protéines postsynaptiques, nous étiquetons les synapses avec AAV-PSD95-RFP et enregistrons des vidéos en accéléré de microglies mobiles colocalisées avec des protéines postsynaptiques à l’aide de la microscopie confocale à disque rotant. Nous réalisons ensuite des reconstructions de surface et de points de la microglie et du PSD95 à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image. Des données telles que la longueur du déplacement de la microglie, la vitesse du processus et le contact avec les points postsynaptiques peuvent ensuite être extraites de ces surfaces pour comprendre le comportement de la microglie, tant dans les états homéostatics qu’après une lésion neuronale. Ce protocole peut être utile pour examiner le rôle de la microglie dans la taille synaptique des maladies neurodégénératives rétiniennes.

Introduction

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La fonction des circuits et l’homéostasie reposent sur une activation synapsienne fortement régulée et d’autres interactions uniques entre différents typescellulaires 1. Servant de macrophages résidents du système nerveux central (SNC), les microglies constituent une population non neuronale de la rétine qui joue un rôle unique dans la taille synaptique. Lors du développement du SNC, la microglie taille les synapses non fonctionnelles ou faibles pour affiner les circuitsneuronaux 2. La microglie dans le cerveau en développement étudie son environnement et est préparée à un rôle neuroprotecteur pendant les périodescritiques 3. Dans le développement des systèmes visuels, la microglie est un régulateur clé dans le développement des neurones corticaux et des interneurones, en plus de présenter des changements morphologiques lors des périodes critiques de remodelagesynaptique 4. De même, dans la rétine en développement, la microglie nettoie les cellules apoptotiques pour laisser place à de nouvelles connexions synaptiques, confirmé par une régulation à la hausse du marqueur homéostatique P2Ry12 lors de ces événements declairiage 5. Cependant, des découvertes récentes soulignent que la microglie pourrait ne pas jouer un rôle définitif dans l’affinement des circuits neuronaux dans le système visuelen développement 6, soulignant qu’il existe une controverse concernant le rôle de la microglie dans le développement des circuits visuels.

Dans les contextes de blessure, la microglie modifie la morphologie en un état actif et peut jouer un rôle neurodégénératif. Par exemple, la microglie dans les modèles atteints de la maladie d’Alzheimer a montré une augmentation de l’englussement des plaques amyloïdes-bêta7 et des marqueurs synaptiques tels que SPH et PSD95-8. Dans la neurodégénérescence rétinienne, de nombreux groupes de recherche ont trouvé des microglies avec du matériel synaptique englouti, mais aucune preuve claire d’une englution active de synapsesintactes 9,10,11,12,13. Par exemple, He et al. ont constaté que la microglie augmente en nombre et augmente le volume de matière synaptique engloutie dans un modèle de rétinitepigmentaire 9, mais il n’est pas clair s’il y avait une phagocytose des synapses intactes ou une élimination des débris. De plus, les classifications microgliales traditionnelles — telles que « repos vs. activé » ou « M1 vs. M2 » — sont trop simplifiées et de plus en plus inexactes au vu des analyses modernes. Les microglies existent dans un gradient d’états, pas dans des catégoriesdiscrètes 12. Ainsi, Paolicelli et al. ont appelé à un passage des classifications binaires dépassées vers une nomenclature plus nuancée et rigoureusement définie pour les états microgliaux afin de mieux comprendre et définir la morphologie et l’activité desmicroglies 12. Ainsi, des stratégies pour évaluer la fonction de la microglie ex vivo et in vivo augmenteront la capacité du domaine à discerner les états et l’activité de la microglie dans des contextes de développement et de maladie.

Bien que des stratégies existent pour étudier la fonction de la microglie à la fois ex vivo et in vivo, l’imagerie live ex vivo présente plusieurs avantages. Premièrement, la clarté cornéenne ou le développement de la cataracte ne freineront pas l’imagerie rétinienne, créant une visualisation claire des processus minuscules et des points synaptiques. De plus, l’imagerie in vivo nécessite plus de compétences techniques pour être mise en place, ce qui rend les préparations ex vivo à plus grand débit, ce qui permet de capturer plus d’animaux par expérience. Malgré les bénéfices théoriques que l’imagerie in vivo peut offrir, une puissance laser élevée (100-230 μW) est nécessaire pour capturer la motilité du processus microglial pour l’imagerielongitudinale 14,15. Cependant, l’imagerie ex vivo de la microglie avec une puissance laser plus faible et un milieu d’imagerie adéquat peut offrir la même qualité d’imagerie qu’en vivo avec la bonne préparation, bien que le tissu ne soit plus en place.

Nous avons démontré que la microglie augmente en nombre, en complexité et en mouvement des processus après une élévation transitoire de la pression intraoculaire (IOP)de 10. Dans les tissus fixés, cette microgliose entraîne une colocalisation accrue avec les protéinessynaptiques 10. Des travaux antérieurs ont également démontré une perte précoce de synapses et une dégénérescence dendritique des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) dans le modèle d’hypertension oculaire induite par laser murin (LIOH) et d’autres modèles neurodégénératifs 10,16,17,18,19,20. Cependant, on ignore encore s’ils jouent un rôle actif dans l’élagage des synapses ou un rôle plus passif dans l’élimination des débris cellulaires, y compris les synapses démontées. Comme le désassemblage des synapses est un des premiers signes de la neurodégénérescence, comprendre la dynamique des microglies et leur rôle dans le désassemblage des synapses estcrucial 8,10. Ici, nous utilisons l’imagerie en temps réel pour comprendre la dynamique de la microglie et leur interaction avec la protéine de densité postsynaptique excitatrice (PSD95) sur les dendrites des RGC.

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Protocol

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Les animaux étaient hébergés à l’Université de Californie à San Francisco, sous des cycles lumineux de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité, recevant de l’eau et un régime alimentaire standard à libitum, sauf indication contraire. Toutes les procédures ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie, San Francisco. Voir le tableau des matériaux pour les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole. Un aperçu de la procédure expérimentale, de l’injection intravitréenne à l’imagerie et à l’analyse, est présenté à la Figure 1.

1. Production et efficacité du virus AAV-PSD95-TagRFP

  1. Construisez AAV-PSD95-tagRFP en prenant la séquence PSD-95pTagRFP (plasmide d’Addgene #52671 ; RRID :Addgene_52671) et l’insérer en aval du promoteur CMV dans AAV-CMV-GFP après avoir retiré la GFP (plasmide d’Addgène #67634 ; RRID : Addgene_67634).
  2. Préparez le virus à l’aide d’un HEK293T triple transfecté, purifié avec du PEG/chloroforme, puis concentré à un titre de 1012 ip/mL (comme décrit par Negrini et al.).21.
    REMARQUE : Cette méthode de production virale produit généralement un titre plus faible que l’ultracentrifugation, mais pour ces expériences, il est souhaitable d’avoir des cellules21 peu infectées. La version capside/sérotype utilisée dans ces expériences était de 7m8 (plasmide d’Addgene #64839 ; RRID : Addgene_64839).
    1. Testez l’efficacité de l’AAV avant de procéder au protocole d’imagerie complet.
      REMARQUE : Les lecteurs qui mettent en œuvre ce protocole doivent viser un étiquetage clairsemé des RGC, car l’objectif est d’identifier et d’isoler les dendrites individuelles des RGC.
  3. Vérifiez la transfection réussie puis fixez la rétine à 2 % de PFA dans 1x ACSF. Pour les protéines synaptiques, vérifiez le signal au microscope confocal à 63x afin de vérifier la résolution claire du marquage fluorescent.
    REMARQUE : La concentration plus faible de fixation aide à préserver le marquage des protéines synaptiques. Si l’AAV utilisé ne concerne pas les composantes synaptiques, les lecteurs peuvent choisir d’utiliser un PFA à 4 % à la place.

2. Élevage de souris et injections intravitréennes AAV-PSD95-TagRFP

  1. Croiser des souris albinos CD-1 mâles et femelles (souche 022) avec B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (souche 005582) pour produire des souris albinos CD-1 avec des microglies exprimant EGFP. Attendez au moins quatre générations de rétrocroisements pour utiliser les souris hétérozygotes Cx3cr1 mâles et femelles dans les expériences. Maintenir et rafraîchir la souche après 10 générations pour revenir sur le fond CD-1 afin d’éviter la dérive génétique.
  2. Anesthésiez les animaux (P30-P60) en utilisant une anesthésie isoflurane via une chambre d’induction utilisant un anesthésique à 3-5 % d’oxygène avec un débit de 1 L/min d’oxygène. Placez l’animal sur un stéréomicroscope, tout en veillant à ce que l’isoflurane soit administré en continu via un cône nasal. Pour confirmer que l’animal est anesthésié, pincez l’orteil au moins 3 fois pour confirmer.
  3. Ajoutez une goutte de proparacaïne à 0,5 % avant d’injecter l’AAV. Injectez lentement 2 μL d’AAV-PSD95-RFP par voie intravitée dans les deux yeux au niveau du limbus superotemporal à l’aide d’une seringue 26s G 10 μL. Retirez lentement l’aiguille pour éviter le reflux de l’AAV à travers le site d’injection. Appliquez une pommade antibiotique sur les yeux après l’injection.
  4. REMARQUE : L’aiguille ne doit pas traverser plus de la moitié de la circonférence de la chambre vitrée. Ce faisant, la rétine et le cristallin peuvent être endommagés par la pointe de l’aiguille, entraînant une transfection irrégulière voire infructueuse. Le développement ou une hémorragie de cataracte est indicatif d’une technique d’injection défaillante.
  5. Après l’injection, vérifiez que les animaux sont alertes avant de les remettre dans leurs cages et chambres d’origine. Si un animal présente des douleurs après l’injection, administrez de la buprénorphine par injection intrapéritonéale. Attendez 3 semaines pour l’expression de l’AAV. Si un modèle inducteur est utilisé pour augmenter la pression intraoculaire (ou effectuer d’autres manipulations), attendez 3 semaines avant d’induire une pression intraoculaire élevée dans un œil, en utilisant l’œil controlatéral ou les yeux d’un animal naïf comme témoin.

3. Euthanasie et montage plat rétinien

  1. Préparer une solution fraîche 1x de liquide céphalorachidien artificiel (ACSF, pH 7,4) dans 1x PBS contenant les composants suivants en mM : 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgCl2,6H 2O, 2,5 CaCl2,2H 2O, 1NaHPO 4, 11 glucose et 20 HEPES.
  2. Oxygénez la solution pendant au moins 15 minutes avant de l’utiliser pour une dissection aiguë. Connectez le tuyau à une bouteille d’oxygène, et placez un bouchon avec un trou au centre pour empêcher le gaz de s’échapper.
  3. Euthanasiez la souris avec au moins 1 mL d’anesthésie isoflurane dans une petite chambre d’induction, suivie d’une luxation cervicale. Marquez le côté nasal de la cornée avec un marqueur avant l’énucléation afin que la localisation de la rétine puisse être suivie tout au long de l’expérience.
    1. Pour énucléer les yeux injectés par microperles ou laser, effectuez une péritomie conjonctivale limitée et placez les ciseaux derrière l’œil pour disséquer l’œil à la base du nerf optique. Cela permet à l’œil délicat de rester intact.
  4. À l’aide d’un microscope de dissection, percez un petit trou avec une aiguille de 23 G ou 25 G dans la cornée, ce qui permet à l’ACSF oxygéné de perfuser l’œil. Insérez des ciseaux dans ce trou pour faire une coupure fiduciaire à l’extrémité nasale.
  5. Coupez le reste de la cornée et de l’iris au niveau du limbe.
  6. Enlève l’iris et la lentille. Si la rétine colle au cristallin, séparez-la à l’aide d’une pince.
  7. Séparez la rétine de la sclère en utilisant des pinces pour disséquer doucement l’EPR et la rétine neuronale.
  8. Placez la rétine sur le côté non grillé d’un papier filtre à membrane Mixed Cellulose Esters (MCE) pour une visualisation et une imagerie claires.
  9. Réalisez de petites coupures relaxantes dans la rétine aux trois autres quadrants, la plus longue étant la coupe nasale pour suivre la localisation rétinienne.
    REMARQUE : La rétine doit ressembler à un trèfle à quatre feuilles.
  10. Transférez la rétine du papier filtre sur une lingette de laboratoire. Utilisez une goutte d’ACSF pour humidifier la rétine, puis utilisez la lingette pour sécher le papier filtrant. Répétez pendant au moins 8 à 10 gouttes pour que la rétine adhère au papier filtrant.
  11. Placez la rétine dans une chambre d’oxygénation tout en disséquant l’œil controlatéral.
  12. Une fois prêt à imager, séchez le papier filtre comme mentionné à l’étape 3.10 et inversez la rétine sur une boîte de Petri Matek. Alourdissez la rétine avec des billes métalliques ou un anneau. Ajoutez 3 à 5 gouttes d’ACSF.
    REMARQUE : Les petites billes métalliques, comme celles provenant d’un bain de perles métalliques ou d’un anneau, sont de taille et de poids suffisantes pour éviter la dérive sans perturber l’intégrité rétinienne.
  13. Fabriquez un anneau en prenant un fil d’acier et des cordes en nylon tendues, en collant et en ajoutant un poids pour obtenir un anneau avec des ficelles parallèles fixes et tendues.
    1. Enroulez le fil autour d’un cylindre de 1/2 pouce de diamètre et tirez fermement avec une pince. Coupez chaque anneau du cylindre et aplatissez-le entre un étau.
    2. Ponce l’anneau sur une face pour qu’il ait un côté rugueux et plat. Étirez des ficelles en nylon au-dessus de l’ouverture d’une bouteille de 1 à 2 pouces de diamètre, et maintenez-les en place à l’aide d’élastiques.
    3. Placez l’anneau sur les cordes en nylon et collez-le soigneusement sur les cordes en nylon en appliquant de petites quantités de colle le long du périmètre intérieur de la bague. Ensuite, placez un poids léger sur la bague, par exemple une pièce de pièce ou un fil métallique fin, pour maintenir la bague en place.
    4. Après séchage, coupez les cordes en nylon du bord extérieur de l’anneau à l’aide de ciseaux de précision. Le résultat est des cordes parallèles fixes tendant le diamètre de l’anneau.
    5. Si la densité des cordes en nylon est trop élevée à l’intérieur de l’anneau, coupez des cordes individuelles avec des ciseaux à ressort de microdissection pour les adapter aux besoins de l’expérience.
      REMARQUE : Le processus de dissection et de montage ne devrait prendre que ~5 minutes. Plus le tissu met rapidement à être placé dans des conditions physiologiques équilibrées ex vivo, plus le tissu est sain.

4. Acquisition de confocales du disque tournant

REMARQUE : Allumez la chambre d’humidification à 5 % deCO2 et faites-la fonctionner au moins 1 heure avant l’imagerie. Permettre au système et à l’échantillon d’atteindre l’équilibre thermique aidera à réduire la dérive.

  1. Commencez à scanner l’oculaire à 10x pour vous concentrer sur la microglie. Lors du balayage des tissus pour les zones à imager, utilisez le canal microglial comme référence, et concentrez-vous uniquement sur les microglies dont les points synaptiques brillants sont colocalisés (à moins de 10-20 μm). Comme le marquage de l’AAV n’est pas homogène dans tout le tissu, on scanne les zones dont la microglie et les points sont colocalisés dans le même plan. Une fois qu’une zone répondant à ces critères a été localisée, passez à 60x pour la mise au point, puis en mode caméra en cliquant sur le bouton de l’appareil photo .
    1. En utilisant le logiciel du système d’imagerie, faites un clic droit sur l’écran pour trouver la navigation xy. Un écran d’aperçu apparaîtra pour scanner le tissu en créant un cadre de 3 x 3, 5 x 5, ou une taille personnalisée pour cerner les zones optimales. Utilisez la taille d’image 3 x 3 ou 5 x 5 et l’écran avec un canal de référence pour éviter le photoblanchiment continu.
      REMARQUE : Pour ce protocole, nous avons utilisé le canal microglie.
  2. Photographiez rapidement la rétine montée à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant avec un objectif 60x (NA 1,49).
  3. Pour prévisualiser l’échantillon, faites un clic droit sur l’écran, sélectionnez Live, puis cliquez sur le bouton d’ajustement automatique afin que le système puisse ajuster la vue en fonction des LUTs en cours. Pour ajuster les réglages du laser, sélectionnez d’abord chaque canal individuellement et ajustez la puissance et l’exposition du laser selon les besoins. Ensuite, faites un clic droit sur le fluorophore pour Assigner les paramètres au microscope et enregistrez les paramètres personnalisés, car le logiciel ne les sauvegarde pas lors du passage à une autre chaîne.
    1. Passez au canal suivant et ajustez si besoin. Faites un clic droit sur le fluorophore pour enregistrer les paramètres. Si vous obtenez plusieurs chaînes dans la même image, entrez les mêmes valeurs utilisées après avoir aperçu chaque canal individuellement. Faites un clic droit sur le fluorophore pour sauvegarder les paramètres.
    2. Pour l’acquisition multi-canaux, sélectionnez les canaux d’intérêt sous l’onglet Lambda . Pour l’imagerie en direct, combinez tous les canaux en un seul canal pour capturer rapidement les mouvements fins de la cellule d’intérêt afin de permettre que chaque canal soit acquis simultanément, plutôt que séparément, ce qui peut créer un décalage dans le timelapse selon la vitesse de la cellule.
  4. Poursuivez l’acquisition d’un timelapse pour la durée souhaitée.
    1. Dans l’onglet temps en bas à gauche, entrez un timelapse de 5 à 10 minutes pour le temps avec un intervalle de 20 s.
    2. Dans l’onglet paramètres d’acquisition à droite, réglez la résolution de l’image à 608 x 832 avec une taille de pixel de 0,12 μm.
    3. Collectez les images à 10 à 20 μm en utilisant une taille de pas de 0,3 μm afin d’assurer une résolution acceptable des processus microgliaux fins et des points synaptiques le long de l’axe z. Pour garantir un suivi des cellules efficace, maintenez l’intervalle de temps entre les images à 20 à 30 s.
      REMARQUE : En raison de la fragilité du tissu ex vivo, il est recommandé d’imager d’abord la rétine expérimentale et pas plus d’une heure. Cela permet de normaliser l’état de l’œil témoin controlatéral, qui devrait se trouver dans une chambre oxygénée lors de l’imagerie de la première rétine.
  5. Utilisez ce protocole pour imager les couches les plus superficielles de la rétine. En acquérant des laps de temps supérieurs à 20 μm, il devient plus difficile de capturer le mouvement fin du procédé durant les intervalles de 20 s. Par conséquent, seules les microglies d’image qui tiennent dans la pile de 20 μm.

5. Suivi de l’analyse et exportation des données

  1. Rendu de surface pour la microglie
    1. Convertissez le fichier timelapse au format IMS à l’aide du logiciel de conversion de fichiers. Entrez les tailles de voxels suivantes en fonction des propriétés d’image acquises à l’étape 4.2 : x = 0,1272423 micron, y = 0,1272423 micron, z = 0,3 micron.
    2. Une fois lancé, le logiciel d’analyse commencera dans Arena. Cliquez sur le dossier Observer pour ouvrir le fichier précédemment converti. Assurez-vous que l’image est en vue 3D.
    3. Pour détecter des microglies individuelles entières, cliquez sur l’icône de surface bleue dans la barre d’objets d’outils. Sélectionnez les trois dernières options dans les paramètres de l’algorithme : Suivre les surfaces (sur le temps), Classifier les surfaces et Statistiques objet-objet. Cliquez sur le bouton de lecture bleu pour passer à l’étape suivante.
      1. En cas de multiples microglies, sélectionnez Segmenter uniquement une région d’intérêt (ROI) pour garantir l’existence de microglies individuelles dans un objet de surface. Réglez les paramètres x, y et z en conséquence pour ne former qu’une surface des microglies individuelles d’intérêt.
    4. Sélectionnez le canal pour lequel un rendu de surface sera créé. Si désiré, sélectionnez Lisse pour lisser la création de surface et utilisez un rapport 1:1 - 1,25 par rapport à la taille voxel de l’image. Par exemple, si l’image a une taille voxel de 0,12 x 0,12 x 0,3 μm, réglez le détail de la surface à 0,15 - 0,16 μm. Sous seuil, sélectionnez Segmentation par apprentissage automatique pour entraîner le logiciel à détecter les cellules d’intérêt.
      REMARQUE : Cette prochaine étape consiste à transmettre des données d’entraînement à Imaris AI via la segmentation par apprentissage automatique.
    5. Dans la section Données d’entraînement, observez les deux outils pinceau : Arrière-plan (pour détecter l’arrière-plan) et Premier plan (pour détecter le signal réel de l’échantillon). Dessinez les coups de pinceau en sélectionnant le pinceau désiré et en utilisant Maj + Clic gauche . Assurez-vous que Interpoler Affichage est sélectionné dans Paramètres. Sélectionnez Entraîner et Prédire pour entrer les données d’entraînement des coups de pinceau réalisés.
      REMARQUE : Donner plus de six coups entraîne un temps de traitement plus long pour l’IA et une capture imprécise de la cellule.
      1. Utilisez le pointeur jaune au centre pour vous déplacer à travers la pile z. Dessinez plusieurs coups de pinceau à travers les plans x, y et z, ainsi que dans quelques (pas tous) périodes du timelapse. Fais 3 à 5 coups de pinceau courts par entrée, car l’IA apprend mieux avec de petits morceaux d’information à la fois. Ajustez cette étape de manière itérative à chaque entrée jusqu’à ce qu’une surface précise de la cellule soit créée.
      2. Sélectionnez le rectangle jaune pour basculer entre l’affichage d’entraînement et la surface réelle créée en guise de vérification finale. Vérifiez également pendant le temps que la surface représente fidèlement la cellule.
    6. Une fois le rendu de surface précis obtenu, on passe à l’étape suivante. Désélectionnez les objets séparés.
    7. Ajustez le nombre de voxels dans l’histogramme. Déplacez le seuil pour qu’il enlève les petits objets non connectés à la surface principale.
      REMARQUE : Cette étape sert à éliminer les petites surfaces indésirables créées à cause du bruit de fond. L’objectif est d’éliminer toutes les surfaces non connectées au corps cellulaire principal d’intérêt.
    8. Ensuite, modifie la surface selon les besoins. Nettoyez manuellement tous les objets qui ne font pas partie de la surface principale ou qui ne coupent pas les bords avec l’outil ciseaux selon les besoins.
    9. Si désiré, fixez un seuil d’espaces autorisés qui peuvent toujours être associés à l’objet. Sélectionnez l’algorithme de suivi de la cellule en mouvement.
      REMARQUE : Le mouvement autorégressif est l’outil le plus couramment utilisé pour le suivi cellulaire, car il suit le mouvement continu tout au long du timelapse.
      1. La distance maximale et la taille maximale de l’écart sont des nombres définis par l’utilisateur qui fixent des points significatifs dont la surface peut s’écarter. Fixez une distance maximale d’écart de 0,96 μm et une taille maximale d’écart de 3 (réglages par défaut).
    10. De la même manière que les objets de surface ont été filtrés à l’étape 5.1.7, des pistes de filtrage qui ne sont pas associées à la surface principale. Cela est également ajusté par un histogramme. Définissez où fixer le seuil en cherchant quand de petites pistes ponctuelles ne durant pas plus de cinq périodes sont retirées des ajustements du filtre.
    11. Ensuite, mettez en place des classifications si vous le souhaitez. Par exemple, catégoriser la longueur de déplacement entre 0 - 1 μm et 1+ μm pour déterminer un petit mouvement de procédé ou un déplacement significativement important du processus ou de la cellule.
    12. Enfin, apposez des étiquettes appropriées sur certains événements en utilisant les classifications de l’étape précédente.
      REMARQUE : Cette étape est mieux utilisée une fois que des taches ont été générées pour le signal postsynaptique.
  2. Classification ponctuelle pour PSD95
    1. Pour détecter des microglies individuelles entières, cliquez sur l’icône de surface bleue dans la barre d’objets d’outils. Sélectionnez les trois dernières options dans les paramètres de l’algorithme : Suivre les surfaces (sur le temps), Classifier les surfaces et Statistiques objet-objet. Cliquez sur le bouton de lecture bleu pour passer à l’étape suivante.
    2. Sélectionnez le canal source du marqueur synaptique. Désactivez le slicer et toutes les autres chaînes pour visualiser uniquement le PSD95. Utilisez le bouton ctrl et l’outil de sélection du pointeur pour estimer le diamètre xy du puncta.
      1. Choisissez quelques points brillants qui durent tout au long du timelapse (taille variant entre 0,6 μm et 1,2 μm).
      2. Désactivez la soustraction en arrière-plan. Si l’image nécessite une soustraction de fond, utilisez l’outil de soustraction de fond sous Traitement d’image avant de traiter le timelapse.
    3. Ensuite, ajoutez un filtre basé sur la qualité des spots. Faites glisser l’histogramme de façon à ce que tous les points PSD95 soient capturés avec précision tout au long du timelapse.
      REMARQUE : La qualité dépend de l’intensité du centre duspot 9. Ce filtre capture le plus précisément le signal réel de PSD95, comparé au nombre de filtres voxels ou de diamètre.
    4. Ensuite, supprimez les taches générées par le bruit en utilisant l’étape d’édition. Basculez entre le curseur cube et le curseur cercle pour supprimer respectivement des points singuliers ou multiples, qui n’apparaissent que pendant 1 à 2 périodes à cause du bruit.
    5. Si désiré, fixez un seuil d’espaces autorisés qui peuvent toujours être associés à l’objet. Sélectionnez l’algorithme de suivi approprié pour le marqueur synaptique.
      1. La distance maximale et la taille maximale de l’écart sont des nombres définis par l’utilisateur qui fixent des points significatifs dont les taches peuvent s’écarter. Fixez une distance maximale d’écart de 14,6 μm et une taille maximale d’écart de 3 (réglages par défaut).
    6. De la même manière que les objets ponctuels ont été filtrés à l’étape 5.2.3, des pistes de filtrage qui ne sont pas associées à des points distincts. Cela est également ajusté par un histogramme. Pour définir où fixer le seuil, cherchez quand les petites pistes d’objets sont supprimées.
    7. Établissez des classifications si vous le souhaitez. Par exemple, distinguez les points engloutis, en contact ou non contactés en utilisant la classification de la Distance la Plus Courte à la Surface . Englobé comme un point < 0 μm à la surface, contacté entre 0 et 0,5 μm de la surface, ou non contacté à 0,5+ μm de la surface.
    8. Enfin, apposez des étiquettes appropriées sur certains événements en utilisant les classifications de l’étape précédente.
  3. Une fois que les surfaces et les taches représentent fidèlement la microglie et les points d’intérêt, exportez toutes les statistiques de chaque objet sous l’onglet statistiques . Assurez-vous que les statistiques détaillées sont extraites, ce qui inclura la longueur de déplacement, la vitesse et les événements de contact classifiés.
    1. De nombreuses statistiques, telles que la surface, le volume, la longueur de déplacement et la vitesse, proviennent d’Imaris. Exportez la longueur et la vitesse de déplacement de surface pour définir la dynamique de la microglie dans l’expérience.
      1. Définissons la longueur de déplacement comme la distance entre la position initiale et la position finale de la surface, mesurée en μm22.
      2. Définissons la vitesse comme la vitesse instantanée de la surface d’un intervalle de temps à l’autre, mesurée en μm/s 22.
        REMARQUE : Les événements de contact sont un phénomène décrit par les auteurs comme des points postsynaptiques intacts partageant une distance de 0 μm entre les microglies individuelles pendant au moins cinq périodes cohérentes dans le timelapse.

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Results

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La microglie des rétines murines CX3CR1-GFP a été imagée à l’aide du protocole décrit. Les souris variaient de P30 à P60 au moment de l’injection AAV-PSD95-RFP, et au moins 21 jours s’étaient écoulés pour permettre l’expression de l’AAV. Des images représentatives de la microglie et de leurs interactions avec les points PSD95 avant et après analyse sont présentées dans la Figure 2. Pour induire l’activation de la microglie, n...

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Discussion

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Ce protocole permet de visualiser et de suivre l’interaction individuelle de la microglie avec les sites postsynaptiques le long des dendrites des RGC. Dans une maladie neurodégénérative telle que le glaucome, la microglie colocalise avec les synapses de la couche plexiforme interne (IPL) de la rétine. Le rôle de la microglie dans le désassemblage des synapses n’est pas bien compris. Cependant, la microglie peut contribuer par plusieurs mécanismes potentiels, notamment l’engloutissement ...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

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PSD-95pTagRFP était un cadeau de Johannes Hell (plasmide Addgene #52671 ; RRID : Addgene_52671), tandis que la version capside, 7m8, fut un cadeau de John Flannery et David Schaffer (plasmide d’Addgene #64839 ; RRID : Addgene_64839). Nous tenons à remercier Aparna Lakkaraju de nous avoir permis d’utiliser le microscope à disque tournant de leur laboratoire et Nilsa La Cunza pour les conseils en imagerie en direct. Nous tenons également à remercier Felice Dunn, Annika Balraj et Luca Della Santina pour leurs discussions et commentaires utiles sur ce manuscrit. Nous remercions Suling Wang pour son aide dans l’analyse des données sur Imaris. Ce travail a été financé par le NIH-NEI EY028148 et EY034973 à Y.O., la bourse ARVO David L. Epstein à Y.O., et NIH-NEI EY034973-S1 à C.F.. Cette recherche a également été soutenue, en partie, par la ressource partagée UCSF Vision Core du NIH-NEI P30 EY002162/EY037668, ainsi que par une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, New York, NY. La figure 1 a été créée le biorender.com.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aiguille calibre 25Alcon8065420920
26s Écartement 10 & micro ; L SyringueHamilton701RNWG
7m8Addgene64839http://n2t.net/addgene:64839
Fil polyvalent en acier inoxydable 304Matériaux avancés de StanfordSS3368Fil d’acier pour fabriquer des anneaux
Chlorure de calcium hexahydrateSigma-AldrichC5080-500G
Dissection MicroscopeAmscopeDisséquer et monter les rétines
Ciseaux de dissectionFST15024-10
D-(+)-glucoseSigma-AldrichG7528-250G
PincesDumont11252-21
HEPESSigma-AldrichH3375-500G
Imaris 10.0.2Oxford InstrumentsLogiciels d’analyse
Convertisseur de fichiers ImarisOxford Instruments
Contrôle du gel Loctite Super Glue UltraLoctite1363589Colle pour fabriquer des anneaux
Chlorure de magnésium hexahydratéSigma-AldrichM9272-100G
Papier filtre à membrane MCE (13 mm)MilliporeHABG013000,45 & mu ; m Taille des pores
Chambre microenvironnementaleTokai HitSTXG-TIZBX-SET
Microscope inversé Nikon Eclipse Ti2-ENikon
Éléments NISNikon
Néomycine et Polymyxine B sulfas, et bacitracine Zinc Opthalamique Onu, USPBausch + Lomb24208-780-55
Taille du pinceau 00Amazon
Prism 8.0GraphPad
Solution optalmique de chlorhydrate de proparacaïne USP, 0,5 %Sandoz61314-0016-01
Boîte de Pétri recouverte de PDL (35 mm)MatekP35GC-1.5-14-CEnveloppe n° 1.5
PSD95_pTagRFPAddgene52671http://n2t.net/addgene:52671
Chlorure de potassiumSigma-AldrichP9333-500G
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS7653-1KG
Monobase monobase phosphate de sodiumSigma-AldrichS9638-25G

References

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