Construction de microréseaux de tissus à base de colle pour la recherche sur les tumeurs et les maladies

Summary

Ce protocole décrit une méthode de production à faible coût et de validation efficace pour la construction de TMA à base de colle, fournissant une plate-forme de diagnostic pathologique pratique pour la recherche sur les tumeurs et les maladies.

Abstract

La technologie des puces à ADN tissulaires (TMA) est une plate-forme à haut débit pour la détection et l’analyse simultanées de plusieurs échantillons de tissus, facilitant ainsi la recherche efficace de biomarqueurs de tumeurs et de maladies. Cependant, les méthodes de construction TMA conventionnelles sont souvent confrontées à des limites telles que la complexité opérationnelle, les procédures chronophages et la précision variable. Une méthode de construction TMA à base de colle a été développée pour surmonter ces défis, offrant une meilleure fixation du noyau tissulaire et une stabilité structurelle accrue. La validation systématique comprenait l’évaluation histologique (coloration HE), le profilage immunohistochimique des protéines cibles et l’analyse par hybridation in situ en fluorescence (FISH). Les résultats ont démontré que la méthode à base de colle maintenait une excellente intégrité des tranches, améliorait le rapport signal/bruit et assurait une reproductibilité constante d’un lot à l’autre. Bien que l’approche se limite à un fonctionnement manuel, elle présente une option fiable et rentable pour la production de TMA à débit modéré. Cette méthode est particulièrement adaptée aux environnements de recherche qui privilégient la flexibilité et la diversité des échantillons plutôt que l’automatisation à grande échelle, ce qui élargit l’utilité de la TMA dans les milieux universitaires et diagnostiques.

Introduction

La puce à ADN tissulaire (TMA) est une technique à haut débit pour l’analyse d’échantillons de tissus ^1,2,3. Plusieurs carottes de tissus de donneurs sont obtenues, et des blocs de paraffine de donneur sont transférés dans des blocs de tissus receveurs pour une analyse moléculaire différentielle et comparative simultanée dans les mêmes conditions de performance théoriquement ^2,4. La façon classique de construire une puce à tissus (TMA) consiste à utiliser une perforatrice pour extraire des carottes de tissus d’un échantillon de tissu de donneur et les disposer séquentiellement dans un bloc de paraffine receveur. Cette méthode convient aux blocs de paraffine donneurs de profondeur similaire et permet l’analyse efficace de plusieurs échantillons sur une seule tranche, améliorant considérablement l’efficacité de l’étude et la cohérence des données ^5,6,7. Néanmoins, cette méthode présente encore certaines limites, notamment une manipulation inadéquate du noyau tissulaire pendant le processus d’enrobage, ce qui peut entraîner une coloration incohérente des échantillons lors des analyses ultérieures⁸.

La deuxième méthode de construction TMA est la méthode du ruban ^9,10. Cette méthode inverse le processus de construction en coulant le bloc autour de noyaux verticaux inversés qui, une fois terminés, affleurent le sommet de la TMA, quelle que soit la longueur du noyau^11,12. Cependant, cette méthode nécessite de s’assurer du bon placement de l’âme tissulaire et de l’efficacité du ruban, et limite également le nombre d’échantillons pouvant être traités par rapport aux techniques traditionnelles.

Cette étude propose une méthode innovante de construction de TMA, visant à résoudre des problèmes tels que la stabilité insuffisante des noyaux tissulaires et le fonctionnement complexe qui existent dans les techniques traditionnelles¹³. Cette méthode utilise de la colle pour fixer avec précision plusieurs carottes de tissus ensemble et présente les avantages d’une utilisation simple et d’une forte fermeté de l’échantillon. Par rapport aux méthodes traditionnelles de sectionnement ou de ruban, la méthode de la colle peut augmenter le taux de rétention des noyaux de tissus et réduire les coûts. Cette méthode est applicable aux études cliniques avec un échantillon de taille moyenne et est particulièrement adaptée aux plans de recherche qui nécessitent un ajustement flexible du plan expérimental. Cependant, il convient de noter que la capacité de traitement de cette méthode ne répond pas aux exigences de l’ultra-haut débit⁹. Entre-temps, dans le processus d’application proprement dit, un ensemble complet de normes d’exploitation normalisées et de systèmes de contrôle de la qualité doit être établi. Les opérateurs doivent recevoir une formation systématique et réussir des évaluations professionnelles pour garantir la standardisation des opérations techniques et la répétabilité des résultats. Une analyse complète indique que cette technologie atteint un bon équilibre entre flexibilité opérationnelle, rentabilité et fiabilité technique, et qu’elle est particulièrement adaptée aux scénarios de recherche où les ressources sont limitées mais où le contrôle de la qualité doit encore être garanti.

Protocol

Tous les blocs de donneurs ont été obtenus à partir d’échantillons pathologiques d’archives collectés entre 2016 et 2018 à l’hôpital populaire affilié Huai’an n° 1 de l’Université de médecine de Nanjing. Les échantillons ont été anonymisés avant d’être utilisés et traités conformément aux protocoles approuvés (le comité d’éthique de l’hôpital populaire Huai’an n° 1 affilié à l’Université de médecine de Nanjing, KY-2024-250-01).

1. Évaluation et marquage des tissus du donneur

1. Choisissez des blocs de tissu d’une épaisseur de ≥5 mm et d’une zone de ≥15 mm × 15 mm. Assurez-vous d’une marge de sécurité de 2 mm sur les bords et excluez les régions présentant une nécrose, une hémorragie ou une calcification pour maintenir l’intégrité des tissus.
2. Identification et marquage de la zone cible
   1. Évaluez les sections colorées au H&E à l’aide d’un microscope optique. Localisez la zone cible à l’aide d’un balayage à faible puissance, puis passez à une zone à haute puissance pour confirmer les caractéristiques morphologiques cellulaires. Marquez les limites de la zone cible sur les diapositives.
   2. Mappez les coordonnées de la zone sélectionnée sur la surface du bloc de paraffine pour terminer la conversion de marquage.

2. Extraction de carottes tissulaires

1. Préparation de la ponction et prétraitement de l’échantillon
   1. Sélectionnez une perforatrice à main de 2 mm de diamètre et confirmez la douceur de son tranchant et sa facilité d’utilisation.
   2. Placez le bloc de paraffine donneur sur une plate-forme froide à 4 °C pendant 15 min.
2. Alignez l’aiguille verticalement avec le point marqué et appliquez une pression de rotation constante pour atteindre la profondeur limite. Évitez de basculer ou de vibrer pendant le processus⁷ (Figure 1A).
3. Tournez doucement l’aiguille dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (≤2 tours/s) pour la retirer. Éjectez soigneusement le noyau tissulaire de l’aiguille et transférez-le dans un puits individuel d’une plaque pré-refroidie à 96 puits. Consignez l’emplacement de la carotte dans chaque puits (figure 1B).
   REMARQUE : Si le bas du noyau tissulaire est inégal, nivelez-le avec une lame. Après le rognage, vérifiez à nouveau l’intégrité.
4. Enregistrez à l’avance tous les numéros de donneur et les positions de puits de plaque ELISA correspondantes (A1-H12) dans le formulaire d’enregistrement. Pendant l’opération, vérifiez à nouveau pour vous assurer qu’il y a une correspondance stricte entre les numéros de donneurs et les positions des puits.
5. Inspectez immédiatement l’intégrité des noyaux. Jetez les carottes fracturées, pliées ou présentant des écarts de diamètre de >0,1 mm.
   REMARQUE : Assurez-vous de l’uniformité de la longueur du noyau (coefficient de variation, CV ≤5 %) et évitez les rayures de surface ou les artefacts de compression.

3. Fixation du noyau tissulaire

1. Utilisez un marqueur étanche pour dessiner une grille directement sur la surface du moule, en assurant des lignes claires et régulièrement espacées.
   1. Utilisez un moule standard avec une surface inférieure efficace de 3,0 cm × 2,5 cm, et réservez une zone limite vierge de 1,5 mm de chaque côté.
   2. À l’aide d’un marqueur étanche à pointe fine de 0,5 mm, tracez neuf lignes parallèles également espacées horizontalement et verticalement, formant une grille de positionnement de 9 × 9 (81 points d’intersection au total).
      REMARQUE : Avant de commencer, nettoyez l’intérieur du moule avec un coton-tige imbibé de xylène pour éliminer la paraffine résiduelle, qui peut provoquer un délaminage. Pendant le processus d’étirage, utilisez une règle en acier pour assurer une épaisseur de ligne uniforme et des points d’intersection clairement reconnaissables.
2. À l’aide d’une pipette, prélevez 5 μL de colle et placez-la délicatement au centre de la lame pré-étiquetée pour former une seule gouttelette. À l’aide d’une pince à épiler fine, prélevez immédiatement le noyau de tissu verticalement à un angle de 90° et enfoncez-le lentement verticalement dans la goutte de colle (figure 1C).
3. Insérez les noyaux dans les intersections de grille correspondantes sur le moule à l’aide d’une pince à épiler. Appliquez une légère pression pendant 5 s pour assurer une adhérence sûre (Figure 1D).
4. Si le noyau tissulaire est déplacé, affinez-le et réinitialisez-le immédiatement à l’aide d’une pince à épiler fine avant que la colle ne se solidifie (dans les 30 s). Jetez les noyaux solidifiés et mal alignés pour maintenir la qualité de la préparation tout en préservant au maximum les précieux échantillons.

4. Installation de la cassette et intégration de la paraffine

1. Placez verticalement la cassette de tissu sur le moule en acier, en assurant le contact avec les pointes du noyau sans appliquer de compression. Fixez la cassette à l’aide de pinces magnétiques aux quatre coins et scellez les joints avec de la paraffine fondue.
2. Infuser la paraffine fondue à un angle de 45° en zigzag, en maintenant un débit de 1 mL/s. Assurez-vous que le niveau de paraffine dépasse les pointes du noyau de 2 mm (Figure 1E).
3. Refroidissez rapidement le bloc sur une plaque froide à 4 °C pendant 5 min pour former une couche de support rigide. Transférez le bloc dans un environnement à 22 °C pendant 20 min pour réduire le stress interne. Enfin, à l’aide d’un pistolet thermique à 40 °C, lissez délicatement la surface et éliminez les marques de retrait.
4. Chauffez légèrement la paraffine pour la ramollir, puis coupez soigneusement le long des bords de la cassette pour détacher le bloc. Soulevez doucement la cassette et retirez toute paraffine résiduelle pour assurer l’intégrité des carottes tissulaires (Figure 1F).

Results

Dans la présente étude, des microréseaux de tissus de haute qualité ont été construits à l’aide de la méthode de la colle. Pour vérifier l’efficacité de la méthode, une série d’expériences a été réalisée, notamment la coloration H&E, la détection immunohistochimique de protéines spécifiques et l’analyse par hybridation in situ en fluorescence (FISH). Un élément essentiel du processus de construction est la présence de points de noyau tissulaire aux positions et distances attendues les uns des autres, ce qui ...

Discussion

En tant que méthode innovante de construction de microréseaux de tissus (TMA), la méthode de la colle a montré des avantages significatifs en raison de sa facilité de construction et de sa rentabilité. Par rapport à la méthode traditionnelle du réseau d’aiguilles, qui repose sur des instruments sophistiqués^14,15, la méthode de la colle permet la fixation de l’échantillon par collage, ce qui peut être fait avec seulement des outil...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cancer du sein HER2 Kit de détection	Anbiping	2502001	Cancer du sein HER2 Kit de détection
CDHR4 Anticorps	Abcam	ab166914	Anticorps CDHR4 Anticorps CDK1
	Abcam	ab265590	Anticorps CDK1
Anticorps CRTAC1	Abcam	ab254691	Anticorps CRTAC1
DNASE1L3 anticorps	Abcam	ab203669	Machine
d’enrobage	P.S.J MEDICAL	BM450A
Déshydrateur tissulaire entièrement automatique	Leica Biosystems	ASP3005	Déshydrateur tissulaire entièrement automatique
Lames de microscope en verre	Citotest	250124A1	Lames de microscope en verre
Colle	TIZO	200	Colle
GPR146 anticorps	Abcam	ab117104	Anticorps GPR146
Anticorps IGSF10	Abcam	ab197671	IGSF10
Anticorps ITIH1 Anticorps	Abcam	ab233032	ITIH1
Anticorps à profil bas Lames de microtome	Thermo Fisher	3052835	Lames de microtome à profil bas
Stylo	Deli	SK109	Marqueur
	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Microtome
Cire de paraffine	Solarbio	YA0012	Cire de paraffine
SMAD9 anticorps	Abcam	ab262940	Anticorps SMAD9
Anticorps TARBP1	Anticorps Abcam	ab115896	Anticorps TARBP1
ZCCHC24 anticorps	Abcam	ab88756	Anticorps ZCCHC24