Cytométrie en flux et analyse de cellules uniques pour caractériser l’activation de la microglie dans le développement postnatal précoce du cerveau de souris

Summary

Ce protocole combine la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire pour isoler et caractériser les états des cellules microgliales dans le cervelet des cerveaux de souris postnatals précoces. Il utilise la dissociation enzymatique, la centrifugation de Percoll et l’immunomarquage pour révéler l’hétérogénéité des microglies et améliorer la compréhension de leurs rôles dans le développement et la maladie cérébelleux.

Abstract

Les microglies, les cellules immunitaires résidentes du cerveau, présentent des profils transcriptionnels spécifiques à la région et au contexte au cours du développement et de la maladie. Ce protocole présente deux méthodes complémentaires pour l’étude des populations microgliales dans le tissu cérébelleux de souris : la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire.

En tant que première méthode utilisée, le protocole basé sur la cytométrie en flux est optimisé pour les cerveaux postnatals précoces, garantissant une isolation cellulaire robuste et une cohérence dans toutes les conditions expérimentales. Elle commence par la dissociation tissulaire à l’aide de la digestion enzymatique, suivie de l’élimination de la myéline par centrifugation à gradient de densité Percoll pour obtenir une suspension de cellules neurales de haute qualité, et d’une stratégie de déclenchement basée sur l’expression de CD45 et CD11b. La coloration vivante/morte garantit la viabilité cellulaire, et des anticorps conjugués au fluorochrome sont utilisés pour profiler l’expression de marqueurs de surface sélectionnés sur la microglie. Les contrôles compensatoires sont effectués à l’aide de billes de latex avec des stratégies de déclenchement validées utilisant le contrôle de fluorescence moins un (FMO).

La deuxième méthode implique le séquençage de l’ARN d’une seule cellule à l’aide de la génomique 10X, en suivant les mêmes étapes d’isolement en amont, qui permettent le profilage transcriptomique de la microglie dans toutes les conditions. Les amas microgliaux sont identifiés à l’aide de l’analyse de l’expression génique, et une analyse d’expression différentielle est effectuée entre les groupes expérimentaux. Un classificateur de forêt aléatoire est appliqué uniquement pour distinguer les échantillons mâles et femelles lorsqu’ils sont multiplexés.

Ensemble, ces protocoles reproductibles et adaptables fournissent un cadre solide pour étudier la diversité microgliale dans le cervelet au cours du développement cérébral précoce et son altération potentielle à la suite de perturbations expérimentales.

Introduction

La période postnatale précoce est une phase critique pour le développement du cerveau, caractérisée par des processus cellulaires et moléculaires complexes qui jettent les bases des fonctions cognitives, émotionnelles et comportementales¹. Cependant, cette période est également marquée par la vulnérabilité, car les perturbations peuvent altérer les trajectoires neurodéveloppementales et entraîner des troubles neurologiques ou psychiatriques à long terme. Les microglies, les cellules immunitaires résidentes du cerveau, jouent un rôle central dans la formation du cerveau en développement par l’élagage synaptique, la phagocytose, la surveillance immunitaire et les réponses aux agressions environnementales ^2,3. Ces cellules présentent une plasticité remarquable, adoptant des profils transcriptionnels qui varient selon la région du cerveau, le stade de développement et le contexte pathologique ^4,5.

L’analyse précise de l’activation de la microglie dans le cerveau en développement nécessite des méthodologies robustes et reproductibles capables d’analyser leurs phénotypes dynamiques dans le contexte de tissus cérébraux immatures. La cytométrie en flux apporte une solution fiable, permettant la caractérisation à haut débit des populations cellulaires et l’expression des marqueurs⁶. Cependant, son application dans l’étude de la microglie à partir de cerveaux postnatals précoces est techniquement difficile en raison de la nature délicate du tissu et de la nécessité de protocoles efficaces d’isolement et d’enrichissement cellulaires ^7,8.

Le protocole présenté ici combine la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) pour isoler et caractériser la microglie à partir de cerveaux de souris postnatals précoces, avec un accent particulier sur le cervelet du 3e jour postnatal (P3) au 30e jour postnatal (P30)⁹, une région et un stade de développement pour lesquels les références méthodologiques détaillées restent limitées.

Ce flux de travail comprend la dissociation enzymatique, la centrifugation par gradient de densité pour l’élimination des débris et l’enrichissement cellulaire, ainsi que l’immunomarquage à l’aide d’un panel de marqueurs extracellulaires et intracellulaires. Pour caractériser la diversité microgliale, une gamme de marqueurs de surface et intracellulaires est utilisée^10,11. Au lieu d’attribuer des marqueurs fixes (inflammatoires ou réparateurs), le protocole définit des sous-populations basées sur des profils d’expression de marqueurs discrets. Par exemple, les microglies exprimant CD80, CD86 et iNOS, CD206 et Arg1, CD86 et CD64, ou CD163 et CD206 sont identifiées et analysées comme des sous-ensembles moléculairement distincts. Ces marqueurs reflètent différents états de la microglie activée^10,11 et sont présentés sous forme de profils d’expression.

Cette stratégie de contrôle multiparamétrique permet une identification précise des sous-ensembles microgliaux basés sur l’expression de marqueurs de surface, offrant un cadre rationalisé pour l’analyse de l’hétérogénéité immunitaire au cours du développement cérébral postnatal. Pour étendre le profilage phénotypique et découvrir la diversité transcriptionnelle, le séquençage de l’ARN unicellulaire est effectué après l’isolement cellulaire. Cette étude établit un flux de travail cohérent et évolutif pour faire progresser la compréhension des processus neurodéveloppementaux et de l’impact à long terme de l’activation microgliale. En intégrant la cytométrie en flux optimisée et le scRNA-seq dans un cadre informé sur le développement et la région, ce protocole constitue un outil puissant pour étudier la biologie microgliale au début de la vie et sa pertinence pour les résultats neurodéveloppementaux.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique du Centre de recherche du CHU Sainte-Justine et sont conformes aux directives et politiques du Centre de recherche Sainte-Justine et de l’Université de Montréal (Montréal, Québec, Canada).

1. Isolement cellulaire du cerveau

1. Après les procédures d’anesthésie ou d’euthanasie, retirez rapidement tout le cerveau de la cavité crânienne et placez-le dans un tube de 15 ml contenant un milieu de culture de cellules microgliales (voir le tableau des matériaux). Gardez le tube sur de la glace. Répétez la même procédure pour d’autres souris si nécessaire.
   Toutes les souris utilisées dans cette étude provenaient de colonies de reproduction internes dans le laboratoire du Dr Tremblay. Les souris expérimentales ont été générées en croisant des souris B6.129-Cx3Cr1 ^{CreERT2-EYFP/WT} avec des souris B6-Rosa26^iDTR/WT, toutes deux provenant à l’origine des Jackson Laboratories. Cette stratégie de sélection a produit une progéniture hétérozygote pour l’allèle IDTR, permettant la déplétion conditionnelle des cellules exprimant Cx3Cr1 (principalement la microglie) par le biais d’un système Cre-loxP inductible par le tamoxifène. Avant le prélèvement de tissus, les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de kétamine (150 μg/g) et de xylazine (10 μg/g). L’euthanasie a été pratiquée par décapitation sous anesthésie profonde, conformément aux directives institutionnelles de soins et d’utilisation des animaux.
2. Soit en préservant l’ensemble du cerveau, soit en procédant à la dissection de régions spécifiques si vous le souhaitez. Effectuez la dissection dans une petite boîte de Pétri contenant un milieu de culture de cellules microgliales (voir le tableau des matériaux) sur de la glace pour maintenir la viabilité cellulaire.
   NOTE : Ce protocole a été validé pour l’ensemble du cerveau et du cervelet de P1 à P30.
3. Retirez le milieu de culture de cellules microgliales et coupez finement le tissu cérébral à l’aide d’un scalpel dans une boîte de Pétri.
4. Pour la digestion enzymatique, transférez le tissu homogénéisé dans des tubes de 5 mL. Ajouter 2 mL de HBSS (1x) supplémenté en 2 mg/mL de collagénase D et 14 μg/mL de DNase I (voir le tableau 1). Scellez les bouchons des tubes avec du parafilm. Incuber les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min, en secouant le tube toutes les 5 min. Pour arrêter la digestion, placez les tubes sur de la glace.
5. Passez l’homogénat à travers un filtre à mailles métalliques de 140 μm (voir tableau des matériaux) pour éliminer les gros débris. Utilisez un pilon en verre pour dissocier les cellules.
6. Lavez le filtre plusieurs fois avec un milieu de culture de cellules microgliales (3 ml par lavage).
7. Prélever le filtrat à l’aide d’une pipette de 10 mL et le transférer dans un tube de 15 mL. Centrifuger la solution à 500 g pendant 7 min à 4 °C.
8. Jetez le surnageant en inversant soigneusement le tube. Remettez le granulé en suspension en le grattant doucement sur une grille.
9. Ajouter 10 ml d’une solution de milieu colloïdal à base de silice à 37 % (voir le tableau 1) pour éliminer la myéline et les débris. Centrifuger la solution à 500 g pendant 10 min à 4 °C avec une force de freinage minimale.
10. Aspirer la couche de myéline à la partie supérieure de la solution à l’aide d’une pipette de 10 ml.
    REMARQUE : L’aspiration continue empêche la myéline de se mélanger à nouveau dans la solution.
11. Laver les cellules en ajoutant 10 mL de HBSS (1x) et centrifuger à 500 × g pendant 7 min à 4 °C.
12. Jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension en la grattant doucement à l’aide d’une grille, puis ajouter 10 mL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (voir le tableau 1). Centrifuger la solution à 500 g pendant 10 min à 4 °C.
13. Jetez le surnageant, remettez en suspension la pastille finale et conservez les cellules. Les cellules isolées sont maintenant prêtes pour la coloration par cytométrie en flux ou le séquençage de l’ARN sur cellule unique.
14. Pour l’isolement du séquençage de l’ARN unicellulaire, comptez les cellules au microscope à l’aide de réactifs fluorescents stables sur paillasse (voir le tableau des matériaux) pour distinguer les cellules nucléées vivantes et mortes, ainsi que du bleu trypan (voir le tableau des matériaux). S’assurer que les cellules sont en excellent état, avec une viabilité allant jusqu’à 90 %, et atteindre une concentration de 1000 cellules/μL). Les prochaines étapes sont décrites à la section 9.1.
    REMARQUE : Gardez les tubes sur de la glace tout au long du protocole. Toutes les étapes de centrifugation doivent être effectuées à 4 °C avec un frein maximum, à l’exception de l’étape Percoll, où un frein minimum est spécifié. Pour de meilleurs résultats, effectuez l’ensemble du protocole le même jour. Pour le protocole de séquençage de l’ARN unicellulaire, filtrez toutes les solutions utilisées pour l’isolement, à l’étape 1.11, utilisez HBSS (1x) pour le deuxième lavage, et à l’étape 1.12, conservez 70 à 100 μL de la solution cellulaire.

2. Protocole de coloration extracellulaire par cytométrie en flux

1. Transférez toutes les cellules dans une plaque de 96 puits à fond conique (voir le tableau des matériaux). Centrifuger la plaque à 500 g pendant 5 min à 4 °C.
2. Retournez rapidement la plaque pour éliminer le surnageant en un seul mouvement.
3. Remettre la pastille de cellule en suspension dans 25 μL de solution bloquante (voir tableau 1). Incuber pendant 15 min à température ambiante (RT).
4. Pour préparer le mélange de coloration des anticorps extracellulaires (voir tableau 2), centrifuger les stocks d’anticorps à 10 000 × g pour éliminer les agrégats potentiels. Sans déranger la pastille, aspirez soigneusement le volume souhaité du surnageant pour préparer le mélange de coloration et ajustez le volume à 25 μL avec le tampon FACS.
5. Ajouter 25 μL du mélange d’anticorps extracellulaires dans chaque puits. Incuber pendant 20 min à RT.
   REMARQUE : Avant l’utilisation expérimentale, tous les anticorps ont été titrés sur des suspensions unicellulaires cérébelleuses (ou cérébrales) afin de déterminer la concentration de travail optimale. Le titrage a été effectué par dilutions en série pour générer une courbe de saturation, et la dilution correspondant à un plateau de signal avec un bruit de fond minimal a été sélectionnée pour l’étagement du signal.
6. Sans mélanger, ajouter 150 μL de tampon FACS dans les puits. Centrifuger la plaque à 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Inversez la plaque pour retirer le surnageant en un seul mouvement.
7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon FACS. Centrifuger la plaque à 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Inversez la plaque pour retirer le surnageant en un seul mouvement. Répétez le lavage une fois de plus en utilisant 200 μL de tampon FACS dans les mêmes conditions.

3. Coloration intracellulaire

1. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon saponine-paraformaldéhyde (PFA) (voir tableau 1) pour fixer et perméabiliser les cellules. Incuber 10 min à RT, à l’abri de la lumière.
2. Sans mélanger, ajouter 100 μL de tampon à saponine (voir tableau 1). Centrifuger la plaque à 500 × g pendant 6 min à 4 °C. Inversez la plaque pour retirer le surnageant en un seul mouvement.
3. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon de saponine. Préparez des contrôles de compensation en ajoutant 20 μL de billes (voir la Table des matériaux) dans 11 puits vides. Centrifuger la plaque à 500 × g pendant 6 min à 4 °C. Inversez la plaque pour retirer le surnageant en un seul mouvement.
4. Pour préparer le mélange de coloration des anticorps intracellulaires (voir tableau 3), centrifuger des stocks d’anticorps à 10 000 × g pour éliminer les agrégats potentiels. Sans déranger la pastille, aspirez soigneusement le volume souhaité du surnageant pour préparer le mélange de coloration et ajustez le volume à 50 μL avec un tampon à saponine.
5. Remettre la pastille en suspension dans 50 μL de mélange d’anticorps intracellulaires (voir le tableau 3). Ajouter 1 μL de chaque anticorps dans les puits de billes. Incuber pendant 30 min à RT.
6. Sans mélanger, ajoutez 150 μL de tampon de saponine dans chaque puits d’échantillon de cellule, et ajoutez 100 μL de tampon FACS dans chaque puits contenant les commandes de compensation pour laver les billes. Centrifuger la plaque à 500 × g pendant 6 min à 4 °C. Inversez la plaque pour retirer le surnageant en un seul mouvement.
7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon de saponine et remettre en suspension les témoins compensatoires dans 200 μL de tampon FACS. Centrifuger la plaque à 500 × g pendant 6 min à 4 °C. Inversez la plaque pour retirer le surnageant en un seul mouvement. Répétez le lavage une fois de plus en utilisant 200 μL de tampon à saponine dans les mêmes conditions.
8. Remettre en suspension les cellules et les commandes compensatoires dans 200 μL de tampon FACS. Transvasez la suspension dans un tube FACS et conservez-la à 4 °C jusqu’à l’acquisition de la cytométrie en flux.
   REMARQUE : Assurez-vous que toutes les étapes impliquant des réactifs sensibles à la lumière sont effectuées dans des conditions de lumière minimales. Un puits de perle ne contient pas d’anticorps, ce qui correspond au tube de perle non coloré.

4. Acquisition de la cytométrie en flux

1. Allumez le cytomètre en flux, puis l’ordinateur.
2. Ouvrez le logiciel du cytomètre en flux et lancez le démarrage de la fluidique en sélectionnant Exécuter sous l’onglet cytomètre.
3. Créez un nouveau dossier d’expérience en cliquant sur Nouveau dossier et en lui attribuant un nom. Cliquez ensuite sur Nouvelle expérience pour nommer l’expérience et sélectionnez Nouveau tube pour ajouter un échantillon et un tube d’échantillon.

5. Configurer les contrôles de compensation

1. Préparez des billes de compensation monocolorées pour chaque fluorochrome utilisé dans le panneau, ainsi qu’un contrôle non coloré.
2. Chargez les tubes de compensation sur le cytomètre. Réglez les tensions de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) à environ 250.
3. Ajustez les tensions de chaque canal fluorescent de sorte que la population négative se trouve dans la première décade de l’axe.
4. Acquérir au moins 5 000 événements par tube.
5. Utilisez la matrice de compensation pour ajuster le chevauchement spectral jusqu’à ce que tous les pics positifs soient clairement séparés de la population négative et centrés au-dessus de 10⁴ sur l’axe respectif.
   REMARQUE : Des contrôles de compensation doivent être effectués pour chaque expérience, car les paramètres du cytomètre ou les performances du fluorochrome peuvent affecter considérablement le chevauchement spectral. Bien que les contrôles de compensation cellulaires soient recommandés dans certaines applications de tissus cérébraux, des billes de capture d’anticorps ont été utilisées dans ce protocole en raison du nombre plus faible de microglies pouvant être obtenues à partir du cervelet de souris P3, ce qui limite la faisabilité de la compensation cellulaire. La fluorescence des anticorps a d’abord été validée sur des cellules dérivées du cerveau et s’est avérée comparable aux signaux basés sur des billes. Inclure une suspension de cellules dérivées du cerveau non colorées lors de l’optimisation initiale du panel pour évaluer l’autofluorescence des tissus et établir les niveaux de signal de base. Ce contrôle est essentiel pour bien définir les populations négatives dans chaque canal fluorescent.

6. Préparer et acquérir les contrôles FMO

1. Pour chaque marqueur clé, préparez un contrôle de fluorescence moins un (FMO) qui inclut tous les anticorps sauf celui testé.
2. Exécutez les commandes FMO en utilisant les mêmes paramètres d’acquisition que les échantillons entièrement colorés.
3. Utilisez les diagrammes FMO pour définir des seuils de contrôle pour les populations faibles ou qui se chevauchent et pour distinguer les vrais positifs du bruit de fond.
   REMARQUE : Les contrôles FMO doivent être effectués lors de l’optimisation initiale du panneau afin de définir des limites de contrôle précises et fiables, en particulier dans les tissus à forte autofluorescence, tels que le cerveau. Si le panneau de coloration, les paramètres de l’instrument ou les conditions expérimentales sont modifiés, les commandes FMO doivent être répétées. Pour les expériences ultérieures utilisant les mêmes paramètres de panel et de cytomètre validés, les seuils de contrôle précédemment définis peuvent être réutilisés pour assurer la cohérence entre les répétitions biologiques.

7. Préparer et acquérir des contrôles Isotype

1. Colorez l’échantillon témoin avec des anticorps de contrôle d’isotype appariés au fluorochrome et la concentration aux anticorps d’essai.
2. Acquérez des données en utilisant les mêmes paramètres de cytomètre.
3. N’utilisez des contrôles d’isotypes que pour évaluer une liaison non spécifique potentielle, en particulier dans le cas de marqueurs intracellulaires ou d’anticorps mal caractérisés. N’utilisez pas de commandes d’isotype pour le gating, car elles ne reflètent pas la même cinétique de liaison que des anticorps spécifiques.
   REMARQUE : Les commandes d’isotype ne conviennent pas pour le gating et ne doivent pas être utilisées pour définir des populations. Leur utilisation est facultative et doit être réservée à la validation de la spécificité de l’anticorps dans certains cas.

8. Stratégie de contrôle de cytométrie en flux

1. Créez les diagrammes à points suivants pour le contrôle séquentiel :
   FSC-A vs. SSC-A pour exclure les débris
   FSC-A vs. FSC-H pour sélectionner les maillots.
   FSC-A vs. Amcyan (colorant de viabilité) pour la porte des cellules vivantes.
2. Identifiez la microglie comme CD11b⁺CD45⁺ à l’aide de CD11b (FITC) par rapport à CD45 (AF700).
   REMARQUE : En raison du stade de développement (P3-P15), du contexte inflammatoire et de la digestion enzymatique, TMEM119 et P2RY12 n’étaient pas fiables pour séparer clairement la microglie des autres populations myéloïdes par cytométrie en flux. La stratégie de déclenchement CD11b⁺CD45⁺ , précédemment validée dans le cerveau postnatal, a donc été utilisée pour identifier les populations de microglies tout en minimisant la contamination. Dans des conditions de contrôle, le rendement typique varie de 30 000 à 200 000 cellules microgliales par cerveau entier de P3 à P15. Pour les expériences portant spécifiquement sur le cervelet, le rendement moyen est d’environ 5 000 cellules microgliales par cerveau.
3. Utilisez les contrôles FMO pour définir des seuils de contrôle pour les marqueurs d’activation.
4. Identifier les sous-populations de microglies en fonction de l’expression de marqueurs liés au système immunitaire :
   CD80⁺ (Super Lumineux 436)
   CD86⁺ (PE)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. Caractériser davantage les sous-ensembles de la microglie par des combinaisons d’expression de marqueurs :
   CD206⁺ (APC) ^{puis Arg1+} (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE) ^{puis CD64+} (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (Super Bright 600) ^{puis CD206+} (APC)
   REMARQUE : Des combinaisons de marqueurs sont utilisées pour décrire l’hétérogénéité moléculaire au sein de la population microgliale. Ces sous-ensembles sont rapportés sur la base de l’expression des marqueurs uniquement et ne se voient pas attribuer de rôles fonctionnels spécifiques, conformément aux normes actuelles reconnaissant la plasticité microgliale et les phénotypes dépendants du contexte.
6. Chargez l’échantillon expérimental. Réglez FSC sur 300 et SSC sur 200. Utilisez un faible débit et enregistrez le nombre d’événements souhaité.
7. Après l’acquisition, lavez le cytomètre et exportez les données sous forme de . FSC pour analyse.
8. Analysez les données à l’aide d’un logiciel de cytomètre en flux.

9. Échantillon de séquençage de l’ARN sur cellule unique

1. En utilisant le même protocole d’isolement cellulaire que celui décrit pour la cytométrie en flux (voir étape 1.14), remettre en suspension les cellules dissociées dans le tampon FACS. Utilisez un tampon FACS dans les tubes de prélèvement et toutes les étapes de manipulation ultérieures pour maintenir la stabilité de la cellule.
2. N’effectuez pas de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) si l’objectif est de capturer tous les types de cellules d’une région du cerveau. Cependant, si l’expérience nécessite un enrichissement pour la microglie, incluez une étape de tri FACS avant le séquençage.
3. Évaluez immédiatement la viabilité cellulaire à l’aide de colorants fluorescents stables et de Trypan Blue (voir le tableau des matériaux). Comptez les cellules au microscope à l’aide d’un hémocytomètre (voir Tableau des matériaux).
4. Vérifier que la suspension cellulaire présente une viabilité d’au moins 90 % et ajuster à une concentration finale d’environ 1 000 cellules/μL avant de procéder au séquençage de l’ARN sur cellule unique.
5. Conservez tous les échantillons sur de la glace et traitez-les immédiatement après la dissociation pour minimiser le stress cellulaire et les changements transcriptionnels.
6. Multiplexez les échantillons par paires en suivant les instructions du fabricant.
   REMARQUE : Un mâle et une femelle du même groupe expérimental ont été regroupés afin de réduire les coûts expérimentaux.
7. Préparez les banques scRNAseq (voir la Table des matériaux) et suivez les directives recommandées par le fabricant.
   REMARQUE : La préparation de la bibliothèque a été effectuée par la Plateforme de génomique de l’Institut de recherche en immunologie et en cancérologie (IRIC) de l’Université de Montréal.
8. Séquencez les banques scRNA-seq à l’aide d’un système de séquençage jusqu’à une profondeur moyenne de 3200 millions de lectures par voie.
   REMARQUE : Le séquençage a été effectué à Génome Québec à Montréal.

10. Analyse du séquençage de l’ARN sur cellule unique

1. Effectuez une analyse du nombre d’identifiants moléculaires uniques (UMI) à l’aide du logiciel Cell Ranger de 10X Genomics (v8.0.0) avec le génome de référence GRCm39 2024-A de la souris. Utilisez le package Seurat R (v5.1) pour l’analyse en aval.
2. Effectuer un contrôle qualité en excluant les cellules dont l’ARN mitochondrial dépasse, par exemple, 30 % de l’ARN total (Figure 1A), ou un seuil plus strict choisi pour éliminer les cellules présentant un stress potentiel. Filtrez les cellules de faible qualité avec un log10GenesPerUMI supérieur à 0,75 (Figure 1B), un nombre de caractéristiques uniques (« nUMI ») inférieur à 500 et un nombre de gènes détectés par cellule (« nGene ») supérieur à 300 (Figure 1C). Ensuite, supprimez les gouttelettes avec le package « scDblFinder » dans R. Avec un graphique de corrélation du nUMI et du nGene montrant les seuils, l’effet de filtrage devrait maintenant être visible (Figure 1D).
3. Atténuez les effets de lot en identifiant 2 000 gènes très variables par échantillon à l’aide de la fonction SelectIntegrationFeatures de Seurat.
4. Intégrez des ensembles de données à l’aide de l’analyse de corrélation canonique (CCA) et effectuez une analyse en composantes principales (PCA) pour la réduction de la dimensionnalité. Utilisez la fonction RunPCA avec 50 composants principaux (PC), en mettant à l’échelle les données et en faisant régresser les sources de variation indésirables (par exemple, le contenu mitochondrial). Évaluez le nombre de PC conservés sur la base du graphique du coude et de l’analyse JackStraw.
5. Visualisez des clusters à l’aide de l’algorithme UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) via la fonction Seurat RunUMAP . Identifiez les profils d’expression génique spécifiques aux clusters à l’aide de la fonction FindAllMarkers . Annotez les grappes en fonction des signatures transcriptionnelles en croisant les gènes marqueurs identifiés avec des ressources unicellulaires organisées telles que PanglaoDB et CellMarker (Figure 2). Les types de cellules, y compris la microglie, sont déduits de ces profils transcriptomiques plutôt que d’un marqueur de surface prédéfini.

11. Séparation cellulaire en fonction du sexe

1. Identifier les cellules mâles et femelles en fonction de l’expression de gènes spécifiques au sexe : quatre spécifiques féminins (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) et trois spécifiques masculins (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
2. Classez les populations masculines et féminines en filtrant les cellules exprimant des nombres d’UMI normalisés > 1 pour n’importe lequel de ces gènes à l’aide de la fonction de sous-ensemble de Seurat.
3. Générez des objets Seurat en sous-répartissant séparément les cellules mâles et femelles. Stockez et analysez ces objets indépendamment pour des comparaisons en aval.
4. Validez la classification en visualisant l’expression génique spécifique au sexe à l’aide des fonctions FeaturePlot et VlnPlot , garantissant une séparation claire entre les populations cellulaires masculines et féminines.
   REMARQUE : Les étapes 12.1 et 12.2 ne doivent être effectuées que lorsque l’échantillon a été multiplexé en mélangeant un mâle et une femelle.

12. Classification de la microglie basée sur un modèle statistique

1. Construisez cinq modèles statistiques dans R (forêt aléatoire, régression logistique, Bayes naïf, machine à vecteurs de support, arbre de décision) à l’aide d’un ensemble d’entraînement de ~1 000 cellules avec des étiquettes de groupe connues.
2. Évaluez les performances du modèle à l’aide de la validation croisée 10 fois et des courbes ROC (Receiver Operating Characteristic) (Figure 3). Identifiez les gènes clés contribuant à la classification à l’aide de la fonction FindAllMarkers dans Seurat.
3. Sélectionnez le modèle dont l’aire est la plus élevée sous la courbe ROC (AUC). Le modèle de forêt aléatoire a été sélectionné en fonction de son score AUC supérieur.
4. Appliquez le modèle sélectionné à des cellules non classifiées à l’aide de la fonction predict du package RandomForest R. Fusionnez les classifications prédites avec les ensembles de données précédemment annotés dans Seurat à l’aide de la fusion.
5. Validez les classifications en visualisant l’expression des gènes marqueurs avec FeaturePlot et VlnPlot. Pour assurer la cohérence des identités cellulaires prédites, évaluez les enrichissements de l’ensemble des gènes marqueurs qui se chevauchent avant et après l’ajout des cellules classifiées à l’aide d’un test statistique approprié (p. ex., le test exact de Fisher).

13. Analyse de l’expression génique différentielle de la microglie

1. Effectuez une analyse différentielle de l’expression génique (DEG) entre deux groupes d’intérêt spécifiques à l’aide de la fonction Seurat « FindMarkers », ident.1 représentant le groupe d’intérêt et ident.2 représentant le groupe de référence.
   REMARQUE : La sortie répertorie les gènes qui sont exprimés de manière différentielle dans ident.1 par rapport à ident.2. Dans ce contexte, les gènes régulés à la hausse sont ceux dont l’expression est plus élevée dans ident.1 par rapport à ident.2, tandis que les gènes régulés à la baisse montrent une expression plus faible dans ident.1. Leurs comparaisons sont utilisées pour générer des graphiques volcaniques et interpréter les changements transcriptionnels spécifiques à une condition.
2. Identifier les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) avec une valeur P ajustée≤ 0,05. Pour des comparaisons entre deux groupes spécifiques, utilisez la fonction FindAllMarkers avec les critères suivants : gènes exprimés dans au moins 10 % des cellules (min.pct = 0,1) et un seuil de changement de multiplication log2 de 0,25 (logfc.threshold=0,25). Pour des comparaisons multigroupes sur toutes les microglies, utilisez la fonction FindAllMarkers avec les mêmes paramètres. Les gènes dont la valeur P ajustée est ≤ 0,05 sont considérés comme exprimés de manière significativement différentielle. Pour visualiser les modèles d’expression DEG, générez un tracé de volcan à l’aide de la fonction intégrée dans le package EnhancedVolcano (Figure 4).
3. Comparez les résultats de la cytométrie en flux en examinant d’abord les marqueurs cytométriques utilisés pour trouver la microglie, en particulier CD45⁺ et CD11b⁺, qui correspondent aux gènes PtprcetItgam. Confirmez l’expression des gènes à l’aide des fonctions FeaturePlot dans Seurat.
4. Évaluez les marqueurs couramment associés à des états microgliaux distincts, y compris CD80etNOS2, ainsi que Mrc1, Arg1, Fcgr1 et CD163. Utilisez les fonctions Seurat FeaturePlot et DotPlot pour visualiser leur expression dans les groupes de cellules.
5. Générez un graphique à points à l’aide de la fonction DotPlot dans Seurat pour résumer les expressions de marqueur et valider la classification de la population.

Results

Ce protocole utilise efficacement la cytométrie en flux pour caractériser les populations de cellules microgliales dans des échantillons de cerveau de souris, en fonction de l’expression de marqueurs de surface et intracellulaires sélectionnés. Les sections suivantes détaillent les résultats obtenus à partir des étapes clés du flux de travail, en mettant en évidence la distribution et l’hétérogénéité des sous-ensembles de microglies en réponse aux conditions expérimentales.

Validation de la rémunération et de la stratégie de contrôle
Des billes de compensation ont été utilisées pour calibrer les signaux de fluorescence et corriger le chevauchement spectral entre les fluorochromes. Les populations positives et négatives de chaque fluorochrome ont été clairement séparées, ce qui a permis une génération précise de matrice de compensation. Les seuils de déclenchement ont d’abord été validés à l’aide du contrôle FMO (Fluorescence Minus One) lors de l’optimisation du panneau afin de distinguer le signal réel du bruit de fond, en particulier pour les marqueurs médiocres ou chevauchants. Ces seuils ont ensuite été réutilisés dans toutes les expériences en utilisant les mêmes paramètres de panneau de coloration et de cytomètre pour assurer la cohérence. Des contrôles d’isotypes ont été inclus pour surveiller la liaison non spécifique potentielle, en particulier pour les marqueurs intracellulaires, mais n’ont pas été utilisés pour les décisions de contrôle.

Identification des cellules microgliales
La stratégie de contrôle des cellules vivantes/mortes (Amcyan) a permis d’exclure avec succès les cellules mortes. La stratégie de déclenchement a permis d’isoler efficacement les populations de cellules microgliales en fonction de l’expression de CD45 (AF700) et CD11b (FITC). Les paramètres de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) ont été optimisés (FSC = 300, SSC = 200) pour centrer la population de microglies à l’intérieur du graphique à points (Figure 5).

Phénotypage des cellules microgliales
L’analyse par diagrammes à points a permis d’identifier des sous-populations de microglies sur la base de l’expression différentielle de marqueurs de surface et intracellulaires. À l’aide de stratégies de contrôle spécifiques dans le logiciel FlowJo, un sous-ensemble de cellules microgliales exprimant CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) et iNOS (PE-eFluor 610) a été identifié (Figure 6A). Le double gate a également été utilisé pour définir des sous-ensembles exprimant CD206 (APC) et Arg1 (PE-Cy7) (voir Figure 6B). D’autres populations ont été caractérisées par la co-expression de CD86 (PE) et CD64 (PerCP-eFluor 710), ainsi que de CD163 (Super Bright 600) et CD206 (APC) (Figure 6C,D). Ces profils phénotypiques reflètent l’hétérogénéité définie par les marqueurs au sein de la population microgliale et démontrent la capacité de ce protocole à distinguer plusieurs sous-ensembles distincts sur le plan transcriptionnel et immunologique sans déduire d’états fonctionnels fixes.

Analyse de la microglie unicellulaire
L’UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) a été utilisé pour visualiser l’hétérogénéité cellulaire et identifier les amas de cellules microgliales parmi d’autres types de cellules cérébrales. Chaque point représente une seule cellule, et le cluster est codé par couleur en fonction de la similarité transcriptionnelle (Figure 2).

Une analyse d’expression différentielle a été réalisée au sein du groupe de microglies afin d’identifier les gènes modulés dans des conditions expérimentales. Les gènes avec une valeur P ajustée ≤ 0,05 ont été considérés comme exprimés de manière différentielle.

Un graphique volcanique a été généré pour visualiser ces gènes exprimés de manière différentielle des cellules microgliales, en mettant en évidence ceux qui présentent à la fois un changement de pli élevé et une signification statistique élevée (Figure 4).

Pour comparer ces résultats de cellules uniques avec des données de cytométrie en flux, l’expression des marqueurs microgliaux CD45 et CD11b (Ptprc et Itgam) a été examinée. Un UMAP montre leur expression au sein de différentes populations cellulaires (Figure 7).

Enfin, l’expression de marqueurs immunitaires sélectionnés a été évaluée pour caractériser l’hétérogénéité transcriptionnelle entre les cellules microgliales. Un graphique de Violin montre l’expression de gènes tels que CD80 et NOS-, ainsi que Mrc1, Arg1, Fcgr1 et CD163 au niveau de la cellule unique (Figure 8). Ces modèles d’expression de marqueurs permettent de comparer avec le profilage basé sur la cytométrie en flux et mettent en évidence la diversité moléculaire des sous-ensembles microgliaux dans des conditions expérimentales.

Figure 1 : Contrôle de la qualité des données transcriptomiques unicellulaires. (A) Distribution du contenu de l’ARN mitochondrial dans les cellules. Les cellules contenant >30 % d’ARN mitochondrial ont été exclues pour éliminer les cellules potentiellement stressées ou mourantes. (B) Les cellules avec un log10GenesPerUMI > 0,75 ont été filtrées pour assurer un rapport gène/UMI cohérent et réduire le bruit des banques de faible complexité. (C) Les cellules avec moins de 500 transcrits détectés (nUMI) ou plus de 300 gènes détectés (nGENE) ont également été exclues pour éliminer les cellules de mauvaise qualité ou multiples. (D) Graphique de corrélation entre NUMI et nGene illustrant l’impact des seuils de filtrage. Les doublets détectés ont été retirés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Visualisation UMAP de transcriptomes unicellulaires. Graphique UMAP montrant la distribution des cellules uniques sur la base de profils transcriptomiques obtenus à partir de deux animaux individuels. Chaque point représente une cellule, codée par couleur par identité de cluster. L’amas de cellules microgliales est identifié parmi d’autres populations cellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Courbe ROC du classificateur Random Forest évaluée par validation croisée. Courbe ROC (Receiver Operating Characteristic) illustrant les performances du modèle Random Forest utilisé pour distinguer la microglie des autres types de cellules cérébrales en fonction des profils d’expression génique. Le modèle a été entraîné sur un ensemble de ~1000 cellules avec des étiquettes connues et évalué à l’aide d’une validation croisée 10 fois. Parmi les cinq modèles statistiques testés (Random Forest, régression logistique, naïf Bayes, machine à vecteurs de support et arbre de décision), le modèle Random Forest a obtenu les performances de classification les plus élevées. L’aire sous la courbe (AUC) reflète la précision du modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse différentielle de l’expression génique dans les cellules microgliales. Graphique du volcan représentant la variation de log2 par rapport à la valeur P ajustée pour les gènes exprimés de manière différentielle dans la microglie entre les deux groupes expérimentaux (contrôle vs lésion cérébrale cérébelleuse). Le gène régulé à la hausse est plus fortement exprimé dans le groupe d’intérêt (ident.1), et les gènes régulés à la baisse montrent une expression réduite par rapport au groupe de référence (ident.2). Les gènes clés exprimés de manière différentielle significative sont marqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Stratégie de déclenchement pour l’identification de la microglie par cytométrie en flux. (A) Stratégie de déclenchement appliquée aux cellules cérébelleuses d’une souris témoin du jour 3 postnatal (P3). (B) Les maillots ont été choisis pour exclure les doublets. (C) Les cellules viables ont été identifiées à l’aide d’un colorant de viabilité ; les événements avec un faible FSC-A ont été exclus afin d’éliminer les débris et d’assurer l’analyse des cellules intactes. (D) Les microglies ont été identifiées comme CD45⁺ et CD11b⁺ avec deux populations distinctes : CD45 faible-CD11b^int pour la microglie quiescente et CD45 ^{int-CD11b élevé} pour la microglie activée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 6. Caractérisation des profils d’expression des marqueurs microgliaux par cytométrie en flux. (A) Déclenchement séquentiel des cellules CD45⁺ CD11b⁺ basé sur l’expression de CD80, CD86 et iNOS. (B) Identification d’un sous-ensemble exprimant CD206, suivie d’un gate basé sur l’expression de Arg1. (C) Identification d’un sous-ensemble exprimant CD86, suivie d’un gate basé sur l’expression de CD64. (D) Identification d’un sous-ensemble exprimant CD163, suivie d’un gate basé sur l’expression de CD206. Ces stratégies de déclenchement illustrent l’hétérogénéité phénotypique des populations de microglies en fonction de l’expression de marqueurs de surface et intracellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Confirmation de l’identité microgliale à l’aide de l’expression d’Itgam et de Ptprc dans des données de séquençage d’ARN unicellulaire. UMAP affiche le paysage transcriptionnel des cellules cérébelleuses à P15, avec l’expression génique d’Itgam et de Ptprc superposée sur les grappes. La co-expression de ces marqueurs myéloïdes canoniques soutient l’identification des populations de microglies et s’aligne sur les marqueurs utilisés en cytométrie en flux, fournissant une validation croisée entre les analyses transcriptomiques et au niveau des protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Profils d’expression de gènes immunitaires sélectionnés dans des cellules microgliales identifiées par séquençage d’ARN unicellulaire. Les graphiques Violin montrent la distribution de l’expression génique de CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 et CD163 dans les cellules microgliales individuelles. Ces marqueurs sont couramment associés à des processus immunitaires et illustrent l’hétérogénéité transcriptionnelle observée au sein de la population microgliale. Les données sont présentées pour les affections de contrôle et de lésion cérébrale cérébelleuse (CBI). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition des solutions utilisées pour l’isolement et la coloration des cellules neurales. Ce tableau fournit une composition détaillée des solutions nécessaires à l’isolement et à la coloration des cellules, y compris leurs concentrations et composants respectifs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Concentrations du mélange d’anticorps pour la coloration extracellulaire. Ce tableau détaille les concentrations d’anticorps et de solutions vivantes/mortes utilisées pour la coloration extracellulaire, en spécifiant les volumes et les dilutions requis pour chaque anticorps dans le mélange de coloration pour un échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Concentrations du mélange d’anticorps pour la coloration intracellulaire. Ce tableau détaille les concentrations d’anticorps utilisés pour la coloration intracellulaire, en précisant les volumes et les dilutions requis pour chaque anticorps dans le mélange de coloration pour un échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Cette étude présente un protocole détaillé et optimisé qui combine la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) pour l’isolement et la caractérisation des cellules microgliales au cours du développement cérébral postnatal précoce. Bien que la cytométrie en flux reste une technique rentable et accessible, son intégration à la transcriptomique unicellulaire fournit des informations complémentaires en reliant l’expression des marqueurs au niveau des protéines aux profils transcriptionnels au niveau des gènes. Le protocole aborde les défis techniques spécifiques aux tissus cérébraux immatures, notamment la dissociation efficace, l’élimination des débris et de la myéline, et les stratégies d’immunomarquage optimisées, afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité de l’analyse des populations microgliales à travers les principaux points de développement.

La cytométrie en flux a été utilisée pour identifier les sous-ensembles microgliaux en fonction de l’expression de marqueurs de surface et intracellulaires sélectionnés. Plutôt que de déduire des états fonctionnels, les sous-ensembles ont été distingués par leurs profils d’expression de marqueurs, tels que CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺ ; CD206⁺/Arg1⁺ ; Phénotypes CD86⁺/CD64⁺ ou CD163⁺/CD206⁺ . Ces populations définies par des marqueurs reflètent l’hétérogénéité moléculaire au sein du compartiment microglial et fournissent une approche pratique pour la caractérisation à haut débit. Bien que ces classifications basées sur des marqueurs de surface ne permettent pas de saisir toute la complexité de la diversité microgliale, elles restent informatives, en particulier dans les contextes où des outils moléculaires de haute dimension ne sont peut-être pas disponibles. Les classifications binaires telles que le paradigme M1/M2 ont été délibérément évitées, en reconnaissance de la nature spectrale et dépendante du contexte des phénotypes microgliaux, comme décrit dans la littérature récente¹².

Ces observations sont cohérentes avec des études antérieures mettant en évidence le rôle de la microglie à la fois dans la maturation cérébrale normale et en réponse à des stimuli environnementaux ou pathologiques^13,14. La capacité de différencier l’hétérogénéité de la microglie offre des informations précieuses sur la façon dont la polarisation des cellules microgliales peut contribuer aux troubles neurodéveloppementaux^15,16.

Bien que le séquençage de l’ARN unicellulaire offre une résolution plus élevée et permette d’identifier des sous-populations de cellules microgliales distinctes sur le plan transcriptionnel, son coût et sa complexité analytique limitent son accessibilité. Dans l’ensemble de données actuel recueilli au 15e jour postnatal après une lésion périnatale, le pic de la réponse inflammatoire est en grande partie résolu, ce qui entraîne un faible nombre de microglies activées. Par conséquent, les techniques de réduction de la dimensionnalité telles que UMAP n’ont pas récupéré les sous-amas microgliaux bien séparés, et l’analyse transcriptionnelle au niveau des groupes n’a pas été incluse dans le manuscrit de ce protocole.

Une innovation significative de ce protocole est son optimisation pour l’isolement et la caractérisation des cellules microgliales du cervelet au cours des stades postnatals précoces (P3 à P30). Cette région et ce contexte spécifique à l’âge présentent des défis distincts, notamment un faible rendement cellulaire, une teneur en myéline et une fragilité tissulaire accrue. Pour répondre à ces contraintes, le protocole intègre un flux de travail de dissociation adapté, une élimination efficace des débris et de la myéline, et des conditions d’immunomarquage soigneusement ajustées et adaptées aux tissus cérébelleux de petit volume. Malgré la reconnaissance croissante de la microglie cérébelleuse comme fonctionnellement et transcriptionnellement distincte de celles d’autres régions du cerveau, les protocoles détaillés pour leur isolement et leur analyse restent limités. La méthode actuelle offre un flux de travail fiable et accessible, particulièrement adapté aux études développementales de la microglie cérébelleuse.

L’objectif principal de ce manuscrit est de fournir un cadre méthodologique reproductible et adaptable plutôt que de rendre compte de découvertes biologiques spécifiques. Le flux de travail est adapté à l’adaptation à d’autres stades de développement ou à des modèles expérimentaux dans lesquels des états microgliaux transcriptionnellement distincts peuvent être plus importants. Dans de tels contextes, la cytométrie en flux reste un outil précieux, surtout lorsqu’elle est intégrée à des tests complémentaires.

L’une des principales forces de ce protocole est son adaptabilité à travers les différents stades de développement, allant du jour 3 postnatal (P3) au jour 30 postnatal (P30). Cela permet une analyse longitudinale du phénotype de la microglie au fur et à mesure que la maturation cérébrale progresse. L’utilisation combinée de la cytométrie en flux et du scRNA-seq permet d’étudier non seulement les marqueurs de surface, mais aussi les voies de signalisation intracellulaires et les facteurs de transcription impliqués dans les cellules microgliales.

Néanmoins, la digestion enzymatique peut affecter l’expression de certains marqueurs de surface, nécessitant une optimisation minutieuse des conditions de digestion pour des objectifs expérimentaux spécifiques ^17,18. De plus, ni la cytométrie en flux ni le séquençage unicellulaire ne fournissent de données au niveau de la population, qui peuvent ne pas saisir pleinement les nuances spatiales et fonctionnelles des interactions entre les cellules microgliales dans leur environnement d’origine. L’incorporation de techniques spatiales unicellulaires pourrait aider à remédier à cette limitation en préservant le contexte spatial des cellules microgliales. De futures études combinant ce protocole avec des techniques d’imagerie, telles que l’immunohistochimie, l’imagerie in vivo, le western blot ou la transcriptomique spatiale unicellulaire, pourraient offrir des informations complémentaires sur la dynamique des cellules microgliales.

Cette méthode ouvre de nouvelles voies pour étudier comment les agressions précoces de la vie, telles que l’inflammation, l’hypoxie ou les facteurs de stress environnementaux, influencent les phénotypes des cellules microgliales et contribuent aux résultats neurodéveloppementaux à long terme. En permettant une caractérisation précise et fiable des états d’activation des cellules microgliales, il facilite l’identification de cibles thérapeutiques pour moduler les réponses microgliales au début de la vie, dans le but de prévenir ou d’atténuer les troubles neurodéveloppementaux.

En conclusion, ce protocole offre un cadre robuste et accessible pour étudier la diversité des cellules microgliales au cours du développement cérébral précoce. La combinaison de la cytométrie en flux et du séquençage de l’ARN sur cellule unique permet une application flexible à travers divers stades de développement et modèles expérimentaux, facilitant ainsi une exploration plus approfondie de la biologie de la microglie dans des contextes physiologiques et pathologiques.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 et micro ; Filtre à mailles métalliques M  ;	Sigma-Aldrich	S3895
Tube de 15 mL	Sarstedt	62.554.205
Tube de 5 mL	Sarstedt	55.526.006
Plaque à 96 puits à fond conique  ;	Sarstedt	82.1583.001
Arginase 1 - Conjugué Pecy7 - Clone : A1exF5	Thermo Fisher Scientific	25-3697-82
Réactifs fluorescents stables sur paillasse	Invitrogen	N° A49905
CD11b - Fitc conjugué - Clone : M1/70	BD Pharmingen	553310
CD163 - Conjugué SB600 - Clone : TNKUPJ	Thermo Fisher Scientific	63-1631-82
CD206 - APC conjugué - Clone : C068C2	BioLégende	141708
CD45 - Conjugué A700 - Clone : 30-F11	BD Pharmingen	560510
CD64 - Conjugué  ; PerCP-eF710 - Clone : X54-5/7.1	Thermo Fisher Scientific	46-0641-82
CD80 - Conjugué SB436 - Clone : 16-10A1	Thermo Fisher Scientific	62-0801-82
CD86 - Pe conjugué - Clone : GL-1	BioLégende	105008
Collagénase D	Sigma&ndash ; Aldrich	11088866001
DNase I	Sigma&ndash ; Aldrich	10104159001
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma&ndash ; Aldrich  ;	F1051
HBSS (solution saline équilibrée de Hank) 10x	Wisent Bioproducts  ;	Référence 311506CL
Hémocytomètre	VWR International	82030-470
HEPES	Wisent Bioproducts  ;	330.050.EL
iNOS - Conjugué PE- eF610 - Clone : CXNFT	Thermo Fisher Scientific	61-5920-82
Kcl	Thermo Fisher Scientific	BP366-500
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362-500
Amcyan vivant/mort	Thermo Fisher Scientific	N° L34957
Milieux de culture de cellules microgliales	Technologies de la vie	Référence A12475-01
Na2HPO4	Thermo Fisher Scientific	Réf. BP332-500
NaCl	Thermo Fisher Scientific	Réf. BP358-212
Paraformaldéhyde	Sigma&ndash ; Aldrich  ;	Réf. P6148
Anti souris rat CD16/CD32	BD Biosciences  ;	553142
Saponine	Sigma&ndash ; Aldrich  ;	S7900
Banques scRNAseq	Génomique 10X	1000121
Milieu colloïdal à base de silice	Thermo Fisher Scientific	45001747
Azoture de sodium	Thermo Fisher Scientific	BP922I-500
Bleu trypan	Gibco	1525006