Mesure de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dans les tissus solides à l’aide d’un test immuno-enzymatique compétitif (ELISA)

Résumé

Ce protocole mesure les concentrations cycliques de guanosine monophosphate (GMPc) dans les tissus solides à l’aide d’un test immuno-enzymatique compétitif (ELISA). Le protocole décrit comment traiter les tissus solides, effectuer des tests ELISA compétitifs, convertir les absorbances en concentrations de GMPc en picomoles par millilitre et calculer les concentrations finales en nanomoles de GMPc par gramme de tissu.

Résumé

L’une des principales voies qui produit de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) est la voie de l’oxyde nitrique (NO)-GMPc. Dans cette voie, le NO stimule l’activité catalytique de la guanylyl cyclase soluble (sGC), qui convertit la guanosine triphosphate en GMPc. Le NO est intéressant car, chez les mammifères, il agit comme le principal vasodilatateur, un inhibiteur de l’agrégation plaquettaire, un médiateur de la fonction immunitaire, un neurotransmetteur et pour améliorer l’endurance pendant l’activité physique, entre autres rôles physiologiques. Mesurer l’abondance du NO dans différents tissus pourrait aider à élucider ses fonctions. Cependant, le NO ne peut pas être mesuré directement en raison de sa demi-vie de moins de quelques secondes. En règle générale, les métabolites du NO, le nitrate et le nitrite, sont mesurés pour estimer l’abondance du NO. En effet, ces molécules peuvent être interconverties in vivo par des réactions d’oxydoréduction. Une méthode moins courante d’estimation de l’abondance du NO consiste à mesurer la concentration de GMPc, une molécule de signalisation en aval du NO. Pourtant, la mesure du GMPc dans les tissus est rarement effectuée, bien qu’elle permette de mieux comprendre les fonctions du NO dans les organes. Par conséquent, il est nécessaire de disposer d’un protocole pour mesurer les concentrations de GMPc dans les organes et les tissus solides. Dans ce protocole, les tissus de porc collectés ont été homogénéisés, un test ELISA compétitif a été effectué sur des échantillons traités et les absorbances ont été converties en nanomoles de GMPc par gramme de tissu d’origine. En bref, ce protocole définit une méthode simpliste pour mesurer les concentrations de GMPc dans les tissus solides à l’aide du kit ELISA cyclique GMP.

Introduction

La guanosine monophosphate cyclique (GMPc) est une molécule de signalisation capable d’induire des changements physiologiques par la voie de l’oxyde nitrique (NO)-GMPc. Dans la voie NO-GMPc, le NO se lie à la guanylyl cyclase soluble, une enzyme cytosolique qui convertit la guanosine triphosphate en GMPc, augmentant ainsi son activité catalytique ^1,2. L’augmentation subséquente des concentrations de GMPc active les voies de signalisation qui favorisent la vasodilatation³, entraînant une diminution de la pression artérielle ^4,5, la principale réponse physiologique caractéristique de la présence de NO in vivo. De plus, le NO est connu pour influencer la fonction immunitaire⁶, améliorer l’endurance pendant l’activité physique⁴ et prévenir la coagulation sanguine en inhibant l’agrégation plaquettaire⁷.

La mesure directe du NO est rendue difficile par sa demi-vie in vivo^de moins de quelques secondes dans la plupart des tissus biologiques. Par conséquent, pour élucider les effets physiologiques du NO, il faut disposer d’une méthode permettant de mesurer son abondance ex vivo. Par conséquent, les méthodes quantitatives utilisables évitent la mesure directe du NO. Une méthode courante pour estimer les concentrations de NO dans les tissus consiste à mesurer les métabolites les plus stables du NO : nitrite et nitrate 4,5,9,10,11. La principale complication de l’utilisation des concentrations de nitrite et de nitrate comme mesures de l’abondance du NO est que les deux métabolites servent également de précurseur et de molécule de stockage, respectivement. Les métabolites du NO, en particulier le nitrate, sont abondants dans certains aliments. Par conséquent, les changements dans les concentrations de GMPc, le GMPc étant en aval du NO, sont utiles pour estimer les quantités de NO actif, et l’abondance du NO peut être déterminée sans l’interférence des nitrites et des nitrates précédemment présents.

Des recherches antérieures reposaient sur la mesure des concentrations de GMPc dans le plasma¹² et les plaquettes¹³, mais la mesure des concentrations de GMPc dans les tissus solides est moins courante. La capacité de mesurer les concentrations de GMPc dans les tissus solides permettrait de caractériser l’activité du NO dans des organes spécifiques. L’objectif était d’identifier une méthode simpliste pour mesurer le GMPc dans les tissus solides à l’aide d’ELISA compétitif. L’un des avantages de l’utilisation d’un test ELISA compétitif est qu’il nécessite un équipement que l’on trouve couramment dans la plupart des laboratoires intéressés par le NO, comme un lecteur de microplaques souvent utilisé à d’autres fins. En comparaison, certaines autres méthodes de mesure nécessitent des équipements peu utilisés lors d’expériences axées sur le NO, tels que les microscopes^14,15, un compteur de scintillation¹⁶ ou un laser¹⁷. En plus de son accessibilité, la mesure cGMP avec un ELISA compétitif est sensible ; Les concentrations de GMPc peuvent être détectées jusqu’à 0,1 picomole (pmol) de GMPc/mL¹⁸. Avec des modifications mineures apportées au protocole¹⁸ du kit ELISA (Table of Materials) cGMP, une méthode de mesure cGMP dans les tissus solides à l’aide d’ELISA compétitifs a été établie.

Protocole

Toutes les interventions sur les animaux ont été effectuées conformément au protocole d’étude animale de la Direction de la médecine moléculaire approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux du NIDDK (ASP K049-MMB-23). Le prélèvement de tissus a suivi les lignes directrices établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut de recherche en santé MedStar (numéro de protocole : 2006001373 2020-017). De jeunes porcs croisés Yorkshire adultes (deux mâles et deux femelles), âgés de 3 mois et pesant entre 30 et 35 kg, ont été utilisés dans l’étude. La figure 1 illustre un schéma montrant les étapes du protocole du kit ELISA cGMP. Les réactifs et l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

Figure 1 : schéma du protocole. Un schéma illustrant les étapes du protocole du kit ELISA cGMP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation de l’échantillon de tissu

REMARQUE : Les tissus ont été perfusés avec une solution d’héparine sodique avant le prélèvement, puis conservés à -80 °C avant utilisation. Voir Park et ^coll.19 pour plus de détails sur le prélèvement des échantillons de tissus.

1. Traitement d’échantillons de tissus
   1. Réfrigérez un pulvérisateur de tissus, une pince à épiler et une cuillère sur de la glace sèche pendant 10 minutes avant de commencer la procédure.
   2. Pesez un excès de tissu, car une partie peut être perdue lors de la pulvérisation (rendement autour de 90 %).
      REMARQUE : Auparavant, un excès de 170 mg donnait de bons résultats. La masse peut être augmentée ou diminuée, si vous le souhaitez. S’assurer que la masse tissulaire donne un volume d’échantillon suffisant pour les étapes d’acétylation et de dilution de l’échantillon de tissu.
   3. Ajoutez le mouchoir dans le pulvérisateur sur de la glace sèche.
   4. Congelez le tissu avec de l’azote liquide et laissez l’azote liquide se vaporiser complètement.
   5. Remettez le couvercle du pulvérisateur et frappez-le 15 fois avec un maillet.
      REMARQUE : Si l’installation du pulvérisateur n’est pas disponible ou ne peut pas être utilisée, l’échantillon doit être coupé en morceaux aussi petits que possible à l’aide de ciseaux ou d’un scalpel pendant qu’il est conservé congelé ou au moins réfrigéré sur de la glace. Cette étape assure une bonne homogénéisation et est cruciale, en particulier pour les tissus plus durs.
   6. Tarez un tube d’homogénéisation à billes et transférez le tissu pulvérisé dans le tube à l’aide de la cuillère réfrigérée et de la pince à épiler.
   7. Enregistrez la masse de tissu ajoutée dans le tube d’homogénéisation des billes pour convertir plus tard les concentrations de molarité en moles par masse. Conservez l’échantillon sur de la glace.
   8. Dans le tube d’homogénéisation, ajoutez un volume en microlitres d’acide chlorhydrique 0,1 N égal à un multiple de la masse tissulaire en milligrammes.
      REMARQUE : Des dilutions appropriées font que les échantillons mesurés se situent sur la courbe standard. Ces dilutions sont trouvées pour différents types de tissus par essais et erreurs. Dans des expériences précédentes, un taux de dilution de 1:10 pour le tissu musculaire squelettique et un rapport de dilution de 1:5 pour le tissu hépatique ont donné des résultats positifs. À titre de référence, si l’on dilue 100 mg de tissu, un rapport de dilution de 1:10 nécessiterait 1 000 μL d’acide chlorhydrique 0,1 N, et un rapport de dilution de 1:5 nécessiterait 500 μL.
   9. Homogénéiser les échantillons de tissus à l’aide d’un homogénéisateur de broyeur à billes ou d’une technique comparable.
      REMARQUE : Refroidissez de temps en temps l’échantillon pendant l’homogénéisation à l’aide de glace. S’il n’existe pas d’homogénéisateur de broyeur à billes, d’autres méthodes d’homogénéisation qui perturbent efficacement les cellules et créent un homogénat tissulaire peuvent être substituées, y compris l’utilisation d’un homogénéisateur rotatif ou d’un homogénéisateur à ultrasons.
   10. La centrifugeuse s’homogéne pendant 30 min à une vitesse de 17 000 x g tout en maintenant une température d’échantillon de 4 °C.
       REMARQUE : Les homogénats de tissu musculaire squelettique insuffisamment dilués deviennent trop visqueux et gélifiés. Cela se voit mieux après la centrifugation.
   11. Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation et centrifugez-le pendant 10 min à 17 000 x g tout en maintenant une température de 4 °C.
   12. Transférez une aliquote de surnageant dans un tube de microcentrifugation et conservez l’échantillon sur de la glace.
       REMARQUE : L’acétylation de 250 μL de surnageant a donné des résultats positifs. Pour interrompre le protocole, congelez ces échantillons à -80 °C et conservez-les jusqu’à 48 h. Il est recommandé de mesurer le volume de surnageant pour le processus d’acétylation le jour de l’acétylation.

2. Préparation standard

REMARQUE : Préparez les étalons le jour de la préparation des microplaques ELISA.

1. Préparation du tampon ELISA
   1. Ajoutez 10 concentrés tampons ELISA décongelés dans une bouteille en verre contenant 90 ml d’eau ultrapure.
      REMARQUE : Prenez soin de rincer le concentré de tampon ELISA résiduel 10x avec le tampon ELISA préparé et de remettre le tampon dans la bouteille en verre. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 mois.
2. Préparation standard de la matière
   1. Ajouter 1 mL de tampon ELISA dans le flacon standard et agiter pour dissoudre.
      REMARQUE : Conserver à 4 °C jusqu’à 6 semaines.
3. Dilution en série standard
   1. Étiquetez un tube standard B et neuf tubes standard 0 à standard 8.
   2. Ajoutez 9,9 ml de tampon ELISA dans le tube étiqueté standard B.
   3. Transférez 100 μL de la pâte standard (300 pmol/mL de cGMP) dans le tube B standard et faites un tourbillon complet.
   4. Transférez 1 000 μL de la solution dans le tube standard B dans le tube standard 1.
   5. Ajoutez 500 μL de tampon ELISA dans le tube étiqueté standard 0 et les tubes étiquetés standard 2 dans le standard 8.
   6. Vortex étalon 1, puis transférez 500 μL de solution de l’étalon 1 à l’étalon 2.
   7. Vortex étalon 2, puis transférez 500 μL de solution de l’étalon 2 à l’étalon 3.
   8. Continuez à transférer 500 μL de l’étalon n-1 à l’étalon n, en vous assurant de bien arrondir les étalons après chaque ajout.
   9. Jeter 500 μL de solution de l’étalon 8.
      REMARQUE : Assurez-vous de respecter les normes de vortex lorsque cela est spécifié pour une courbe standard optimale. Les étalons 0 à 8 sont d’un volume de 500 μL. Conservez les étalons à 4 °C jusqu’à utilisation. Utiliser les étalons le jour de leur dilution.

3. Acétylation

REMARQUE : Au cours de la réaction d’acétylation, un groupe acétyle est ajouté au groupe hydroxyle 2' de la molécule de GMPc, ce qui modifie la structure du GMPc et entraîne une augmentation de l’affinité de liaison des anticorps, améliorant ainsi la sensibilité du test ~ 10 fois. Dans les échantillons contenant plus de 1,0 pmol/mL de GMPc, les mesures peuvent être prises sans acétylation, et cette étape peut être omise. Le besoin d’acétylation doit être déterminé expérimentalement, au cas par cas.

1. Préparation à base d’hydroxyde de potassium
   1. Ajoutez 10 ml d’eau ultrapure dans la bouteille d’hydroxyde de potassium pour créer une solution à 4 M.
      REMARQUE : Ne bouchez pas la bouteille car l’hydroxyde de potassium se dissout. Conserver pendant des mois à température ambiante.
2. Acétylation d’échantillons de tissus
   1. À une aliquote de 250 μL de l’échantillon, ajouter 50 μL (5:1) d’hydroxyde de potassium 4 M et suivre rapidement l’ajout de 12,5 μL (20:1) d’anhydride acétique.
   2. Vortex pendant 15 s.
   3. Ajouter 12,5 μL d’hydroxyde de potassium 4 M à l’échantillon et agiter brièvement.
   4. Facultatif : Si des échantillons de muscle squelettique se solidifient après les étapes d’acétylation, centrifugez les échantillons à 17 000 x g pendant 10 min.
3. Acétylation des étalons
   1. Dans le tube étiqueté étalon 0, ajoutez 100 μL d’hydroxyde de potassium 4 M, immédiatement suivis de 25 μL d’anhydride acétique.
   2. Vortex la norme pour 15 s.
   3. Ajouter 25 μL d’hydroxyde de potassium 4 M à l’étalon et agiter brièvement.
   4. Répétez ces étapes pour les autres normes numérotées.
      REMARQUE : Vortex tous les échantillons et étalons pour la même durée afin d’assurer des résultats cohérents.

4. Dilution de l’échantillon de tissu

1. Ajoutez des rapports prédéterminés de tampon ELISA et une aliquote d’échantillon acétylé dans un tube de microcentrifugation.
   REMARQUE : Deux dilutions différentes sont requises pour chaque échantillon. Les taux de dilution qui font chuter les concentrations GMPc mesurées sur la courbe standard sont trouvés par essais et erreurs. Les dilutions doivent être déterminées expérimentalement pour chaque type de tissu afin que le pourcentage se situe entre 20 % et 80 %. Dans des expériences précédentes mesurant les tissus hépatiques, des rapports de dilution de 1:2 et 1:3 ont donné des résultats positifs avec les valeurs de pourcentage appropriées. Ces ratios ont également donné des résultats positifs pour les muscles squelettiques. Cependant, les variations du tissu musculaire squelettique peuvent nécessiter des échantillons plus dilués.
2. Facultatif : Si un précipité se forme lors de l’ajout de l’échantillon de tissu au tampon ELISA, centrifugez l’échantillon pendant 10 min à 17 000 x g.

5. Préparation des microplaques ELISA

1. Préparation du traceur de l’acétylcholinestérase (AChE)
   1. Ajouter 6 ml de tampon ELISA dans le flacon traceur AChE et agiter doucement pour dissoudre.
      REMARQUE : Conservez l’échantillon à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Ne faites pas de vortex.
2. Préparation antisérum
   1. Ajouter 6 ml de tampon ELISA dans le flacon d’antisérum et agiter doucement pour dissoudre.
      REMARQUE : Conserver à 4 °C pendant au moins 4 semaines. Ne faites pas de vortex.
3. Incubation de l’échantillon et de l’étalon
   1. Vortex standard 0.
   2. À la microplaque ELISA, ajouter 50 μL d’aliquotes de puits standard 0 à 5 (NSB et B₀ ; Figure 2).
   3. À deux des puits (NSB ; Graphique 2) contenant l’étalon 0, ajouter 50 μL de tampon ELISA.
   4. À l’aide d’une pointe de pipette, ajoutez en double exemplaire 50 μL d’aliquotes des étalons 1 à 8 sur la microplaque ELISA. Commencez par l’étalon le plus dilué (étalon 8), puis passez à l’étalon le plus dilué suivant jusqu’à ce que tous les étalons soient ajoutés.
      REMARQUE : Aspirez et distribuez chaque étalon plusieurs fois avant de l’ajouter dans un puits. Vortex avant de les ajouter aux puits.
   5. Vortex chaque échantillon avant d’ajouter 50 μL d’aliquotes dans les puits en double ou en triple.
   6. Ajouter 50 μL de traceur AChE à chaque NSB, B₀, étalon et puits d’échantillonnage (Figure 2).
   7. Ajouter 50 μL d’antisérum à chaque B₀, étalon et puits d’échantillonnage (Figure 2).
   8. Couvrir la microplaque ELISA et incuber à 4 °C pendant 18 h.
      REMARQUE : Assurez-vous de vortex chaque fois que vous y êtes invité pour produire des résultats cohérents.
4. Préparation du tampon de lavage
   1. Dans une bouteille en verre, ajoutez 200 ml d’eau ultrapure et 500 μL de concentré de tampon de lavage 400x.
   2. À l’aide d’une seringue, ajoutez 100 μL de polysorbate 20 dans le flacon en verre.
   3. Secouez doucement le flacon pour mélanger.
      REMARQUE : Conservez le tampon de lavage à 4 °C jusqu’à 2 mois. Doublez les volumes d’eau ultrapure, de concentré de tampon de lavage 400x et de polysorbate 20 pour une microplaque complète de 96 puits d’échantillons.
   4. Transférez le tampon de lavage dans une bouteille de lavage avant utilisation.
5. Préparation du réactif d’Ellman
   REMARQUE : Préparez le jour du développement des microplaques ELISA.
   1. Dans un contenant protégé de la lumière, ajoutez 20 ml d’eau ultrapure.
   2. Utilisez une aliquote de l’eau ultra-pure pour dissoudre le réactif d’Ellman.
   3. Transférez le réactif d’Ellman dans le récipient protégé de la lumière.
   4. Utilisez le réactif d’Ellman pour rincer la bouteille dans laquelle il est provenant.
   5. Transférez toute la solution dans le récipient protégé contre la lumière à l’aide d’une pipette.
6. Lavage de microplaques ELISA
   1. Éliminez le contenu de la microplaque ELISA en la retournant. Assurez-vous que les puits sont vidés en tapotant la microplaque ELISA inversée sur une serviette en papier.
   2. Remplissez les puits avec un tampon de lavage à l’aide de la bouteille de lavage.
   3. Agitez doucement la microplaque ELISA pendant 5 secondes, puis videz le tampon de lavage et tapotant le liquide restant sur une serviette en papier.
   4. Remplissez la microplaque ELISA avec un tampon de lavage, agitez doucement la microplaque ELISA pendant 30 secondes et videz son contenu. Répétez cette opération quatre fois, en tapotant la microplaque ELISA sur une serviette en papier après chaque vidage pour retirer le liquide restant.
      REMARQUE : Évitez les lectures d’absorbance inexactes en lavant soigneusement la microplaque ELISA.
7. Développement et lecture de microplaques ELISA
   1. Transférez le réactif d’Ellman dans un réservoir.
   2. Pour travailler rapidement, utilisez une pipette multicanaux pour aliquote 200 μL de réactif d’Ellman dans le blanc, le NSB, le B₀, le TA, l’étalon et les puits d’échantillon.
   3. Ajouter 5 μL de traceur AChE dans le puits TA.
   4. Couvrez la microplaque ELISA avec un parafilm, placez-la dans un récipient protégé de la lumière et incubez à température ambiante pendant 60 à 90 minutes en agitant.
      REMARQUE : Utilisez les puits B₀ comme indicateurs du temps d’incubation approprié. Les puits B₀ idéaux apparaissent visiblement jaunes mais pas foncés.
   5. Retirez le film de paraffine et lisez la microplaque ELISA à une densité optique de 412 nm.
      REMARQUE : Les puits B₀ avec une absorbance comprise entre 0,3 UA et 1,0 UA, avec les blancs soustraits, indiquent que la microplaque ELISA est correctement développée.
   6. Optionnel: Si la microplaque ELISA est sous-développée, remplacez le film de paraffine et laissez-le incuber dans un récipient protégé de la lumière pendant une période supplémentaire. Si la microplaque ELISA est surdéveloppée, jetez le réactif d’Ellman, rincez une fois avec un tampon de lavage et redéveloppez la microplaque ELISA avec le réactif d’Ellman.

Figure 2 : Disposition des microplaques. Un exemple de disposition de microplaque pour l’ELISA compétitif. NSB indique un puits de liaison non spécifique. B₀ indique un puits de liaison maximum. L’AT indique bien une activité totale. Std. indique un puits standard avec son numéro correspondant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Conversion à la concentration

1. Calculs du traceur AChE lié
   1. Faites la moyenne des absorbances des deux blancs et soustrayez la moyenne des absorbances de chaque puits.
      REMARQUE : Utilisez les absorbances soustraites à blanc pour le reste des calculs.
   2. Calculez les absorbances moyennes des puits NSB, B₀ et blancs.
   3. Utilisez l’équation suivante pour calculer l’absorbance B₀ corrigée :
      
      REMARQUE : Corr. signifie corrigé, Abs. signifie absorbance et Moy. signifie moyen. Si l’absorbance moyenne des puits blancs (avec la moyenne des trous soustraite) est un nombre négatif, utilisez zéro pour le calcul.
   4. Calculez le rapport pour chaque étalon et échantillon à l’aide de l’équation suivante :
      
   5. Multipliez le rapport de chaque échantillon par 100 pour calculer le pourcentage .
      REMARQUE : Les échantillons entre 20 % et 80 % tombent sur la courbe standard.
2. Calculs de courbes standard
   1. Faites la moyenne du rapport des puits dupliqués de chaque étalon (1 à 8).
   2. Calculez le logit du rapport moyenné de chaque étalon à l’aide de l’équation suivante :
      
   3. À l’aide des concentrations connues de chaque étalon (tableau 1) comme valeurs X et du logit de chaque étalon comme valeurs Y, calculez la pente et l’ordonnée à l’origine.
   4. Calculer le coefficient de détermination en utilisant le log₁₀ des concentrations normalisées connues de GMPc comme valeurs X et le logit de chaque étalon comme valeurs Y.
      REMARQUE : Vérifiez que le coefficient de détermination est proche de 1.
3. Calculs de concentration cGMP en pmol/mL
   1. Calculez le logit de chaque échantillon à l’aide de l’équation suivante :
      
   2. Pour calculer la concentration de GMPc dans chaque échantillon (en picomoles de GMPc par millilitre d’échantillon), utilisez l’équation suivante :
      
      REMARQUE : D.R. est l’abréviation de taux de dilution. La somme des homogénats D.R. pour les échantillons de foie dilués avec un rapport de dilution de 1:5 de l’acide chlorhydrique est égale à 6. La somme des D.R. du tampon pour les échantillons de foie dilués avec un rapport de dilution de 1:2 du tampon ELISA est égale à 3. Par conséquent, les termes regroupés entre parenthèses sont multipliés par 18.
4. Calculs de la concentration cGMP en nmol/g
   1. Calculez les nanomoles de GMPc par puits avec l’équation suivante :
      
   2. Calculez les grammes de tissu dans chaque échantillon acétylé à l’aide de l’équation suivante :
      
      REMARQUE : « mg de tissu » est la masse de tissu ajoutée au tube d’homogénéisation en milligrammes. « volume de HCl utilisé » est le volume d’acide chlorhydrique 0,1 N utilisé pour diluer les échantillons en vue de leur homogénéisation.
   3. Calculez les grammes de tissu dans chaque échantillon dilué avec un tampon ELISA à l’aide de l’équation suivante :
      
      REMARQUE : « volume d’échantillon dilué » est le volume d’échantillon dilué par un tampon ELISA. « 250 μL » est le volume de l’échantillon acétylé. Les « réactifs » mentionnés sont les réactifs d’acétylation 4 M KOH et l’anhydride acétique.
   4. Calculez les grammes de tissu par puits à l’aide de l’équation suivante :
      
      REMARQUE : Le « volume de tampon » est le volume de tampon ELISA utilisé pour diluer les échantillons de tissus avant de les ajouter dans les puits.
   5. Divisez les nanomoles de GMPc par puits par les grammes de tissu par puits pour calculer la concentration de GMPc en nmol/g.

Numéro standard	Concentrations de GMPc (pmol/mL)
Norme 1	3.0
Norme 2	1.5
Norme 3	0.75
Norme 4	0.375
Norme 5	0.1875
Norme 6	0.09375
Norme 7	0.046875
Norme 8	0.0234375

Tableau 1 : Concentrations standard. Les concentrations connues des étalons 1 à 8.

Résultats

Des porcs domestiques du Yorkshire traités avec du chlorure de sodium alimentaire (0,15 mmol/kg) ou du nitrate ^{marqué au 15}N (0,15 mmol/kg) administrés une fois par jour pendant cinq jours consécutifs en bolus dans la nourriture ont été perfusés avec une solution d’héparine sodique (chlorure de sodium à 0,9 %) avant le prélèvement tissulaire ; Tous les détails de la collection ont été publiés précédemment¹⁹. Les concentrations de GMPc dans les muscles fessiers et le foie de quatre porcs domestiques Yorkshire ont été mesurées conformément au protocole ELISA décrit. Les tissus hépatiques ont été dilués dans un rapport de dilution de 1:5 et les muscles fessiers dans un rapport de dilution de 1:10, avec de l’acide chlorhydrique (HCl) de 0,1 N pour précipiter les protéines. Les homogénats dilués au HCl ont été acétylés, puis dilués avec un tampon ELISA dans un rapport de dilution de 1:2 et 1:3 pour les échantillons de muscle hépatique et fessier. Les concentrations de GMPc ont été mesurées comme décrit ci-dessus. Les absorbances ont été converties en picomoles de GMPc par millilitre d’échantillon préparé, puis en nanomoles de GMPc par gramme de tissu (nmol/g de tissu) comme indiqué dans le protocole ci-dessus.

Les concentrations de GMPc mesurées dans les tissus hépatiques ont produit des résultats expérimentaux optimaux dans les conditions ci-dessus. Les concentrations de GMPc dans le groupe témoin et dans le groupe traité au nitrate dans le foie porcin sont respectivement de 0,0202 nmol/g ± 0,003 nmol/g de tissu et de 0,0364 nmol/g ± 0,011 nmol/g de tissu (figure 3). Plusieurs valeurs confirment la fiabilité des résultats. Les absorbances des puits B₀ avec les blancs soustraits, qui vont de 0,466 à 0,475, se situent dans la plage de 0,3 UA à 1,0 UA, vérifiant un développement suffisant de microplaques avec le réactif d’Ellman. La haute qualité de la courbe standard est démontrée à la fois par des augmentations progressives des absorbances de la norme 1 à la norme 8 et par la linéarité de la courbe standard, vérifiée par un coefficient de détermination de 0,99. Le pourcentage pour chaque puits mesuré (31,5 %-71,2 %) est compris entre 20 % et 80 %, ce qui confirme que tous les échantillons se situent sur la courbe standard. Les échantillons qui possèdent les caractéristiques indiquées sont propres à l’interprétation.

Les concentrations de GMPc mesurées dans les tissus musculaires fessiers ont produit des résultats expérimentaux sous-optimaux. L’étiquette sous-optimale est attribuée aux résultats du muscle fessier parce que la plupart des valeurs en pourcentage des puits du muscle fessier (3,69 %-27,3 %) sont tombées en dessous de 20 %, ce qui indique que des échantillons plus dilués étaient nécessaires pour que les absorbances tombent sur la courbe standard. Les concentrations de GMPc dans le groupe témoin et dans le groupe traité au nitrate dans le muscle fessier porcin sont respectivement de 1,22 nmol/g ± 0,49 nmol/g de tissu et de 0,732 nmol/g ± 0,18 nmol/g de tissu (graphique non illustré). Les échantillons de muscle fessier partagent les absorbances des puits et des étalons B₀ des échantillons de foie. L’utilisation de ces échantillons sous-optimaux peut conduire à des conclusions erronées ; par conséquent, la préparation d’échantillons plus dilués et une nouvelle mesure des concentrations de GMPc sont nécessaires.

Figure 3 : Concentration de GMPc dans le tissu hépatique. Concentration moyenne de GMPc du foie porcin traité au chlorure de sodium (0,15 mmol/kg) ou au nitrate ^{marqué au 15}N (0,15 mmol/kg) en nmol/g de tissu. n = 4 ; les barres d’erreur indiquent l’écart-type ; les données ont été analysées par le test t de Welch ; ns signifie aucune signification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole fournit des instructions sur les étapes nécessaires pour mesurer les concentrations de GMPc dans les tissus solides à l’aide de l’ELISA compétitif. Les variations des concentrations de GMPc peuvent indiquer des différences dans l’abondance du NO dans les tissus. En étudiant ces différences dans les tissus solides, il est possible d’obtenir des informations sur le NO dans divers organes.

Dans le protocole, des échantillons de tissus ont d’abord été homogénéisés en vue de l’ELISA. Cela a commencé par la congélation instantanée d’une masse de tissu solide, puis par sa pulvérisation. La fragmentation des tissus avant l’étape d’homogénéisation vise à aider l’homogénéisateur de billes à lyser les cellules. Les tissus ont été homogénéisés dans de l’acide chlorhydrique 0,1 N pour précipiter les protéines, une technique utilisée dans d’autres méthodes^20,21. Enfin, les solides et le précipité ont été séparés des composants solubles par centrifugation. Pour obtenir la courbe standard, un stock de cGMP (300 pmol de cGMP/mL) a été dilué en série pour obtenir huit étalons différents. Les étalons et les échantillons ont été acétylés pour améliorer la sensibilité du test en détectant des concentrations allant jusqu’à 0,1 pmol de GMPc/mL. Cette augmentation de la sensibilité est obtenue lorsque le groupe acétyle forme une liaison avec le GMPc, améliorant ainsi la capacité de chaque anticorps (présent dans l’antisérum) à se lier au^{GMPc 18} acétylé. L’acétylation des étalons et des échantillons assure l’uniformité de la liaison cGMP entre les puits. L’étape d’acétylation peut être omise pour les étalons et les échantillons si l’on s’attend à ce que la concentration de GMPc dans les puits de microplaques dépasse 1,0 pmol/mL¹⁸.

En préparation de l’ajout d’échantillons dans les puits, les échantillons ont été dilués avec un tampon ELISA. La dilution supplémentaire a permis aux échantillons de se situer sur la courbe standard et de ressembler davantage au contenu du NSB, du B₀ et des puits standard, créant ainsi une uniformité. En plus des échantillons et des étalons, plusieurs autres solutions sont mélangées dans les puits. Dans les puits NSB, un tampon ELISA (avec et sans réactifs d’acétylation) est ajouté tandis que l’antisérum est retenu. Il s’agit de déterminer la quantité de traceur AChE (acétylcholinestérase liée à la GMPc) qui se lie à l’IgG de souris adhérant au puits en l’absence de l’anticorps spécifique qui compose l’antisérum. Les puits B₀ contenaient un tampon ELISA (avec les réactifs d’acétylation), un traceur AChE et un antisérum ; par conséquent, les puits B₀ présentent la capacité de liaison du traceur AChE sans la concurrence de cGMP. Une fois que tous les puits sont remplis de manière appropriée, la microplaque est incubée puis lavée. Le réactif d’Ellman a été ajouté aux puits. Enfin, un traceur AChE a été ajouté à l’AT bien après l’ajout du réactif d’Ellman. Cela représente bien l’activité catalytique du traceur AChE, quelle que soit la quantité de traceur liée à la microplaque par les anticorps. La microplaque a été développée à température ambiante, ce qui a permis au traceur AChE de catalyser une réaction colorimétrique.

Plusieurs étapes du protocole peuvent modifier les résultats de l’analyse ; Des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l’exécution des étapes qui suivent pour des résultats optimaux. L’identification de dilutions appropriées pour chaque type de tissu pour l’étape d’homogénéisation et après acétylation est nécessaire pour garantir que les échantillons tombent sur la courbe standard. Lors de la préparation des étalons, les solutions doivent être soigneusement vortex ou mélangées avant le retrait d’une aliquote ou après l’ajout d’une aliquote. Cette étape est importante pour atteindre les concentrations cGMP attendues de chaque étalon. Au cours des étapes d’acétylation, chaque étalon et échantillon doit être vortex pendant la même durée pour obtenir des lectures d’absorbance cohérentes. Les étalons et les échantillons doivent également être échantillonnés immédiatement avant l’ajout d’une aliquote dans le puits approprié. Cette pratique permet d’obtenir des concentrations cGMP plus précises. Un lavage minutieux de la microplaque améliore également la précision des valeurs d’absorbance, car il élimine tous les traceurs AChE non liés du puits. Après l’ajout du réactif d’Ellman, il faut laisser suffisamment de temps à la microplaque pour se développer, en accordant une attention particulière à la couleur et, surtout, aux absorbances des puits B₀ . Il est important de reconnaître que la concentration de GMPc entre les doublons ou les triplicates peut varier davantage dans les échantillons dont les concentrations sont inférieures à celles dont les concentrations sont plus élevées. La mesure d’un échantillon plus concentré peut aider à résoudre ce problème. De plus, pour tenir compte de toute variabilité entre les microplaques, les échantillons du même type de tissu doivent être mesurés sur la même plaque, dans la mesure du possible. Le respect de ces lignes directrices devrait améliorer la qualité des données obtenues dans le cadre du test.

Le protocole ci-dessus peut être extrapolé à d’autres tissus mous et solides. Le développement ultérieur de la sous-section sur la préparation des tissus du protocole ci-dessus pourrait aboutir à une méthode adaptée au traitement des tissus durs, y compris les os, qui peuvent présenter un intérêt en raison de leur vascularisation. Le développement continu de cette technique pourrait aboutir à une méthode adaptée pour mesurer les concentrations de GMPc dans une grande variété de tissus solides, ce qui constituerait une méthode utile pour recueillir des informations supplémentaires sur l’abondance du NO dans pratiquement tous les tissus. Bien que le protocole ELISA compétitif mentionné ci-dessus soit une technique utile pour mesurer le GMPc et estimer l’abondance du NO, il présente deux limites notables : (1) Ce test ne fait pas de distinction entre le GMPc synthétisé par la guanylylcyclase soluble et le GMPc synthétisé par la guanylyl cyclase particulaire (pGC). Les peptides natriurétiques stimulent l’activité^{pGC 22} et, par conséquent, les modifications du GMPc par cette voie n’indiquent pas de modifications de l’abondance du NO ; (2) De plus, les enzymes phosphodiestérases (PDE) influencent les résultats du test ELISA. Plusieurs EDP hydrolysent le GMPc, réduisant sa concentration suite à la stimulation du sGC par le NO²³. Par conséquent, l’activité catalytique des EDP peut obscurcir le lien entre les concentrations de GMPc et l’abondance du NO. L’ajout d’un inhibiteur de la PDE5, tel que le sildénafil, pour prévenir la perte de GMPc est conseillé pour les expériences principalement axées sur l’obtention de concentrations exactes de GMPc, par opposition à l’obtention de mesures pour observer les tendances des concentrations de GMPc. Les inhibiteurs de la PDE5 peuvent être administrés sous forme de sildénafil aux animaux environ 1 h avant le prélèvement de l’échantillon (les effets durent jusqu’à 4 h²⁴) ou, si une telle administration n’est pas faisable, le sildénafil peut être ajouté aux échantillons collectés. Lors de l’inhibition des EDP après le prélèvement de tissus, ajoutez du sildénafil à l’acide chlorhydrique 0,1 N afin que les tissus soient homogénéisés en présence de sildénafil. Des mesures avec et sans sildénafil doivent être prises pour s’assurer qu’il n’y a pas de diaphonie entre le traitement des animaux et le sildénafil.

Même avec ses limites, le test est utilisé comme un aperçu informatif de la transmission en aval du signal NO. En conclusion, le couplage de la mesure des concentrations de GMPc dans les tissus solides avec d’autres méthodes de mesure du NO permet de mieux comprendre les effets du NO dans les organes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 mL de seringue orale transparente BD	Becton Dickinson	50382903052177
Tube à essai à fond rond de 14 ml	Faucon	352059
Microtubes de 2,0 ml, assortis	Olympus Plastics	24 à 283A
30-300 et micro ; Pipette multicanaux L  ;	Eppendorf	3125000052
Anhydride acétique (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	400031	98 % pur dangereux : inflammable, corrosif : brûle gravement la peau, lésions oculaires, toxicité aiguë Manipulation sûre : tenir à l’écart des sources d’inflammation, travailler dans un endroit ventilé, porter des gants
Traceur d’acétylcholinestérase cGMP (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	481020	phosphate de potassium dibasique, chlorure de sodium,  ; phosphate de potassium monobasique, albumine bovine, azoture de sodium, EDTA, cGMP Traceur AChE Danger : Danger pour la santé : toxicité pour les organes en cas d’exposition répétée, Corrosif : lésions oculaires, Irritant cutané et respiratoire Manipulation sûre : Travail dans une zone ventilée, porter des gants ;
antisérum ELISA cGMP (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	481022	phosphate de potassium dibasique, chlorure de sodium,  ; phosphate de potassium monobasique, albumine bovine,  ; azoture de sodium, EDTA, anti-GMPc de lapin polyclonal Antisérum Danger : Danger pour la santé : toxicité pour les organes due à une exposition répétée, Corrosif : lésions oculaires, Irritant cutané et respiratoire, Toxicité aiguë Manipulation sûre : Travailler dans un endroit ventilé, porter des gants
Norme ELISA cGMP (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	481024	phosphate de potassium dibasique, chlorure de sodium,  ; phosphate de potassium monobasique, albumine bovine,  ; azoture de sodium, EDTA, norme cGMP Hazard : Danger pour la santé : toxicité pour les organes due à une exposition répétée, Corrosif : lésions oculaires, Irritant cutané et respiratoire Safe Handling : Travailler dans un endroit ventilé, porter des gants
Kit ELISA cyclique GMP	Cayman Chemical Company	581021
Concentré tampon ELISA 10X (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	400060	1 M phosphate, 1 % BSA, 4 M chlorure de sodium, 10 mM EDTA, 0,1 % azoture de sodium Danger : Danger pour la santé : toxicité pour les organes due à une exposition répétée, Corrosif : lésions oculaires, Irritant cutané et respiratoire Manipulation sûre : Travaillez dans un endroit aéré, stockez-le dans un récipient avec un couvercle refermable, portez des gants
Réservoir de réactif ELISA	Pierce (maintenant Thermo Fisher Scientific)	15075
Réactif d’Ellman (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	400050	phosphate de potassium dibasique, chlorure de sodium, phosphate de potassium monobasique, acétylthiocholine (iodure), 5,5'-dithiobis-(acide 2-nitrobenzoïque) Danger : Toxicité aiguë, Santé Danger : toxicité pour organes, Corrosif : Lésions oculaires, Irritant cutané, irritant répulsif Manipulation sûre : Travailler dans un endroit ventilé, porter des gants
Acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich	320331	Danger : Corrosif : corrode le métal, brûle gravement la peau, lésions oculaires, irritant respiratoire Manipulation sécuritaire : Travailler dans un endroit ventilé, porter des gants
Azote liquide	L’oxygène de Robert		Azote Danger : Gaz comprimé : Risque de brûlures cryogéniques, de soufre, d’étouffement Manipulation sûre : Travailler dans un endroit ventilé, porter des gants
Plaque revêtue d’IgG anti-lapin pour souris (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	400006	Danger : Aucun
Nouveau Classic MF Balance	Mettler Toledo
Agitateur orbital  ;	Stovall Life Science Inc. (maintenant IBI Scientific)	15-453-211 (variable)
Parafilm	Société Bemis, Inc.	3023-4526 (Variable)
Polysorbate 20 (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	400035	Danger : Aucun
Hydroxyde de potassium (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	400029	85 % pur dangereux : Corrosif : corrode les métaux et la peau, Lésions oculaires, toxicité aiguë Manipulation sûre : Travailler dans un endroit ventilé, porter des gants
Homogénéisateur Precellys Evolution	Bertin Technologies	PE000062-PEVO0-A
Kit de lysage Precellys Homogénéisation des tissus durs	Bertin Technologies	P000911-LYSK0-A
Lecteur de microplaques Sense	HIDEX	425-301
Centrifugeuse Sorvall Legend Micro 17R	Thermo Fisher Scientific	75002441
Pulvérisateur de tissus	Concasseur de cellules	Kit de broyeur cellulaire
Vortex Génie 2	Industries scientifiques  ;	SI-0246
Flacon toilette	Sigma-Aldrich	Z423092
Concentré de tampon de lavage 400X (dans le kit cGMP)	Cayman Chemical Company	400062	phosphate de potassium dibasique, phosphate de potassium monobasique, eau Danger : Corrosif : Lésions oculaires, Toxicité aiguë,Irritant cutané, Toxicité pour les organes Manipulation sûre : Travailler dans un endroit ventilé, porter des gants