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Article de méthode

L’hypoxie modifie les niveaux de miARN impliqués dans l’hérédité non mendélienne du trouble du spectre autistique chez la souris

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DOI :

10.3791/68435

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11 juillet 2025

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1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour induire l’hypoxie chez les souris néonatales en les délivrant dans des environnements contrôlés avec des concentrations d’oxygène variables. Des modèles murins soumis à des variations d’oxygène à la naissance ont durablement fait varier l’expression des miARN impliqués dans l’induction de changements phénotypiques comportementaux tels que l’autisme.

Résumé

L’hypoxie peut survenir à des degrés divers pour différentes raisons au cours de la période périnatale, affectant le développement. Notre objectif est d’examiner les conséquences de l’hypoxie néonatale légère à sévère chez la souris, en nous concentrant sur son lien potentiel avec les dysfonctionnements neurodégénératifs du cerveau fœtal liés aux troubles du spectre autistique (TSA).

Nous avons induit l’hypoxie chez des souris néonatales en les délivrant dans des environnements contrôlés avec des concentrations d’oxygène variables. Les résultats ont montré des niveaux élevés de HIF-1α (un marqueur d’hypoxie) dans le cortex cérébral et l’hippocampe, ainsi qu’une augmentation de la neurodégénérescence dans ces régions. De plus, nous avons observé une expression altérée des miARN liés aux TSA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p et miR-499a-5p) dans les groupes hypoxiques, ce qui correspond aux résultats précédents dans des modèles humains et animaux de TSA. Ces altérations moléculaires ont été accompagnées de changements comportementaux tels qu’une diminution des mouvements, de la vitesse, de l’interaction sociale et des comportements répétitifs, ainsi qu’une tendance accrue à présenter un comportement de recherche de coin chez les souris soumises à des conditions hypoxiques. Bien que des changements comportementaux et moléculaires aient été détectables dans le groupe à 12 % d’O2 (hypoxie légère), les changements les plus prononcés ont été observés dans les groupes d’hypoxie plus sévère, à 10 % d’O2 et à 8 % d’O2.

Dans l’ensemble, les résultats suggèrent que l’hypoxie néonatale peut induire des changements moléculaires durables associés aux maladies neurodégénératives avec des conséquences comportementales. De plus, même lors d’un accouchement normal, l’exposition à l’hypoxie au cours du développement précoce peut altérer la mémoire et l’apprentissage. Les résultats soulignent la nécessité d’une détection et d’une intervention précoces chez les nouveau-nés exposés à l’hypoxie afin de prévenir les problèmes neurologiques à long terme. Les niveaux de miARN sont régulés au cours du développement, et leurs modifications dans les tissus, en particulier dans les cellules germinales, constituent un facteur de risque pour la génération suivante. Les analyses fournissent une base pour étudier les voies de régulation qui affectent les changements fonctionnels et comportementaux en cas d’hypoxie.

Introduction

Définie comme un état de manque d’oxygène, l’hypoxie peut provoquer des réponses cellulaires et moléculaires uniques qui sont essentielles à la compréhension de son rôle dans diverses pathologies. Cela peut perturber les séquences de développement, entraînant des altérations et des lésions moléculaires, cellulaires et neuronales. De plus, l’exposition précoce à l’hypoxie interrompt le développement du système nerveux central (SNC), ce qui altère la connectivité axonale et le développement des synapses1.

De plus, bien qu’il ait été démontré que l’hypoxie a des effets néfastes sur le développement du SNC, elle peut également jouer un rôle physiologique essentiel dans des conditions spécifiques, telles que l’embryogenèse. L’hypoxie physiologique normale fait référence à une situation dans laquelle les niveaux d’oxygène sont naturellement bas pendant le développement embryonnaire de manière bénéfique. Ce processus permet aux cellules embryonnaires de produire de l’énergie en favorisant le métabolisme anaérobie, soutient le développement du système circulatoire en accélérant la vascularisation, assure le bon développement du cœur et des os et stimule la migration des cellules de la crête neurale2. À l’inverse, l’hypoxie survenant en dehors de son contexte physiologique peut avoir des effets néfastes sur le développement et la santé globale, y compris le développement embryonnaire, ce qui peut conduire à la prématurité ou même à la létalitéembryonnaire1. Il s’agit donc d’un problème majeur de santé publique, car de nombreux nouveau-nés souffrent d’hypoxie lors d’un accouchement normal, souvent sans être immédiatement reconnus par les soignants ou le personnel médical3. De plus, les altérations de la connectivité neuronale associées à l’hypoxie sont liées à des troubles neurodéveloppementaux, notamment les troubles du spectre autistique (TSA) et les déficiences intellectuelles1.

D’un point de vue moléculaire, l’hypoxie peut influencer le développement neurologique en modifiant l’expression des gènes qui régulent les fonctions synaptiques, perturbant ainsi la connectivité neuronale et contribuant au développement de troubles neurodéveloppementaux4.

Cliniquement, l’hypoxie néonatale affecte le développement du SNC par des voies hormonales et métaboliques1. En réponse à l’hypoxie aiguë, l’hypothalamus libère rapidement l’hormone de libération de la corticotrophine et l’arginine vasopressine, qui déclenche ensuite la libération de l’hormone adrénocorticotrope de l’hypophyse antérieure, suivie de la production de glucocorticoïdes dans le cortex surrénalien fœtal et le degré de cette réponse est corrélé à l’intensité et à la durée de l’hypoxie. Cette réponse rapide de l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) au stress aigu souligne le rôle essentiel des glucocorticoïdes dans la limitation des impacts physiologiques du stress et le maintien de l’homéostasie fœtale en influençant l’expression des gènes associés, la synthèse des protéines et le métabolisme cellulaire 5,6.

La diminution des niveaux normaux d’oxygène active diverses réponses à l’hypoxie, dont la plupart sont régulées par des facteurs de transcription, des facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF) et des capteurs d’oxygène cellulaires tels que les prolylhydroxylases (PHD)1. HIF-1, un régulateur de l’homéostasie de l’O2 comme le montrent les études in vitro 7, est un hétérodimère composé de HIF-1α et HIF-1β8. Dans des conditions hypoxiques, le remplacement de l’atome d’hydrogène par un groupe hydroxyle dans le complexe est réduit, ce qui conduit à l’accumulation de HIF-1α, qui se dimérise ensuite avec HIF-1β. En conséquence, le dimère HIF-1 se déplace vers le noyau, où il active la transcription de centaines de gènes1.

La nature dépendante de l’oxygène des neurones les rend particulièrement sensibles au stress hypoxique. Par conséquent, l’hypoxie peut avoir un impact significatif sur la physiologie du cerveau, avec des implications à long terme sur la fonction neuronale, en altérant la recherche de voies axonales et le développement des synapses9. Ces altérations des connexions neuronales peuvent prédisposer à divers troubles neurodéveloppementaux tels que les TSA et la déficience intellectuelle 9,10.

L’asphyxie périnatale est définie comme une privation d’oxygène pendant le travail et peut survenir à la suite d’événements périnataux tels qu’une hémorragie materno-fœtale, une compression du cordon ombilical, des complications placentaires, une rupture utérine, une dystocie de l’épaule ou l’incapacité du nouveau-né à prendre sa première respiration. Cet événement grave touche environ quatre millions de nouveau-nés dans le monde chaque année et entraîne un million de décès néonatals 11,12,13. Bien que la plupart des nourrissons survivent à des épisodes d’hypoxie, certains patients développent une encéphalopathie hypoxique-ischémique, qui peut entraîner des problèmes neurologiques permanents tels que des troubles convulsifs, une paralysie cérébrale, des retards cognitifs et des déficits moteurs. De plus, l’asphyxie et l’ischémie peuvent entraîner un dysfonctionnement de divers organes et systèmes tels que le SNC (28 %), le système cardiovasculaire (25 %), les reins (50 %) et les poumons (23 %)11.

De plus, l’immaturité du système vasculaire cérébral et une faible autorégulation sont des facteurs prédisposant les nouveau-nés aux risques ischémiques. Dans de tels processus, l’inflammation et le stress oxydatif sont les principaux médiateurs des lésions hypoxiques-ischémiques néonatales et des mécanismes de mort cellulaire associés. Une apoptose anormale peut exposer le cerveau en développement à des risques de troubles moteurs et cognitifs14.

Compte tenu de la complexité des TSA, il est essentiel de comprendre la génétique sous-jacente qui semble avoir une structure polygénique, ainsi que les facteurs environnementaux qui déterminent son développement. En particulier, la base polygénique des TSA implique une étiologie multifactorielle, dans laquelle les prédispositions génétiques interagissent avec des facteurs externes, y compris l’hypoxie. La concordance de 60 % à 92 % observée chez les jumeaux monozygotes souligne l’importance des influences génétiques, tandis que la discordance indique que les facteurs environnementaux jouent également un rôle. La prévalence de l’autisme est estimée à 13/10 000, et ce taux aurait augmenté ces dernières années15. Des études soutiennent l’hypothèse selon laquelle l’exposition à des facteurs environnementaux pendant la grossesse peut augmenter le risque d’autisme, mais les résultats de ces études sont souvent incohérents en raison de différences dans les critères de diagnostic, les groupes de comparaison, la taille de l’échantillon et les méthodes d’évaluation de l’exposition15,16.

Bien que les résultats neuropathologiques distinctifs ne soient pas clairs, des études révèlent des anomalies cérébrales microscopiques et fonctionnelles. Ces anomalies suggèrent que la période étiologiquement pertinente peut être in utero et que la pathogenèse peut commencer pendant la période prénatale15. Les expositions pendant la grossesse sont au centre de la recherche épidémiologique sur les facteurs de risque potentiels de l’autisme. En particulier, l’hypothèse selon laquelle les complications obstétricales peuvent augmenter le risque de TSA est étayée par de nombreuses études, mais l’ampleur et les conséquences de ces effets varient d’une étude à l’autre17.

En plus des facteurs génétiques, les mécanismes épigénétiques jouent un rôle clé dans la régulation de l’expression des gènes dans des conditions hypoxiques. Notamment, les miARN présentent un mécanisme de régulation clé dans la réponse cellulaire à l’hypoxie, comme leur impact sur HIF. Au cours des premiers stades de l’hypoxie, des changements spécifiques dans les niveaux de miARN peuvent contribuer à l’accumulation de HIF-1 et au maintien de niveaux stables de HIF-2 et HIF-318. Bien que le profil d’expression de nombreux miARN soit altéré dans des conditions d’hypoxie et d’ischémie, il a été démontré qu’un nombre limité de miARN associés à l’hypoxie jouent un rôle fonctionnel et affectent l’expression de HIF . Cela explique pourquoi les différents tissus humains diffèrent dans les réponses hypoxiques en raison de l’expression de miARN spécifiques aux tissus18.

De nouvelles données indiquent également que des miARN spécifiques ont été impliqués dans la pathologie des TSA. Dans nos travaux précédents, nous avons démontré que miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p et miR-499a-5p, qui sont connus pour réguler la survie cellulaire, la différenciation et les réponses au stress dans le cancer, présentent une expression aberrante chez les patients atteints de TSA, influençant potentiellement les résultats neurodéveloppementaux. Nous avons ensuite confirmé ces résultats dans des échantillons de sang, d’hypothalamus et de sperme provenant de modèles murins de TSA, montrant une association cohérente des changements de régulation génique avec la maladie19. Ces résultats indiquent que la régulation négative de ces miARN à des stades cruciaux de la croissance et du développement peut avoir un impact significatif sur le développement de maladies telles que les TSA. Cela démontre une fois de plus l’influence profonde de l’hypoxie néonatale sur les caractéristiques moléculaires et comportementales.

Dans cette étude, nous avons testé l’impact de l’hypoxie néonatale légère à modérée sur le risque de développer l’autisme à l’âge adulte. Pour ce faire, des souris nouveau-nées ont été exposées à différents niveaux d’hypoxie. En effet, les souris qui ont souffert d’hypoxie à la naissance présentent des changements de comportement à l’âge adulte et, plus important encore, au niveau moléculaire, des altérations associées aux TSA. Ainsi, nos résultats ont fourni des informations précieuses sur les effets à long terme de l’hypoxie.

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Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité local d’éthique des expériences animales de l’Université d’Erciyes (HAYDEK) et réalisés sous le numéro de licence 21/216.

1. Sujets animaux

REMARQUE : Cette étude a porté sur des souris Balb/c de l’unité transgénique du Centre de génome et de cellules souches Betül-Ziya EREN (GENKÖK) de l’Université Erciyes.

  1. Utilisez des souris Balb/c de 2 mois pesant en moyenne 18 à 25 g. Maintenez les souris à une température de 20 ± 2°C, avec une humidité de 52 ± 3 % dans un cycle lumière/obscurité de 12 h (6-18 h).
  2. Nourrissez les souris avec des granulés de souris standard, avec des changements de litière hebdomadaires, et permettez un accès illimité à la nourriture et à l’eau.
    REMARQUE : Les études moléculaires ont été réalisées dans les laboratoires de génomique et d’hypoxie du GENKÖK et dans le laboratoire d’histologie et d’embryologie de l’Université de Bozok. Un « point d’arrêt » indique où vous pouvez mettre en pause et conserver votre travail à la température spécifiée.

2. Établissement du modèle d’hypoxie

  1. Concevez l’expérience pour inclure 4 groupes, dont 3 hypoxiques et 1 groupe témoin simulé.
  2. Accouplez des souris femelles saines avec des souris mâles saines pour former des souris femelles enceintes saines, qui seront éventuellement classées dans les groupes suivants : hypoxie sévère (8 % O2) (n = 4), hypoxie modérée (10 % O2) (n = 4), hypoxie légère (12 % O2) (n = 4) et normoxie (21 % O2) comme groupe témoin simulé (n = 4).
  3. Pour induire l’hypoxie, transférez les souris enceintes au laboratoire d’hypoxie et commencez à les surveiller 72 h avant le jour E21.5.
  4. Détectez le point d’accouchement des souris enceintes dans les groupes hypoxiques et placez-les immédiatement dans des chambres d’hypoxie. Ajustez les niveaux d’oxygène pour chaque chambre comme décrit pour chaque groupe (illustré à l’étape 2.2.).
  5. Maintenez les nouveau-nés dans des conditions hypoxiques pendant 5 minutes seulement, puis transférez-les immédiatement dans des conditions normales de logement.
    REMARQUE : Garder les sujets dans des conditions hypoxiques pendant de longues périodes peut entraîner une létalité.
  6. Utilisez 2 nouveau-nés (choisis au hasard) de chaque groupe pour confirmer les dommages induits par l’hypoxie et déterminer le sexe. Gardez les petits restants à côté de leur mère dans des conditions de logement normales jusqu’à la fin de la période de lactation pour des tests moléculaires et comportementaux supplémentaires pour la phase adulte (voir le plan expérimental dans la figure supplémentaire 1).

3. Détermination du sexe pour évaluer les différences potentielles dans les effets hypoxiques entre les sexes au stade néonatal

  1. Pesez chaque souris (sélectionnée au hasard (x2/groupe)) individuellement pour calculer la dose requise d’anesthésiques. Administrer de la kétamine à 100 mg/kg et de la xylazine à 10 mg/kg par voie intrapéritonéale.
  2. Une fois la souris complètement anesthésiée, procéder à l’euthanasie par luxation cervicale et prélever immédiatement les tissus de la queue dans des tubes stériles de 1,5 mL marqués (un point d’arrêt, -80 °C)
  3. Prélever et transférer immédiatement tous les tissus cérébraux dans des tubes à centrifuger contenant 10 % de formaldéhyde pour une analyse plus approfondie (point d’arrêt, 25 °C).
  4. Préparer les tissus pour l’extraction de l’ADN.
    1. Préparez les échantillons de queue et décongelez-les à 25 °C (si nécessaire). Ajouter aux échantillons 300 μL de tampon de lyse contenant 1 M Tris, 0,5 M EDTA, 4 % SDS, dH2O et protéinase K.
  5. Homogénéiser les échantillons.
    1. Mélangez soigneusement les échantillons par vortex et incubez toute la nuit à 55 °C.
    2. Le lendemain, ajoutez 100 μL d’acétate d’ammonium et mélangez brièvement par vortex. Centrifugeuse à 12 000 g pendant 20 min à 25 °C
  6. Effectuez la séparation de phase.
    1. Transférez soigneusement la phase aqueuse claire dans de nouveaux tubes stériles étiquetés de 1,5 ml.
    2. Ajouter 500 μL d’isopropanol et incuber pendant 5 min à 25 °C (un point d’arrêt, -20 °C). Centrifugeuse à 12 000 g pendant 10 min à 25 °C
  7. Lavez la pastille d’ADN.
    1. Après avoir inspecté la pastille au fond du tube, jetez soigneusement le surnageant.
    2. Ajoutez 1000 μL d’éthanol à 70 % et tapotez doucement le tube pour faire flotter la pastille. Centrifugeuse à 7500 g pendant 10 min à 25 °C
  8. Purifier l’ADN.
    1. Après avoir inspecté la pastille au fond du tube, jetez soigneusement le surnageant.
    2. À l’aide d’une micropipette de 10 μL, retirez l’éthanol résiduel et laissez-le sécher complètement.
    3. Ajouter 100 μL d’eau sans nucléases (NFW) pour remettre la pastille en suspension. Incuber à +4 °C pendant 10-15 min.
  9. Quantifier et stocker l’ADN.
    1. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Conservez les échantillons d’ADN à +4 °C jusqu’à nouvel ordre. (un point d’arrêt).
  10. Effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR).
    1. Concevez des amorces SRY-F, SRY-R et indirectes PAX6-F, PAX6-R (voir le tableau supplémentaire 1).
    2. Préparez un mélange de PCR comme suit (par échantillon) : 5 μL de tampon PCR (10x), 4 μL de MgCl2, 4 μL de dNTP, 0,5 μL de chacune des quatre amorces, 31 μL de dH2O et 0,5 μL de Taq polymérase.
      REMARQUE : La taq polymérase doit être ajoutée en dernier et juste avant l’utilisation pour assurer une amplification optimale.
    3. Préparez les tubes PCR étiquetés et placez-les sur une grille de refroidissement à +4 °C. Répartissez 45 μL du mélange dans les tubes.
    4. Tapotez doucement le bloc pour vous assurer que les gouttelettes de mélange PCR se trouvent au fond du tube.
    5. Ajouter 5 μL d’échantillons d’ADN et pipeter brièvement. Vortex brièvement, puis centrifugez les tubes.
    6. Placez les tubes dans l’appareil de PCR et réglez le programme sur les conditions suivantes : Initialement, incubation à 95 °C pendant 5 min, 40 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 1 min, recuit à 57 °C pendant 45 s et extension à 72 °C pendant 1 min. Après les cycles, une dernière extension à 72 °C pendant 10 min, suivie d’une suspension à 40 °C indéfiniment.
  11. Visualisez les échantillons obtenus à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 2 %.
    REMARQUE : Les échantillons montrant que deux bandes sont des mâles, et que celles qui n’ont qu’une seule bande sont des femelles.

4. Confirmation des dommages causés par l’hypoxie chez les souris néonatales

  1. Évaluer au microscope les tissus cérébraux prélevés sur des souris sacrifiées pour confirmer les dommages hypoxiques et examiner immunohistochimiquement pour tester HIF-1α.
    1. Fix et la paraffine intègrent le tissu.
      1. Conservez les mouchoirs dans du formaldéhyde pendant 12 h, puis lavez-les à l’eau pendant 6 h.
      2. Fixer les tissus en déshydratant en série d’alcool éthylique pendant 1 jour pour chaque concentration : 70 %, 80 %, 90 %, puis 3 h dans de l’alcool éthylique à 100 %. Placez les mouchoirs dans du xylène pendant 15 minutes pour éliminer.
      3. Transférez les tissus dans les séries de paraffine I, II et III pendant 1 heure chacun. Après la troisième heure, orientez correctement les échantillons de cerveau et intégrez-les dans de la paraffine propre.
      4. À l’aide d’un microtome rotatif, découpez des sections de 5 m d’épaisseur dans les blocs de paraffine.
    2. Préparez des diapositives.
      1. Pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE), placez des sections sur des lames de verre ordinaires.
      2. Pour l’immunohistochimie, placez des sections sur des lames de verre chargées positivement.
        REMARQUE : (un point d’arrêt), les diapositives peuvent être archivées à ce stade pour une évaluation et un travail plus approfondis.
    3. Effectuer la coloration HE.
      1. Immerger les échantillons dans la solution de xylène I pendant 10 min.
      2. Immergez les échantillons dans la solution de Xylene II pendant 10 minutes supplémentaires.
      3. Transférez les échantillons à une série de concentrations d’alcool décroissantes, chacune pendant 1 min : 100 %, 96 % et 80 %.
      4. Lavez les échantillons à l’eau distillée pendant 2 min.
      5. Immergez les échantillons dans de l’hématoxyline pendant 8 min, puis lavez-les dans de l’eau distillée pendant 2 min.
      6. Après le lavage, traitez les échantillons avec de l’alcool acide pendant 1 s, suivi d’un lavage de 1 min.
      7. Placez les échantillons dans de l’eau ammoniacale pendant 10 secondes, puis répétez le lavage de 1 minute.
      8. Placez les échantillons dans de l’alcool à 70 % pendant 30 s.
      9. Immergez les échantillons dans l’éosine pendant 10 min.
      10. Transférez progressivement les échantillons en augmentant les concentrations d’alcool pendant 1 minute chacune : 96 %, 96 % et 100 %.
      11. Immergez les échantillons dans les solutions de xylène I, de xylène II et de xylène III pendant 1 minute chacun.
      12. Couvrir avec une lamelle.
    4. Examinez à l’aide d’un microscope.
      1. Après la coloration HE, examinez l’ensemble des tissus cérébraux de chaque groupe au microscope optique.
      2. Évaluer les zones hippocampiques et corticales pour la dégénérescence neuronale et l’œdème péricellulaire/périvasculaire.
  2. Effectuer la coloration HIF-1α.
    1. Incuber les échantillons sur des lames chargées positivement pendant la nuit à 67 °C dans un incubateur pour assurer une fixation adéquate.
    2. Passez des sections dans des solutions de xylène I et de xylène II pour une déparaffinisation complète.
    3. Réhydratez les sections en les plaçant séquentiellement dans des solutions d’éthanol à 100 %, 96 %, 80 % et 70 % pendant 5 minutes chacune, puis rincez-les à l’eau distillée pendant 5 minutes.
    4. Démasquer les épitopes en les faisant passer au micro-ondes dans de l’acide citrique 0,01 M (pH 6,0) à 665 W pendant deux cycles de 5 minutes.
    5. Refroidir les sections à température ambiante (RT) pendant 20 min.
    6. Délimitez le périmètre des sections à l’aide d’un stylo hydrophobe, puis lavez les sections 3 fois dans du PBS pendant 5 min chacune.
    7. Incuber des sections dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % dans du méthanol pendant 10 min pour bloquer l’activité endogène de la peroxydase.
    8. Lavez à nouveau les sections 3 fois dans PBS pendant 5 minutes à chaque fois.
    9. Pour éviter la liaison d’immunoglobulines non spécifiques, incubez des sections avec un réactif bloquant les UV pendant 7 min.
    10. Incuber des sections pendant la nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire anti-HIF-1α (dilution 1:200).
    11. Lavez les sections 3 fois dans du PBS pendant 5 minutes à chaque fois.
    12. Appliquez l’anticorps secondaire biotinylé sur les sections et incubez à la RT pendant 40 min.
    13. Lavez à nouveau les sections 3 fois dans PBS pendant 5 minutes à chaque fois.
    14. Appliquez une solution de streptavidine sur les sections et incubez pendant 30 minutes à RT.
    15. Lavez les sections 3 fois dans du PBS pendant 5 minutes à chaque fois.
    16. Développer la réaction de coloration en appliquant de la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) et en observant au microscope optique.
    17. Contre-colorez les sections avec une solution d’hématoxyline Gill II modifiée pour colorer les noyaux.
    18. Déshydratez les sections en les faisant passer à travers des concentrations croissantes d’éthanol (70 %, 80 %, 96 % et 100 % d’éthanol).
    19. Nettoyez les sections en les incubant dans des solutions de xylène I et de xylène II pendant 10 minutes chacune.
    20. Montez les sections à l’aide d’un support de montage et d’une lamelle.
    21. Examinez les sections montées au microscope optique et évaluez les zones de l’hippocampe et du cortex préfrontal.
    22. Mesurez les niveaux d’immunoréactivité à l’aide d’un logiciel de traitement d’images open source.

5. Expériences comportementales

  1. Après confirmation de l’hypoxie, laissez les souris restantes terminer la période de lactation avec leur mère.
  2. Effectuez la détermination du sexe le 21e jour postnatal en fonction de la distance anogénitale, puis hébergez les animaux dans différentes cages en fonction de leur sexe. Lorsque les souris des groupes témoins hypoxiques et simulés atteignent l’âge de 2 mois, soumettez-les à des expériences comportementales.
  3. Avant d’effectuer des tests comportementaux, acclimatez les sujets à l’environnement de test pendant 15 à 30 minutes avant le test.
  4. Assurez-vous de désinfecter tous les dispositifs entre les sujets et les essais en utilisant de l’éthanol à 70 %.
  5. Effectuez un test de reconnaissance d’objets nouveaux (NOR).
    1. Placez l’appareil photo dans une position où les sujets peuvent être clairement vus et surveillés.
    2. Installez un logiciel de suivi vidéo approprié.
    3. Préparez l’arène de test (une boîte de 60 cm × 60 × cm × 40 cm) avec deux objets pas plus grands que la souris. Assurez-vous que les deux objets sont de taille et de forme similaires et facilement accessibles (à 10 cm × 10 cm des murs et parallèles).
    4. Jour 1 : Phase de familiarisation :
      1. Placez la souris dans l’arène avec les deux objets identiques. Laissez la souris explorer librement les objets pendant une durée déterminée (par exemple, 10 min).
      2. Au cours de cette session, observez et notez le temps que la souris a passé avec chaque objet. Notez également le nombre de fois où la souris s’est tournée vers chaque objet ou a interagi avec celui-ci
    5. Jour 2 : Présentation du roman :
      1. Remplacez l’un des objets familiers du jour 1 par un nouvel objet (différent en apparence, en texture ou en forme).
      2. Remettez la souris dans l’arène, ce qui lui permet d’explorer à nouveau librement pendant la même durée que lors de la première session.
    6. Notez le temps total que la souris a passé avec l’objet familier (à partir du jour 1) et l’objet nouveau. Enregistrez le nombre de fois où la souris s’est tournée vers chaque objet ou a interagi avec celui-ci.
    7. Calculez l’indice de discrimination (ID) pour évaluer la mémoire et l’apprentissage de la souris à l’aide de la formule :
      Indice de discrimination (ID) = {(Temps passé avec un objet nouveau − Temps passé avec un objet familier)/(Temps total passé avec les deux objets)} × 100.
      REMARQUE : Un DI plus élevé indique un plus grand intérêt pour le nouvel objet, suggérant une meilleure mémoire et de meilleures capacités d’apprentissage. Un ID proche de 0 n’indique aucune préférence, suggérant soit un intérêt égal, soit une mauvaise mémoire pour l’objet familier.
    8. Utilisez le DI pour évaluer objectivement les capacités d’apprentissage et de mémoire de la souris, en fonction de sa curiosité naturelle et de sa capacité à reconnaître et à différencier les objets familiers des objets nouveaux.
  6. Effectuer un test de suspension de queue (TST)
    1. Installez la caméra dans une position où les souris sont clairement visibles et peuvent être surveillées. Installez un logiciel de suivi vidéo approprié.
    2. Préparez le dispositif expérimental avec de l’espace pour accueillir 3 souris simultanément.
    3. Utilisez des panneaux en carton de 25 cm de haut avec des intervalles de 20 cm pour isoler les souris afin qu’elles ne puissent pas se voir pendant le test.
    4. Coupez des bandes de ruban adhésif de 12 cm de long et fixez-les soigneusement à la queue de chaque souris, en vous assurant que la queue est solidement attachée sans causer de dommages. Positionnez le ruban adhésif à l’extrémité de la queue (2 cm) de manière à ce que la souris puisse être suspendue sans se blesser.
    5. Enregistrez les souris pendant 6 minutes pendant qu’elles sont suspendues.
    6. À la fin de la durée, arrêtez l’enregistrement, retirez la souris et remettez-la dans la cage d’hébergement. Analysez les vidéos pour déterminer la durée du mouvement actif et la durée de l’immobilité.
      REMARQUE : Cela donnera un aperçu de la réponse au stress, car l’immobilité indique souvent un état d’impuissance ou de stress appris. Le degré d’immobilité est couramment utilisé pour mesurer le désespoir comportemental ou la réponse au stress chez la souris, qui peut être lié aux effets du stress ou des états dépressifs.
    7. Sur la base des modèles de mouvement et d’immobilité observés, évaluez l’état émotionnel et les mécanismes d’adaptation au stress des souris en réponse à la suspension forcée.
  7. Effectuer un test d’enfouissement du marbre
    1. Remplissez une cage vide (20 cm × 35 cm × 15 cm) avec une hauteur d’épis de maïs de 5 cm. Disposez 20 billes en 5 rangées de 4 billes chacune. Assurez-vous que les billes sont uniformément réparties sur la surface.
    2. Placez le sujet dans un coin de la cage, en assurant un accès libre à l’ensemble de la cage.
    3. Donnez à la souris 20 minutes pour explorer la cage. Pendant ce temps, la souris peut présenter un certain comportement d’enfouissement, en essayant de couvrir les billes avec des épis de maïs. Après 20 min, retirez la souris de la cage.
    4. Comptez le nombre total de billes que la souris a enfouies sous l’épi de maïs pendant la période de 20 minutes. Notez le nombre total de billes enterrées, car il s’agit de la mesure clé du comportement.
      REMARQUE : Le nombre de billes enterrées est couramment utilisé comme indicateur d’anxiété, de comportement compulsif ou de néophobie chez les rongeurs. Un nombre plus élevé de billes enterrées est souvent associé à des niveaux plus élevés d’anxiété ou de tendances compulsives.
    5. Sur la base du nombre total de billes enterrées, évaluez les comportements liés à l’anxiété et les tendances compulsives chez la souris, ce qui peut être utilisé pour évaluer les effets des traitements ou des conditions expérimentales.
  8. Effectuez un test d’interaction sociale.
    1. Installez la caméra dans une position où les souris sont clairement visibles et peuvent être surveillées.
    2. Connectez la caméra à l’ordinateur et configurez le logiciel de suivi vidéo approprié. Installez une boîte rectangulaire (60 cm × 40 cm × 25 cm) avec deux parois (40 cm × 25 cm) avec deux portes (8 cm) pour séparer les trois chambres.
    3. Placez une cage (15 cm × 10 cm) contenant une souris familière au sujet de l’expérience et une autre cage (15 cm × 10 cm) contenant une souris qui n’a jamais eu d’interaction avec le sujet de l’expérience.
    4. Démarrez l’enregistrement et placez le sujet dans le compartiment central.
      REMARQUE : Les souris utilisées dans cet essai, autres que les animaux de laboratoire, doivent être du même sexe et en bonne santé.
    5. Surveillez le sujet pendant 5 minutes et enregistrez-le avec la caméra vidéo. À la fin de la durée, arrêtez l’enregistrement, retirez la souris et remettez-la dans la cage d’hébergement.
    6. À l’aide d’un logiciel SIT, analysez le temps d’interaction sociale et les tendances de nouveauté sociale des souris et comparez-les avec le groupe témoin fictif.
      REMARQUE : Plus de temps consacré aux comportements sociaux (par exemple, toiletter ou renifler) et moins de temps passé à éviter ou à afficher de l’agressivité peuvent être interprétés comme démontrant une grande sociabilité. Éviter l’interaction, passer plus de temps en isolement ou faire preuve d’une agressivité accrue peut suggérer de l’anxiété, un retrait social ou une capacité réduite à interagir socialement.
  9. Effectuez un test sur le terrain.
    1. Positionnez la caméra de manière à ce que les souris soient clairement visibles et surveillées. Connectez la caméra à l’ordinateur et configurez un logiciel de suivi vidéo approprié.
    2. Installez l’arène de test (une boîte de 60 cm × 60 cm × 40 cm) et divisez la boîte avec des lignes imaginaires pour créer 16 carrés.
    3. Commencez l’enregistrement et placez soigneusement la souris au centre de l’arène. Observez et enregistrez le comportement de la souris pendant 5 min.
    4. À la fin de la durée, arrêtez l’enregistrement, retirez la souris et remettez-la dans la cage d’hébergement.
    5. À l’aide du logiciel de suivi, mesurez les comportements externes et internes de la marche, de l’escalade, de la fuite, du toilettage, de l’immobilité, des croisements totaux, de la défécation et de la miction pour évaluer les niveaux d’anxiété, d’activité locomotrice, d’exploration et d’activité émotionnelle des sujets.
  10. Effectuez le test du labyrinthe aquatique Morris (MWM).
    1. Préparez le labyrinthe d’eau de 120 cm de diamètre et 60 cm de profondeur dans une position stable dans un laboratoire comportemental à 23 ± 1 °C.
    2. Divisez le labyrinthe en quatre quadrants imaginaires et accrochez différents repères visuels (en forme et en couleur) au centre de chaque quadrant des murs du labyrinthe, à environ 20 cm de la base. Positionnez une plate-forme de 17 cm de long et 10 cm de diamètre à 20 cm du mur.
      REMARQUE : Le labyrinthe, les repères et la plate-forme ne doivent pas changer de position ou d’emplacement afin que les souris puissent entraîner avec précision leur mémoire.
    3. Remplissez le labyrinthe avec de l’eau à 21-26 °C jusqu’à 1 cm sous la plate-forme et teintez-le avec un colorant acrylique multi-surfaces noir.
      REMARQUE : Dans le cas de l’utilisation d’autres souches de souris, l’eau doit être colorée avec une couleur de contraste des souris pour pouvoir les surveiller.
    4. Placez la caméra dans une position qui capture l’image complète et connectez-la au logiciel MWM sur l’ordinateur.
      REMARQUE : La place sur la plate-forme doit être attribuée dans le programme pour le cinquième jour d’essai.
    5. Le test dure 5 jours avec quatre essais chacun. Pendant les quatre premiers jours, commencez l’enregistrement et commencez l’essai en plaçant soigneusement le sujet dans un quadrant différent chaque jour, le visage dirigé vers la paroi du réservoir.
    6. Attribuez l’emplacement de la plate-forme dans le programme de test du jour 5.
      REMARQUE : Cela empêche les sujets de former une mémoire associative. Il est essentiel de placer soigneusement les sujets dans l’eau et de maintenir la bonne température pour éviter d’ajouter un stress externe. Les essais durent 5 minutes et se terminent automatiquement lorsque (i) la plateforme est atteinte, (ii) la limite de temps de 5 minutes expire. Au fil des jours, les sujets doivent apprendre l’emplacement de la plate-forme et la trouver en moins de temps.
    7. Le cinquième jour, retirez la plate-forme et placez soigneusement les souris dans un carré du labyrinthe comme décrit précédemment.
      REMARQUE : La version d’essai se termine automatiquement lorsque (i) la souris trouve et monte sur la plate-forme, (ii) la limite de temps de 5 minutes expire. Les sujets sains devraient trouver l’emplacement de la plateforme précédente. Le logiciel calculera automatiquement le temps nécessaire à la souris pour trouver la plate-forme dans chaque essai et aidera à évaluer la mémoire à court et à long terme et les capacités d’apprentissage des sujets.

6. Confirmation des dommages causés par l’hypoxie chez les souris adultes

  1. Une fois le test comportemental terminé, sacrifiez les sujets par luxation cervicale.
  2. Prélevez des échantillons de tissu et de sang de l’hippocampe de 6 souris de chaque groupe, y compris le groupe témoin fictif, pour une analyse moléculaire (section 7).
  3. Placez le cerveau des 4 souris restantes dans une solution de formaldéhyde à 10 % pour examiner les effets de l’exposition à l’hypoxie pendant la période néonatale sur la morphologie du cerveau adulte.
  4. Utilisez la même technique que celle expliquée précédemment dans la section 4 pour effectuer une analyse histologique du cerveau de souris adultes.

7. Isolement de l’ARN total à partir d’échantillons en phase adulte

  1. Ajouter 500 μL de trizol à chaque échantillon de tissu et 500 μL de sang.
  2. Pour le tissu cérébral, homogénéiser les échantillons à l’aide d’une seringue.
  3. Incuber le mélange à RT pendant 5 min.
  4. Ajouter 200 μL de chloroforme dans chaque tube et incuber pendant 5 minutes supplémentaires à RT.
  5. Centrifugeuse à 12 000 g pendant 20 min à +4 °C.
  6. Transférez soigneusement la phase aqueuse (ARN) dans un nouveau tube stérile.
  7. Ajouter l’isopropanol (rapport 1:1 à la phase aqueuse) et incuber le mélange pendant la nuit. (un point d’arrêt / -20 °C).
  8. Le lendemain, centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à +4 °C.
  9. Jetez soigneusement le surnageant et ajoutez 1000 μL d’éthanol à 75 % à la pastille.
  10. Centrifugeuse à 7 500 × g pendant 5 min à +4 °C.
  11. Répétez deux fois l’étape de lavage à l’éthanol.
    REMARQUE : si le granulé est trop petit, un lavage suffit.
  12. Jetez le surnageant et laissez la pastille sécher à l’air libre à RT.
  13. Une fois complètement sec, remettre la pastille en suspension avec 50 μL de NFW et incuber sur de la glace à +4 °C pendant 10-15 min.
  14. Mesurez la concentration d’ARN par spectrophotométrie.
  15. Conservez les échantillons d’ARN à -80 °C jusqu’à ce que l’analyse soit plus approfondie.

8. Synthèse de l’ADN complémentaire (ADNc)

  1. En travaillant sur un support de refroidissement à +4 °C, préparez les échantillons d’ARN isolés dans le sang et les tissus cérébraux.
  2. Préparez les tubes PCR étiquetés.
  3. Mélangez les réactifs du kit de synthèse d’ADNc selon les instructions du fabricant.
  4. Préparez un total de 14 μL du mélange réactionnel pour chaque échantillon et répartissez-le dans les tubes.
  5. Ajoutez 6 μL d’échantillon d’ARN au mélange.
  6. Effectuez la synthèse de l’ADNc dans l’appareil PCR en suivant les conditions de température et de temps spécifiées par le fabricant.
    REMARQUE : L’ADNc synthétisé à ce stade peut être stocké à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
  7. Diluez l’ADNc synthétisé dans un rapport de 1:5.
  8. Conservez l’ADNc dilué à -80 °C pour une analyse qPCR future.

9. PCR quantitative en temps réel pour l’expression des miARN (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p et U6 comme contrôle de normalisation)

  1. Concevez les amorces pour chaque miARN (voir le tableau supplémentaire 2 pour les séquences).
  2. Préparez le mélange réactionnel PCR selon les instructions du fabricant.
  3. Distribuer 14 μL du mélange réactionnel dans chaque puits d’une plaque de PCR à 96 puits.
  4. Ajouter 6 μL d’ADNc dilué à 1:5 dans chaque puits pour un volume de réaction total de 20 μL.
  5. Effectuer une PCR en double exemplaire pour chaque échantillon afin de minimiser les variations en suivant ce programme : Dénaturation initiale à 95 °C pendant 120 s, 45 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, recuit et amplification à 56 °C pendant 60 s, et analyse de la courbe de fusion à 60 °C pendant 15 s, puis à 95 °C.
  6. Analysez les résultats à l’aide des valeurs Ct (seuil de cycle) et normalisez les données à l’aide de la méthode 2-ΔΔCt .

10. Analyse statistique

  1. . Évaluez la normalité des données à l’aide d’histogrammes, de tracés Q-Q et du test de Shapiro-Wilk pour analyser les données d’expression des miARN.
    1. Si les données sont distribuées normalement, utilisez l’ANOVA à un facteur.
    2. Si les données ne sont pas distribuées normalement, appliquez le test de Kruskal-Walli, le test t de Student ou le test U de Mann-Whitney.
  2. Pour évaluer les différences entre les sexes au sein de chaque groupe, utilisez le test t de l’élève ou le test U de Mann-Whitney, selon la distribution des données. La signification statistique est déterminée par une valeur p de <0,05.
    REMARQUE : Toutes les analyses doivent être effectuées à l’aide d’un logiciel statistique approprié. Ici, le GraphPad Prism 8 est utilisé.
  3. Évaluez la normalité des données à l’aide d’histogrammes, de tracés Q-Q et du test de Shapiro-Wilk pour analyser les résultats des expériences comportementales.
    1. Si les données sont distribuées normalement, utilisez une ANOVA à deux facteurs.
    2. Pour les données qui ne sont pas distribuées normalement, effectuez le test de Kruskal-Walli, le test t de Student ou le test U de Mann-Whitney.
    3. Évaluez les différences entre les sexes au sein de chaque groupe à l’aide du test t de l’élève ou du test U de Mann-Whitney, en fonction de la distribution des données. Encore une fois, considérez les résultats comme statistiquement significatifs si la valeur p est < 0,05.
  4. Pour les analyses immunohistochimiques, utilisez l’ANOVA à deux facteurs suivie du test post-hoc de Tukey pour comparer les groupes féminins et masculins.
  5. Pour comparer les groupes féminins et masculins dans chaque condition d’hypoxie, utilisez le test post-hoc de Sidak. La signification statistique est déterminée si la valeur p est < 0,05.

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Résultats

Dans cette étude, des souris Balb/c gravides ont été exposées à des conditions hypoxiques de 8 % O2 (sévère), 10 % O2 (modéré) et 12 % O2 (léger) pendant l’accouchement, et les souris nouveau-nées ont été maintenues dans ces conditions hypoxiques pendant 5 minutes pour établir des modèles d’hypoxie néonatale légère, modérée et sévère. Le groupe désigné comme le groupe témoin fictif a été soumis à des conditions de naissance normoxiques (21 % O

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Discussion

L’hypoxie périnatale, un problème majeur de santé néonatale, peut provoquer des changements moléculaires, cellulaires et neuronaux en perturbant les processus de développement critiques et a été associée à divers troubles neurodéveloppementaux, y compris les troubles du spectre autistique (TSA)1. Bien que l’hypoxie sévère ait été largement étudiée pour ses effets immédiats, les conséquences à long terme de l’hypoxie légère à modérée pendant la période périnatale r...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été financée par le Conseil de la recherche scientifique et technologique de Turquie (TÜBİTAK), et les auteurs remercient Celalettin Göktaş (animalerie transgénique) et la biologiste Selda Taşdemir (laboratoire comportemental).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(-20 & deg ; C) CongélateurSiemens  ;KD86NAWE0N
(+4 & deg ; C) BlocAntagen Biosciencehttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 & deg ; C) RéfrigérateurSiemens  ;KD86NAWE0N
(-20 & deg ; C) BlocCleaver Sientifichttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
Éthanol absoluMerck1070172511
Acétate d’ammoniumSigma238074-500G
Balance analytique  ; Adam ÉquipementLAB214i
ChloroformeMerck1024451000
acide citrique & nbsp ;Merck100241
OrdinateurHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTASigmaE9884-1KG
Entellan  ;Merck107961
ÉosineMerck109844
Ependorf (1,5 mL)?solab078.03.021
Système EthovisionNoldushttps://noldus.com/ethovision-xt
EtuvNUVEEN 400/500 N/A
Tubes Falcon (15 mL)Isolab078.02.001
FormaldéhydeMerck104002
Caméra thermiqueSamsungSC2000
HématoxylineMerck105175
HIF-1 & alpha ; AnticorpsBiossbs-20398R  ;
Hypoxie Chambers & nbsp ;BiospherixChambre A
IsopropositionnelMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Cage du test d’enterrement en marbreVishnu & nbsp ;https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
Tubes microcentrifuges (1,5 mL)Greiner616201
Pointes de micropipette (100 & micro ; L)Greiner774353
Pointes de micropipette (1000 & micro ; L)Greiner778353
Micropipettes (10 & micro ; L)GilsonFD10001
Micropipettes (100 & micro ; L)GilsonFD10004
Micropipettes (1000 & micro ; L)GilsonFD10003
Embouts de micropipettes (10 & micro ; L)Greiner772353
Micropipettes (2 & micro ; L)GilsonGFAM00064
MicroscopieOlympeBx53
Kit RT LMA miRCURY (Kit de synthèse ADNc)Qiagen339340
MiRCURY LNA SYBR Kit PCR vertQiagen339346
Plaques multipuitsRoche4729692001
Nano spectrophotomètreShimadzuC101-E112
L’arène du test de reconnaissance d’objets romansBiotechnologie mondiale137
L’arène du Test en champ ouvertBiotechnologie mondiale117
Oxycycler  ;BiospherixA42OC
Paraffine  ;Leica  ;39602012
Tablette PBSSigmaP4417-50TAB
Dispositif PCRSensoquestT3-0140
Tournage de plaquePeqlab91-PSPIN-P
PrismeGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Protéinase KSigmaP6556-10MG
Réactif d’isolation du réactif de lyse QIAzolQiagen79306
SDSSigma8170342500
Anticorps de second choix & nbsp ;AbcamA0545-1ML
Les trois chambres du Test d’Interaction SocialeBiotechnologie mondiale118
SpinGilsonPMC880
Seringue (2 mL)Baybihttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
Configuration du test de suspension arrièreSelf Made, vous pouvez trouver des solutions similaires sur Harvard ApparatusSelf Made, vous pouvez trouver des cartes similaires sur (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)
ThermomixeurEppendorf#5355
Base de TrizmaSigma1503-1KG
VortexHeidolph541-10000-00-1
Xylènes  ;Isolab  ;9,90,01,92,501

Références

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