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Article de méthode

Prise en charge post-transplantation hépatique et collecte d’échantillons chez des spermophiles dauriens pour le séquençage de l’ARN unicellulaire

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DOI :

10.3791/68443

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16 septembre 2025

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1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les procédures de stockage frigorifique prolongé du foie et de transplantation orthotopique chez l’écureuil terrestre de Daurian (DGS ; Spermophilus dauricus), un hibernant saisonnier typique. Il comprend des méthodes de prélèvement de greffes de foie et d’échantillons de sang pour des évaluations pronostiques et leur traitement pour des études sur cellule unique.

Résumé

La récupération fonctionnelle du greffon et l’immunocompatibilité greffon-hôte représentent des problèmes pronostiques majeurs après une transplantation hépatique. De manière critique, les modèles conventionnels de rongeurs utilisant des rats ou des souris offrent un aperçu limité des mécanismes des lésions de greffe induites par l’hypothermie pendant la conservation. Cette lacune souligne la nécessité de disposer de modèles alternatifs. Depuis que les greffes de foie de l’écureuil terrestre de Daurian adaptatif au froid (DGS ; Spermophilus dauricus) peut maintenir une conservation prolongée au froid et donc favoriser une grande capacité de survie dans les DGS post-transplantation, par conséquent, ce protocole détaille les soins essentiels aux animaux post-chirurgicaux et la surveillance physiologique requise pour les sujets DGS transplantés. De plus, il fournit des procédures standardisées pour la préparation d’échantillons de greffe hépatique de haute qualité pour les techniques analytiques en aval, y compris le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) pour le profilage transcriptomique et l’examen histopathologique. Générer avec succès des échantillons de greffe DGS bien préparés est la première étape cruciale dans l’application de méthodologies traditionnelles et de pointe pour étudier ce modèle non conventionnel mais très pertinent. Ce protocole aborde l’information multi-omique pour la DGS, facilitant ainsi les recherches futures sur les interventions chirurgicales et la modélisation des maladies non seulement chez les rongeurs en hibernation, mais aussi chez d’autres organismes spécialisés.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, de plus en plus de chercheurs ont reconnu que les capacités d’adaptation supérieures des espèces en hibernation offrent des opportunités inestimables pour découvrir de nouveaux mécanismes d’adaptation biologique et peuvent inspirer des percées dans divers domaines médicaux tels que la préservation des organes et la réhabilitation métabolique 1,2,3,4,5,6,7,8 . Le premier protocole chirurgical complet pour la conservation prolongée du rhume hépatique et la transplantation orthotopique en hibernation, l’écureuil terrestre de Daurian (DGS ; Spermophilus dauricus), a été récemment établi. Apparemment, la nature adaptative au froid du SGD permet un stockage frigorifique prolongé des greffons du donneur et une survie post-transplantation élevée des animaux receveurs. Ainsi, un protocole de suivi est nécessaire pour surveiller la récupération postopératoire de l’animal et préparer les échantillons pour diverses études histopathologiques et omiques.

Compte tenu des différences physiologiques significatives entre les DGS et les modèles standard de rongeurs, et des changements physiologiques complexes et dynamiques post-transplantation hépatique chez les animaux receveurs, l’obtention d’échantillons de haute qualité à partir de ceux-ci est cruciale pour les analyses en aval et donc la compréhension de la physiologie greffon-hôte post-transplantation. Outre l’obtention, le traitement et l’examen d’échantillons de sang et de tissus hépatiques à l’aide de méthodes conventionnelles, une dissociation réussie des cellules parenchymateuses hépatiques qui sont des hépatocytes et des cellules non parenchymateuses (CNP) qui comprennent les cellules endothéliales, les cellules stellaires, les cellules de Kupffer et d’autres cellules immunitaires permettrait d’élucider les interactions cellulaires et moléculaires post-opératoires complexes avec les cellules uniques multi-omiques en développement rapide. À cette fin, la méthode classique basée sur la perfusion de collagénase a été développée depuis le début des années 1950 et continuellement affinée 9,10,11. Néanmoins, la structure anatomique distincte du foie DGS, les adhérences postopératoires induites par la reconstruction vasculaire et les altérations physiologiques déclenchées par la chirurgie dans les greffes hépatiques exigent toutes un réglage fin des conditions d’extraction.

Ce protocole fournit des lignes directrices détaillées pour la prise en charge postopératoire et le prélèvement d’échantillons dans les SGD après une transplantation hépatique. Plus précisément, ce protocole permet d’isoler des hépatocytes à partir de greffes hépatiques à haut rendement et à haute viabilité cellulaire, et détaille le traitement ultérieur d’hépatocytes isolés pour le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq).

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de l’Université de Pékin pour le soin et l’utilisation des animaux (LSC-WangSQ-2). Les SGD utilisés dans cette étude ont été produits en laboratoire par des SGD femelles enceintes capturées dans les prairies de la ville de Zhangjiakou. Les animaux avaient environ 1 à 2 ans au moment de l’expérience. Les DGS, mâles et femelles, pesant entre 180 g et 400 g, ont été utilisés comme donneurs et receveurs. Le poids du receveur était légèrement supérieur à celui du donneur, avec une différence de moins de 50 g. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Soins post-transplantation

  1. Hébergez les SGD post-transplantation hépatique dans un environnement chaud et propre sous un cycle lumière/obscurité de 12:12, avec de la nourriture de laboratoire standard et de l’eau fournies à volonté.
  2. Surveillez quotidiennement le poids corporel, évaluez l’incision abdominale pour détecter les saignements et observez l’état mental et les niveaux d’activité du receveur.
  3. Immédiatement après l’opération, administrer une injection sous-cutanée de céfuroxime (16 mg/kg) et de buprénorphine (0,05 mg/kg) toutes les 12 h pendant 3 jours.
  4. Injecter du tacrolimus par voie intramusculaire (1 mg/kg) tous les jours jusqu’à 24 heures avant le prélèvement tissulaire.
    REMARQUE : Étant donné que les SGD sont principalement dérivés de poissons sauvages, les facteurs immunologiques de transplantation demeurent non négligeables. La transplantation entre SGD est considérée comme une allogreffe (et non une transplantation syngénique). Si l’étude doit exclure des facteurs immunologiques, tels que le rejet, assurez-vous que le tacrolimus est normalisé dans la période postopératoire.

2. Préparation de l’échantillon de greffe de foie

  1. Préparation de solutions et d’instruments
    1. Préparez 50 mL de HBSS avec 500 μM d’EGTA (sans Ca2+- et Mg2+ ; pH 7,4). Préchauffer au bain-marie à 40 °C avant utilisation.
    2. Dissoudre la collagénase IV (0,4 mg/mL) dans 50 mL de HBSS (avec Ca2+ et Mg2+) et incuber au bain-marie à 40 °C pendant 30 min.
    3. Solution Percoll : Mélanger Percoll avec 10× PBS dans un rapport de 9:1 (v/v), et diluer avec 1× de PBS dans un rapport de 9:1 (v/v) dans un tube de 15 ml. Gardez la solution sur de la glace.
      REMARQUE : 5 mL de solution Percoll à 90 % sont suffisants par DGS.
    4. Immerger les instruments chirurgicaux dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 min avant utilisation.
    5. Assemblez le système de perfusion composé d’une pompe péristaltique à vitesse réglable, d’un tube silastique et d’un bain-marie. Rincez le tube avec une solution saline chaude pour purger les bulles d’air et fixez un filtre stérile de 0,22 μm à la sortie du tube.
      REMARQUE : Avant de purger les bulles d’air, il est nécessaire de rincer le tube réutilisé en faisant fonctionner abondamment de l’éthanol à 70 % pendant 15 min, suivi d’un rinçage complet avec du ddH2O pendant 15 min pour éliminer l’éthanol résiduel.
  2. Procédure sur l’animal
    1. Anesthésier le SGD post-greffe par injection intrapéritonéale de tribromoéthanol à 2,5 % à une dose de 1 mL/100 g de poids corporel. Effectuez des tests de perte de réflexes, tels que la réaction au pincement des orteils, pour assurer une anesthésie complète.
    2. Rasez la fourrure abdominale et retenez le DGS sur la planche chirurgicale avec la face ventrale vers le haut.
    3. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur la région abdominale de l’animal, puis ouvrez la cavité abdominale en faisant une grande incision croisée de la peau et du péritoine avec des ciseaux tranchants et des pinces dentées.
    4. Déplacez doucement les intestins vers la droite à l’extérieur de la cavité abdominale à l’aide d’un coton-tige jusqu’à ce que la greffe de foie, la veine porte (PV) et la veine cave inférieure (VC) soient clairement exposées (Figure 1A).
      REMARQUE : En raison des adhérences postopératoires dans la cavité abdominale après une transplantation hépatique, disséquez doucement les adhérences à l’aide d’un coton-tige humide.
    5. Insérez une seringue de 5 ml dans la VCI sous la stomie anastomotique pour recueillir 1 à 2 ml de sang, puis appliquez immédiatement une légère pression sur le site de ponction à l’aide d’un coton-tige sec pour obtenir une hémostase après avoir retiré l’aiguille du vaisseau (figure 1B).
      REMARQUE : Pour minimiser les saignements, l’aiguille peut être remplacée par une aiguille d’une seringue de 1 ml, soit environ 30 g.
    6. Avec l’orientation biseauté vers le haut, percez doucement le PV à l’aide d’un cathéter 22-G à un angle de 15° par rapport à la surface du vaisseau, puis rétractez l’aiguille du cathéter. Une fois que la ponction réussie est confirmée, avancez doucement la canule de 1 à 1,5 cm supplémentaire à travers le vaisseau. Sécurisez la position de la canule à l’aide d’une pince vasculaire (Figure 1C).
      REMARQUE : Si la canule est placée correctement, un reflux de sang sera visible. Si la canulation PV échoue ou rencontre des problèmes techniques, passez à la canulation de la VCI infrahépatique et désignez le PV comme voie d’écoulement du perfusat.
    7. Démarrez la pompe de perfusion avec une solution saline chaude à 6-8 mL/min, puis connectez le filtre de 0,22 μm mentionné ci-dessus à la canule.
    8. Une fois la perfusion par PV initiée, faites une incision dans la VCI pour permettre le drainage sanguin. 50 à 80 mL de solution saline sont nécessaires pour une perfusion adéquate (figure 1D).
      REMARQUE : La perfusion réussie est confirmée lorsque le foie transplanté passe à une couleur jaune-blanc pâle au cours de ce processus. Certaines zones de congestion rouge foncé peuvent rester à la surface du foie et ne peuvent pas être complètement éliminées, résultant probablement d’un traumatisme hépatique peropératoire tel qu’une lésion d’ischémie-reperfusion.
    9. Après une perfusion adéquate avec 50 à 80 ml de solution saline chaude, interrompre la pompe.
    10. Lister le lobe latéral gauche à sa base à l’aide d’une suture en soie 2-0, suivie d’une excision du lobe distal par rapport au site de ligature. De même, le lobe médian est ligaturé à sa base et réséqué selon la même méthode (Figure 1E,F).
      REMARQUE : L’hépatectomie partielle est réalisée pour maximiser l’utilisation du foie transplanté à des fins expérimentales multiples et pour réduire la consommation de tampon de collagénase tout en facilitant une digestion complète du foie.
    11. Divisez le tissu hépatique réséqué en plusieurs morceaux : une partie est utilisée pour l’isolement des NPC suivi d’un séquençage de l’ARNsc, les autres parties sont fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pour la coupe histologique, ou congelées dans de l’azote liquide pour d’autres expériences.
      REMARQUE : L’étape 2.2.11 peut être effectuée par une autre personne en même temps que les étapes suivantes pour gagner du temps.
    12. Coupez les tissus en morceaux d’environ 1 à 2 mm3 dans le milieu RPMI-1640, et digérez par voie enzymatique avec du softleMACS selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). La viabilité et la concentration cellulaires ont été déterminées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
      REMARQUE : L’étape 2.2.12 et les étapes 2.2.13 à 2.3.5 se déroulent simultanément.
    13. Coupez le diaphragme et clampez la VCI suprahépatique (Figure 1G).
    14. Transférez le tube d’entrée dans le tampon EGTA préchauffé. Redémarrez la pompe à un débit de 6 à 8 mL/min.
    15. Clamper périodiquement la VCI pendant 5 à 10 secondes pour faciliter une distribution uniforme de la solution de perfusion dans tout le parenchyme hépatique. Le foie gonfle visiblement pendant le clampage et se détend lors de la relâchement.
      REMARQUE : Il est essentiel d’éviter une interruption prolongée du drainage, car un blocage prolongé risque de rompre le mince tissu conjonctif entourant le foie, perturbant la perfusion ou la dynamique des fluides dans le lit capillaire hépatique. De plus, une obstruction prolongée peut compromettre la viabilité cellulaire et réduire le rendement en raison de la sensibilité des hépatocytes aux forces mécaniques.
    16. Après la perfusion avec 40 à 50 ml de solution d’EGTA, amorcer la perfusion du tampon de collagénase à un débit de 4 à 6 ml/min pendant 8 à 10 minutes. Clamper brièvement le vaisseau sanguin de l’effluent comme aux étapes ci-dessus (figure 1H).
      REMARQUE : Après 5-6 minutes de perfusion de collagénase, le foie devient sensiblement plus mou et des fissures de surface apparaissent. En l’absence de ces changements morphologiques, réduisez la vitesse de perfusion à 3-4 mL/min et prolongez le temps total de digestion à 12-13 min. À la fin de la perfusion de 50 mL de collagénase, le foie présente une consistance friable, semblable à celle du tofu, ce qui est un indicateur d’une digestion suffisante (figure 1I).
    17. Arrêtez la pompe et retirez la canule. Coupez le foie du corps, placez-le dans un plat de 5 cm avec 10 ml de milieu DMEM/F12 glacé.
  3. Purification des hépatocytes
    1. Déchirez le foie pour libérer les cellules et transférez la solution cellulaire dans un cône de 50 mL avec un filtre de 70 μm placé sur le dessus.
    2. Après avoir centrifuger la suspension cellulaire à 50 x g pendant 3 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 20 mL de 1× PBS. Répétez cette étape 3 fois. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 5 mL de milieu DMEM/F12 après la dernière centrifugation.
    3. Mélangez délicatement la suspension cellulaire avec un volume égal de solution Percoll à 90 % dans un tube de 15 ml. Centrifugeuse à 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
      REMARQUE : Après la centrifugation par Percoll, le mélange se sépare en trois couches distinctes : la couche supérieure (environ 0,5 à 1 ml) contient des cellules mortes, tandis que les hépatocytes viables sont concentrés dans la couche inférieure (environ 0,5 à 0,8 ml) (figure 2). Un rendement de 5-8 × 107 hépatocytes viables avec une viabilité de >80 % est généralement obtenu avec ce protocole. (Figure 3A,B).
    4. Aspirez soigneusement les cellules mortes et le surnageant, en évitant de perturber vigoureusement les couches, et remettez en suspension les cellules viables avec 10 mL de milieu DMEM/F12. Centrifugeuse à 50 x g pendant 5 min à 4 °C.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension les hépatocytes purifiés avec 1 à 5 mL de PBS 1× complété par 2 % de sérum de veau fœtal jusqu’à une concentration finale de 500 à 1200 cellules/μL.
    6. Mélangez les hépatocytes et les NPC dans un rapport de quantité de 1:1, c’est-à-dire que la suspension cellulaire a été préparée en mélangeant 10 000 hépatocytes et 10 000 NPC.
  4. Séquençage de l’ARNc
    REMARQUE : Les étapes 2.4.1 à 2.4.3 ont été effectuées conformément au guide d’utilisation du kit de préparation de la bibliothèque d’expression génique monocellulaire 3' à base de gouttelettes12. La plate-forme de partitionnement microfluidique de cellules uniques et de codage à barres à base de gouttelettes a été utilisée, qui englobe les étapes critiques de la génération de billes de gel en émulsions (GEM), de la construction de banques d’ADNc et du séquençage Illumina selon les protocoles standard.
    1. Pour effectuer la génération de GEM et le codage à barres, utilisez une suspension cellulaire contenant 20 000 hépatocytes et NPC. L’efficacité de capture des cellules n’est pas inférieure à 60 %.
    2. Pour l’amplification de l’ADNc, nettoyez les échantillons post-GEM-RT conformément au guide de l’utilisateur12.
    3. Construction de bibliothèques
    4. Séquencer des banques d’ARN unicellulaires à l’aide d’une plateforme de séquençage pour atteindre une profondeur de 150 Go par échantillon ; Démultiplexez les fichiers d’appel de base bruts en fichiers FASTQ à l’aide de Cell Ranger (v8.0.0).
    5. Alignez les fichiers FASTQ sur le génome d’Ictidomys tridecemlineatus (accession NCBI : GCF_016881025.1) pour la quantification de l’expression, complétant ainsi le flux de travail expérimental.

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Résultats

L’examen histologique des greffons conservés à 4 °C pendant 24 h et transplantés dans le DGS a révélé une architecture normale du lobule hépatique avec des signes minimes d’inflammation, de nécrose ou de cholestase aux jours 3 et 6 postopératoires, comparables à ceux du groupe opéré par placebo (Figure 4A-C).

L’isolement des hépatocytes primaires du DGS post-opératoire prend environ 1 h. En utilisant le protocole décrit, plus de 5...

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Discussion

Suivant le protocole qui décrit la conservation et la transplantation du foie du donneur dans les SGD, les procédures décrites ici détaillent le suivi postopératoire et la prise en charge pharmacologique adaptée des SGD transplantés avec un foie conservé au froid pendant au moins 24 h. Ce protocole permet au receveur de survivre au-delà de 7 jours après la transplantation, ce qui présente des avantages évidents des hibernateurs en tant que modèles de recherche pour la préservation des or...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le projet majeur national sur les maladies chroniques non transmissibles en sciences et technologies (2023ZD0507600), les subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82170671, 92254301, 32230048, 82371794, 32301306), le programme national de R&D (2024YFA0916804) et la Fondation des talents de l’académicien Shusen Lanjuan de la Fondation pour l’éducation de l’Université du Zhejiang.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1& fois ; PBSServicebioRéf. G4202
10&fois ; PBSServicebioRéf. G4207
4 % ParaformaldéhydeBiosharpRéf. BL539A
BuprénorphineShafeiH12020276
Canule (22 g)BBRAUNRéf. 4254090B
CévuroximeSelleckE4838
Boîte de culture cellulaire (60 mm)NID705001
Collagénase IVSigma-AldrichRéf. C5138
Tube conique (15 mL)NID601052
Tube conique (50 mL)NID602052
Coton-tigeMagasin de fournitures pour la maison
Comptage automatisé de cellules CountstarRuiyuCountstar Rigel S2
DMEM/F12GibicoC11330500BT
EGTASigma-AldrichE4378
FBSGibco10099-141
Filtre (0,22 &mu ; m)Merck MilliporeSLGP033RB
Filtre (70 &mu ; m)Biologix15-1070
gentleMACSMiltenyi130-093-235
HBSS (avec Ca2+ et Mg2+)ServicebioRéf. G4204
HBSS (sans Ca2+ et Mg2+)ServicebioRéférence G4203
Kit de dissociation des PNJMiltenyi130-096-730
PercollCytiva17-0891-09
Pompe péristaltiqueYuyanBT100
Réf. RPMI-1640GibicoC11875500BT
SalinSRBSRB009
SéquenceurIllumina  ;NovaSeq X Plus
Tubes en silastiqueTygonE-3603
Suture en soieÉTHICONSA845G
Seringue (1 ml)Lige ScienceLG05-124Seule une aiguille de seringue sera nécessaire
Seringue (2 ml)Lige ScienceLG05-124Seul le corps de la seringue sera nécessaire
TacrolimusSelleckS5003
Pipette de transfertBiologixRéférence 30-0138A1
Alcool tribromoéthyliqueSigma-AldrichRéf. T48402
Bain-marieSubventionSAP2

Références

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  4. Zhang, L., et al. Cross-species metabolomic profiling reveals phosphocholine-mediated liver protection from cold and ischemia/reperfusion. Am J Transplant. 24 (11), 1979-1993 (2024).
  5. Chen, L., et al. Synergy of 5-aminolevulinate supplement and cx3cr1 suppression promotes liver regeneration via elevated igf-1 signaling. Cell Rep. 42 (8), 112984(2023).
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  13. Hadj-Moussa, H., Storey, K. B. Bringing nature back: Using hibernation to reboot organ preservation. FEBS J. 286 (6), 1094-1100 (2019).
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  15. Merriman, D. K., Lahvis, G., Jooss, M., Gesicki, J. A., Schill, K. Current practices in a captive breeding colony of 13-lined ground squirrels (Ictidomys tridecemlineatus). Lab Anim (NY). 41 (11), 315-325 (2012).
  16. Vaughan, D. K., Gruber, A. R., Michalski, M. L., Seidling, J., Schlink, S. Capture, care, and captive breeding of 13-lined ground squirrels, Spermophilus tridecemlineatus. Lab Anim (NY). 35 (4), 33-40 (2006).

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