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Article de méthode

Diagnostic rapide de l’infection à Mycobacterium tuberculosis et de la résistance aux médicaments par PCR par fluorescence en temps réel

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DOI :

10.3791/68445

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15 juillet 2025

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1The Fifth Division Hospital of Xinjiang Production and Construction Corps, 2Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole de détection de Mycobacterium tuberculosis et de sa résistance aux médicaments à l’aide de la technologie de PCR quantitative en fluorescence en temps réel (qPCR) est présenté.

Résumé

La tuberculose est un problème de santé majeur qui touche de manière disproportionnée les populations vulnérables. L’émergence et la propagation de la tuberculose pharmacorésistante constituent une grave menace pour la santé publique mondiale. Les méthodes de diagnostic traditionnelles de Mycobacterium tuberculosis (MTB), telles que la microscopie à frottis et la culture, ont des limites importantes et entraînent souvent des retards dans le traitement clinique. Pour relever ce défi, un schéma de diagnostic efficace basé sur la PCR fluorescente en temps réel a été développé. Des acides nucléiques MTB de haute qualité peuvent être extraits des échantillons de test, et l’état de résistance peut être identifié aux principaux sites de résistance. Par rapport aux méthodes traditionnelles, cette approche réduit considérablement le temps de détection à quelques heures seulement, ce qui permet de déterminer l’état de l’infection et de la résistance peu de temps après la visite initiale d’un patient. La sensibilité de détection dépasse 85 % et la spécificité atteint 95 %. Cette technologie non invasive minimise non seulement l’inconfort du patient, mais permet également un diagnostic précis dans les institutions médicales de base en raison de son faible coût et de sa grande efficacité. Dans l’ensemble, l’approche représente une amélioration significative dans le diagnostic de la tuberculose.

Introduction

La tuberculose (TB), une maladie infectieuse chronique causée par Mycobacterium tuberculosis (MTB), figure parmi les dix principales causes de décès dans le monde1. La tuberculose pharmacorésistante (TB-RP) représente un défi important pour les efforts de lutte contre la tuberculose. Le Plan d’action pour l’édification de communautés exemptes de tuberculose (2022-2027), publié par le Centre chinois de contrôle et de prévention des maladies (CDC chinois), souligne la nécessité d’un dépistage précoce de la résistance aux médicaments chez tous les patients atteints de tuberculose pulmonaire confirmée bactériologiquement2. Il préconise l’adoption de nouvelles technologies de diagnostic moléculaire afin d’améliorer les capacités de détection de la TB-DR, de raccourcir les délais de diagnostic, de maximiser l’identification des cas de TB-DR, d’assurer un traitement et une prise en charge standardisés et de mettre en œuvre les mesures de contrôle des infectionsnécessaires 3. En outre, l’Avis sur le renforcement de la prévention et du contrôle de la tuberculose pharmacorésistante (n° 4, 2023) impose la promotion à l’échelle nationale de techniques de diagnostic avancées. Il préconise un dépistage rapide de la résistance pour tous les patients atteints de tuberculose confirmée bactériologiquement afin de parvenir à un dépistage universel, d’améliorer la normalisation diagnostique et d’améliorer l’accessibilité aux soins de santé4.

La tuberculose pharmacorésistante désigne les cas de tuberculose qui sont résistants à au moins un médicament antituberculeux. Les classifications actuelles comprennent la tuberculose résistante à la rifampicine (RR), monorésistante, polyrésistante, multirésistante (MDR), pré-résistante aux médicaments (pré-XDR) et ultrarésistante aux médicaments (XDR). Une méta-analyse mondiale de l’épidémiologie de la tuberculose pharmacorésistante révèle des taux de résistance alarmants : 11,6 % pour la tuberculose multirésistante, 15,7 % pour l’isoniazide, 9,4 % pour la rifampicine et 11,8 % pour la monorésistance. Ces données soulignent la gravité et la complexité de la DR-TB5.

La rifampicine et l’isoniazide sont les médicaments fondamentaux du traitement de la tuberculose. Cependant, l’Organisation mondiale de la santé (OMS) note que bien qu’il existe des technologies de diagnostic rapide de la résistance à la rifampicine, il n’existe pas d’outils analogues pour la résistance à l’isoniazide. Cette lacune empêche le diagnostic précoce de la tuberculose multirésistante (TB-MR). La définition provisoire de la « tuberculose résistante à la rifampicine » reflète cette limite diagnostique, mettant en évidence la capacité insuffisante à détecter rapidement la résistance à d’autres médicaments 6,7. L’OMS estime que les cas de tuberculose résistante à l’isoniazide sont deux fois plus fréquents que les cas résistants à la rifampicine. Le recours exclusif au dépistage de la résistance à la rifampicine risque de négliger la tuberculose monorésistante à l’isoniazide (Hr-TB)8. Les patients atteints de tuberculose ultrarésistante non détectée traités par des schémas thérapeutiques standard courent des risques élevés d’échec thérapeutique, de rechute et de progression vers la tuberculose multirésistantede type 9. La résistance à l’éthambutol est également préoccupante. En tant que médicament essentiel pour le traitement de la tuberculose et de la tuberculose multirésistante, l’enquête de référence de 2017 menée en Chine sur la tuberculose pharmacorésistante a révélé des taux de résistance à l’éthambutol de 4,9 % chez les nouveaux cas et de 17,2 % chez les cas deretraitement10.

À l’heure actuelle, pour la détection de la résistance aux médicaments de la tuberculose résiduelle, la culture artificielle reste la méthode préférée dans certains laboratoires, mais la technologie PCR fluorescente en temps réel est supérieure aux méthodes conventionnelles pour détecter la résistance aux médicaments de la tuberculose : détection et quantification : la PCR fluorescente en temps réel fournit une analyse quantitative précise grâce à la surveillance en temps réel des signaux fluorescents, alors que les méthodes conventionnelles n’ont pas cette précision. Les méthodes d’expérimentation traditionnelles prennent du temps et demandent beaucoup de main-d’œuvre, nécessitent du personnel formé et sont très subjectives. Au contraire, la PCR en temps réel capture les sondes et les signaux fluorescents par ordinateur, minimisant ainsi les erreurs humaines. Les méthodes conventionnelles d’analyse de données sont plus subjectives, tandis que la PCR en temps réel permet une analyse précise et objective grâce à des courbes d’amplification, des courbes standard et d’autres méthodes d’analyse. Ces progrès font de la PCR fluorescente en temps réel la méthode privilégiée pour détecter la résistance aux médicaments de la tuberculose11.

En résumé, la tuberculose pharmacorésistante (TB-DR) est devenue une crise mondiale. La résistance aux principaux médicaments -- isoniazide, rifampicine et éthambutol -- complique encore les efforts de lutte contre la tuberculose. La détection rapide et précise de la résistance aux médicaments est essentielle pour orienter les schémas thérapeutiques adaptés, améliorer le succès thérapeutique et atténuer la menace de la tuberculose pharmacorésistante.

Pour relever le défi du diagnostic, cette étude a utilisé une trousse capable d’identifier Mycobacterium tuberculosis et de détecter les mutations résistantes aux médicaments dans les 3,5 heures à l’aide d’échantillons d’expectorations. Ceci a été réalisé avec le soutien de la qPCR par fluorescence en temps réel. La méthode est simple, rentable et précise, ce qui en fait un outil précieux dans la lutte contre la tuberculose pharmacorésistante.

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Protocole

Cette recherche a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital de la cinquième division du Corps de production et de construction du Xinjiang ; Le numéro d’éthique est LLWYH2025001, et il n’y a pas de conflit éthique. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Prélèvement d’échantillons

  1. Pour prélever des échantillons d’expectorations, utilisez des flacons d’expectoration à bouchon à vis normalisés à l’échelle internationale et recommandés par l’Organisation mondiale de la santé (OMS), ou des boîtes en plastique scellées et des boîtes en papier ciré.
  2. Étiquetez les contenants d’expectorations avec le nom du patient, son numéro (le numéro de séquence du patient externe pour les nouveaux patients ou le numéro d’enregistrement pour les patients de suivi), les articles d’examen et les numéros de séquence 1, 2, 3 du contenant (1 = expectoration immédiate le même jour, 2 = expectoration de nuit, 3 = expectoration du matin le lendemain). Pour les patients sans expectorations, prélever des échantillons par prélèvement d’expectorations induites par aérosol.
    REMARQUE : Le personnel doit évaluer la qualité des échantillons d’expectorations recueillis. Le volume de l’échantillon doit généralement être maintenu à 3-5 ml. Les échantillons qualifiés comprennent les expectorations sèches, les expectorations brunes tachées de sang, les expectorations contenant une petite quantité de sang frais ou les expectorations muqueuses. Les échantillons non qualifiés, tels que la salive, doivent être soumis à nouveau pour analyse après des directives supplémentaires.

2. Prétraitement des expectorations

  1. Ajouter 1 à 2 fois le volume de la solution de NaOH à 4 % dans le contenant d’expectoration en fonction du volume d’expectoration recueillie. Agitez et mélangez le contenu pendant 2 min.
  2. Placez le récipient dans une enceinte de biosécurité à température ambiante pendant 15 min, en le secouant plusieurs fois pendant cette période pour assurer une liquéfaction complète des expectorations.
    REMARQUE : Manipulez le NaOH avec précaution en raison de sa nature corrosive. Si les expectorations ne sont pas complètement liquéfiées, augmentez le temps d’agitation. Cette étape est particulièrement importante tout au long de l’expérience.

3. Préparation des réactifs (zone pré-PCR)

  1. Préparation des réactifs : Préparez les réactifs dans la zone pré-PCR désignée. Décongeler les réactifs congelés à température ambiante. Vortex pendant 5 à 10 s. Centrifugeuse à 3000 × g pendant 5 à 10 s à température ambiante.
    REMARQUE : Ce réactif est un système double (A/B) et doit être préparé séparément.
  2. Préparation du master mix PCR
    1. Mélange A : Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, mélanger (n + 3) × 19,6 μL de RIF PCR Mélange A et (n + 3) × 0,4 μL d’enzyme TB. Vortex pendant 5 à 10 s. Centrifugeuse à 3000 × g pendant 5 à 10 s à température ambiante (PCR Mix A : 60 μL).
    2. Mélange B : Dans un autre tube de microcentrifugation de 1,5 mL, mélanger (n + 3) × 19,6 μL de RIF PCR Mélange B et (n + 3) × 0,4 μL d’enzyme TB. Vortex et centrifugeuse comme ci-dessus (PCR Mix B : 60 μL).
  3. Conservation et utilisation : Conservez les mélanges maîtres préparés à ≤-18 °C. S’il n’est pas utilisé immédiatement, utiliser dans les 4 heures.
    REMARQUE : Le même protocole s’applique aux réactifs EMB et INH.
  4. Aliquotage du mélange maître PCR : Distribuer 20 μL de PCR Mix A et Mix B dans des tubes de réaction PCR à paroi mince séparés. Transférez les tubes aliquotes dans des sacs scellés vers la zone d’extraction.

4. Extraction d’acides nucléiques et chargement d’échantillons (zone d’extraction)

  1. Centrifuger 1,2 mL d’expectoration entièrement liquéfiée à 15 058 × g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant et conservez la pastille. Facultatif : Centrifuger l’ensemble de l’échantillon digéré si l’équipement le permet.
  2. Remettre la pastille en suspension dans une solution saline de 1,2 mL, un vortex et une centrifugeuse à 15 058 × g pendant 5 minutes à température ambiante. Répétez cette étape de lavage trois fois.
  3. Ajoutez 250 μL de tampon d’extraction TB à la pastille. Vortex et effectuer une lyse thermique à 99 °C pendant 10 min. Refroidir à température ambiante. Centrifuger à 15 058 × g pendant 1 min à température ambiante et prélever le surnageant (échantillon extrait).
    REMARQUE : Pour les échantillons visqueux, augmentez le volume du tampon de liquéfaction ou prolongez le temps de vortex. Si les échantillons sont uniquement destinés à l’extraction de l’ADN, prolongez le temps de liquéfaction pour assurer une digestion complète.
  4. À l’aide d’une micropipette, ajoutez 5 μL de l’échantillon extrait ou des témoins négatifs/positifs dans chaque tube de réaction à paroi mince de PCR. Fermez immédiatement les tubes et étiquetez-les de manière appropriée.
  5. Tubes PCR chargés par vortex pendant 5 à 10 s et centrifugeuse brièvement (5 à 10 s). Tubes de transfert vers la zone d’amplification PCR.

5. Amplification PCR (zone d’amplification)

REMARQUE : Les programmes de détection de la résistance à la rifampicine, à l’éthambutol et à l’isoniazide ont été mis en place sur un thermocycleur Hongshi (tableau 1, tableau 2 et tableau 3). Les conditions de cyclisme sont incluses.

  1. Placez les tubes réactionnels à paroi mince PCR chargés dans le thermocycleur pour l’amplification.
  2. Accédez à l’interface du cycleur. Cliquez sur Assistant d’expérience et sélectionnez le type d’expérience Courbe de fusion standard (comme illustré à la figure 1).
  3. Cliquez sur l’éditeur de plaques, sélectionnez horizontalement deux puits vides adjacents et attribuez le modèle de médicament correspondant à partir du panneau de droite pour définir un échantillon (comme illustré à la figure 2).
  4. Configurez les contrôles négatifs/positifs et les informations sur les échantillons. Cliquez sur Démarrer pour lancer le programme. La durée est de 2 h et 22 min.
  5. Une fois terminé, transférez les tubes de réaction à paroi mince PCR (scellés) dans un sac scellé. Sécurisez la fermeture et la poignée comme des déchets biologiques dangereux.
  6. Cliquez sur Analyser sur le thermocycleur pour traiter les données.
    REMARQUE : Les limites de détection de cette méthode sont les suivantes : Groupe composite : 10 bactéries/mL ; rifampicine : 20 000 bactéries/mL ; Isoniazide : 10 000 bactéries/mL ; Éthambutol : 10 000 bactéries/mL. (Les données de limite de détection (LD) sont dérivées de l’analyse statistique de 765 cas cliniques fournie dans le manuel d’instructions du réactif.)

6. Interprétation des résultats

  1. Déterminez les mutations en comparant les différences de température de fusion (Tm) entre les échantillons de test et les témoins positifs.
    REMARQUE : Type sauvage (sensible aux médicaments) : Les valeurs Tm de l’échantillon correspondent au témoin positif dans les quatre canaux (écart ≤1 °C). Mutant (résistant aux médicaments) : La valeur Tm dans n’importe quel canal est inférieure de ≥2 °C à celle du témoin positif (ΔTm ≥2 °C).

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Résultats

Cette étude a utilisé la PCR par fluorescence en temps réel et l’analyse de la courbe de fusion pour tester des échantillons d’expectorations de 17 patients atteints de tuberculose. De plus, 30 patients ont subi des tests de résistance à la rifampicine et 20 ont été testés pour la résistance à l’isoniazide et à l’éthambutol. La méthode de PCR par fluorescence en temps réel a démontré un taux de détection positif de 88,2 % pour le complexe Mycobacterium tuber...

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Discussion

L’émergence de souches résistantes du complexe Mycobacterium tuberculosis (MTBC) à l’échelle mondiale a considérablement compliqué le traitement des patients atteints de tuberculose. En particulier, la tuberculose multirésistante (MDR) et la tuberculose ultrarésistante (XDR) posent des défis considérables à la lutte contre la tuberculose12. La détection rapide de la résistance aux médicaments est cruciale pour concevoir des schémas thérapeutiques appropri...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été financée par une subvention spéciale du Corps Tuberculosis Project.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Centrifugeuse
Tampon de lyseXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Kit de détection des mutations de résistance à l’ethambutol de Mycobacterium tuberculosisXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Kit de détection des mutations de résistance à l’isoniazide de Mycobacterium tuberculosisXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Détection des mutations de résistance à la rifampicine de Mycobacterium tuberculosis KiXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
24031001 Système de PCR en temps réel SLAN-96PShanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.SLAN-96P
Solution de traitement des expectorationsXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Pipette
à grande vitesse24110701240308012401110124110701 TopPette

Références

  1. Salari, N., et al. Global prevalence of drug-resistant tuberculosis: A systematic review and meta-analysis. Infect Dis Poverty. 12 (1), 57(2023).
  2. Cai, X., Xu, X., He, G., Jiang, X., Wu, L. Drug resistance in drug-resistant tuberculosis patients with and without diabetes mellitus: A comparative analysis. BMC Infect Dis. 24 (1), 807(2024).
  3. Egan, K. A., et al. Compensatory evolution in NusG improves fitness of drug-resistant M. tuberculosis. Nature. 628 (8006), 186-194 (2024).
  4. Sulis, G., Pai, M. Isoniazid-resistant tuberculosis: A problem we can no longer ignore. PLoS Med. 17 (1), e1003023(2020).
  5. Perumal, R., et al. Regimens for drug-resistant tuberculosis. N Engl J Med. 388 (2), 189(2023).
  6. Menzies, D., et al. Effect of duration and intermittency of rifampin on tuberculosis treatment outcomes: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 6 (9), e1000146(2009).
  7. Turkova, A., et al. Shorter treatment for nonsevere tuberculosis in African and Indian children. N Engl J Med. 386 (10), 911-922 (2022).
  8. Diagnosis of tuberculosis and detection of drug-resistance: rapid communication. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/B09111 (2024).
  9. Xiang, X., et al. Mycobacterial ethambutol responsive genes and implications in antibiotics resistance. J Drug Target. 29 (3), 284-293 (2021).
  10. Deshpande, A., Likhar, R., Khan, T., Omri, A. Decoding drug resistance in Mycobacterium tuberculosis complex: Genetic insights and future challenges. Expert Rev Anti Infect Ther. 22 (7), 511-527 (2024).
  11. Sun, Q., et al. Mutations within embCAB are associated with variable level of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from China. Antimicrob Agents Chemother. 62 (1), e01279-e01317 (2017).
  12. Noordhoek, G. T., et al. Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: A blind comparison study among seven laboratories. J Clin Microbiol. 32, 277-284 (1994).
  13. Lee, H., et al. Assessment of the quantitative ability of AdvanSure TB/NTM real-time PCR in respiratory specimens by comparison with phenotypic methods. Ann Lab Med. 34, 51-55 (2014).
  14. Murphy, S. G., et al. Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing. Front Public Health. 11, 1206056(2023).
  15. Araya, B. T., et al. Performance of the Abbott RealTime MTB and RIF/INH resistance assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis and resistance markers in sputum specimens. PLoS One. 16, e0251602(2021).
  16. Motta, I., et al. Recent advances in the treatment of tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 30 (9), 1107-1114 (2024).
  17. Zhang, X., et al. A new method for the detection of Mycobacterium tuberculosis based on the CRISPR/Cas system. BMC Infect Dis. 23 (1), 680(2023).
  18. Sam, I. K., et al. TB-QUICK: CRISPR-Cas12b-assisted rapid and sensitive detection of Mycobacterium tuberculosis. J Infect. 83 (1), 54-60 (2021).
  19. Park, Y. K., et al. Correlation of the phenotypic ethambutol susceptibility of Mycobacterium tuberculosis with embB gene mutations in Korea. J Med Microbiol. 61 (4), 529-534 (2012).
  20. Global tuberculosis report. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-programme-on-tuberculosis-and-lung-health/tb-reports/global-tuberculosis-report-2023 (2023).
  21. Parsa, S., et al. Detection of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from sputum samples by high-resolution melting analysis. Curr Microbiol. 79 (9), 257(2022).
  22. Plinke, C., et al. embCAB sequence variation among ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates without embB306 mutation. J Antimicrob Chemother. 65 (7), 1359-1367 (2010).
  23. Xie, L., et al. Accurate and affordable detection of rifampicin and isoniazid resistance in tuberculosis sputum specimens by multiplex PCR-multiple probes melting analysis. Infection. 52 (6), 2371-2398 (2024).

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