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Article de méthode

Prélèvement de liquide de lavage nasal murin sans contamination sanguine

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DOI :

10.3791/68451

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11 juillet 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Kindai University Faculty of Medicine, 2Department of Arts and Sciences, Kindai University Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une nouvelle méthode pour éviter la contamination sanguine dans le liquide de lavage nasal murin (FLN). Comme cette méthode garantit la collecte de NLF sans contamination sanguine, elle permet des détections plus précises des composants immunologiques et de divers agents pathogènes respiratoires.

Résumé

Les échantillons des voies respiratoires supérieures, y compris le liquide de lavage nasal (NLF) et les écouvillons nasaux, sont utiles pour détecter les agents pathogènes, y compris les virus et les bactéries, qui peuvent provoquer des maladies respiratoires. La NLF a été utilisée pour examiner les composants cellulaires et humoraux du système respiratoire, par exemple, pour évaluer l’induction de l’immunoglobuline (Ig) A après des vaccinations muqueuses. Chez les rongeurs expérimentaux, les échantillons de FLN peuvent être prélevés par voie transpharyngée ou transtrachéale. Bien qu’il ait été rapporté que la voie transpharyngée était plus efficace que la voie trans-trachéale pour recueillir les échantillons de FLN, les échantillons de FLN prélevés par la voie transpharyngée étaient souvent contaminés par du sang, ce qui affectait les niveaux de contenu cellulaire et humoral dans les échantillons de FLN d’origine. Ainsi, cette étude visait à établir une nouvelle méthode de collecte de NLF chez des souris expérimentales afin de minimiser la contamination sanguine. Brièvement, avant que la mâchoire inférieure de la souris ne soit séparée, des boules de coton ont été placées dans la bouche pour absorber le sang. Lorsque l’hémorragie a cessé, les échantillons de NLF ont été prélevés en insérant une micropipette dans la choane et en rinçant deux fois avec 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (volume final : 400 μL/souris). Pour détecter la contamination sanguine, un test médico-légal simple et sensible au luminol qui détecte l’hémoglobine a été utilisé. Le test au luminol a démontré qu’une contamination sanguine était détectable dans les échantillons de FLN récoltés par la méthode conventionnelle (sans boules de coton), mais pas dans ceux récoltés par la nouvelle méthode (avec des boules de coton). En raison de la contamination du sang, les concentrations totales d’IgA et d’IgG dans les échantillons de FLN étaient plus élevées dans la méthode conventionnelle que dans la méthode nouvelle ; le sang est connu pour contenir des niveaux beaucoup plus élevés d’IgA et d’IgG que la NLF. Par conséquent, cette méthode unique peut être utilisée comme une méthode simple et sensible pour collecter des échantillons NLF sur des souris expérimentales afin de prévenir la contamination sanguine.

Introduction

Dans la recherche clinique et fondamentale, des méthodes de prélèvement d’échantillons appropriées sont les plus cruciales pour évaluer les résultats. Le lavage nasal est une technique d’irrigation utilisée pour analyser les composants cellulaires et humoraux des voies respiratoires 1,2,3. Cliniquement, le liquide de lavage nasal (NLF) a été utilisé comme échantillon non invasif efficace pour la découverte de biomarqueurs, avec plusieurs études soutenant son utilisation dans diverses maladies respiratoires, notamment la sinusite, la fibrose kystique et les troubles respiratoires généraux 4,5,6,7. Chez les animaux de laboratoire, le NLF a également été utilisé pour étudier des modèles de maladies respiratoires, notamment la grippe, la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) et les maladies allergiques 3,8,9. Cette méthode est largement utilisée pour déterminer les principaux biomarqueurs inflammatoires, tels que les cellules polymorphonucléaires et les cytokines, qui sont souvent examinées comme indicateurs de réponses aux allergènes, à l’asthme et aux infections respiratoires 10,11,12. Plus récemment, afin d’étudier l’efficacité et l’innocuité de candidats vaccins intranasaux potentiels, des échantillons de FLN ont souvent été prélevés sur des animaux de laboratoire, et les niveaux d’agents pathogènes et d’immunoglobulines (Ig) dans les échantillons de FLN ont été quantifiés en tant qu’indicateurs13.

Chez les souris expérimentales, le NLF peut être collecté à l’aide de la méthode trans-pharyngée ou trans-trachéale. Dans la méthode transpharyngée, la tête murine, y compris la région palatopharyngée, a été séparée du larynx, puis un cathéter a été inséré à travers l’ouverture pharyngée dans la choane pour injecter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et recueillir le NLF de la narine14. La méthode trans-trachéale a permis d’accéder aux voies respiratoires par la trachée sans sectionner la tête, et la NLF a été prélevée dans la narine, minimisant ainsi le risque de contamination sanguine. Bien que ces deux méthodes principales aient été employées pour la collecte de NLF chez des souris expérimentales, les deux méthodes conventionnelles ont leurs propres limites. Il a été démontré que la méthode trans-trachéale produit des quantités plus faibles de NLF que la méthode trans-pharyngée en raison de la fuite de liquide de lavage trans-trachéal dans la cavité buccale. L’étude précédente a montré que, après l’injection de PBS, les volumes de liquide récupérés dans la NLF étaient de 70 % à 80 % et de 90 % à 100 % dans les méthodes trans-trachéale et trans-pharyngée, respectivement14. Bien que la méthode transpharyngée puisse être considérée comme meilleure avec de plus grandes quantités de NLF que la méthode trans-trachéale, la contamination du sang pendant la procédure était inévitable dans une certaine mesure14,15. De même, plusieurs études ont rapporté que les échantillons de NLF étaient souvent contaminés par des niveaux élevés de protéines sériques sanguines 16,17,18. Cela peut interférer avec la détection et la quantification de biomarqueurs spécifiques du NLF pour les maladies respiratoires19. Cela peut également affecter les concentrations d’Ig, en particulier d’IgA et d’IgG, dans les échantillons de NLF, car le sang contient de plus grandes quantités d’IgA et d’IgG que le NLF.

Pour relever ces défis, cette étude visait à établir une méthode transpharyngée unique, simple et fiable pour collecter des échantillons de FLN de souris expérimentales, en maximisant le rendement des échantillons et en minimisant la contamination sanguine. Au cours des processus expérimentaux, des boules de coton ont été placées dans la bouche de la souris pour inhiber la contamination sanguine, puis du PBS a été injecté pour recueillir des échantillons de NLF dans la narine. Les niveaux de contamination sanguine dans le NLF ont été déterminés à l’aide d’une technique médico-légale, la chimiluminescence à base de luminol, qui permet une semi-quantification des niveaux d’hémoglobine (Hb) dans les échantillons NLF ; la réaction du luminol dans le NLF recueilli par la nouvelle méthode était négative. Ainsi, la nouvelle méthode actuelle peut améliorer la qualité des échantillons NLF pour diverses expériences biologiques, telles que les tests immuno-enzymatiques (ELISA), les profils de cytokines, les déterminations de biomarqueurs immunologiques et médicaux et les modèles de maladies respiratoires murines.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la faculté de médecine de l’Université de Kindai et réalisées selon les critères définis par les National Institutes of Health (NIH)20. Des souris mâles C57BL/6 âgées de 4 mois ont été utilisées dans cette étude. Des renseignements sur les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont présentés dans la Table des matières.

1. Collecte du NLF

  1. Euthanasier une souris avec 5 % d’isoflurane21 en suivant les protocoles approuvés par l’établissement.
  2. Placez la souris sur son dos sur une plaque chirurgicale et fixez-la en épinglant les quatre membres.
  3. Prélever du sang dans le cœur à l’aide d’une seringue de 1 ml.
  4. Ouvrez la cavité abdominale à l’aide de ciseaux pour exposer les organes viscéraux et le diaphragme.
  5. Incisez le diaphragme et les côtes à l’aide de ciseaux pour rendre visible l’oreillette droite.
  6. Percez l’oreillette droite à l’aide de ciseaux pour prélever davantage de sang.
  7. Placez trois boules de coton dans la gueule de l’animal tout en tirant la langue.
  8. Séparez la mâchoire inférieure à l’aide de ciseaux tout en levant la tête (position nez vers le haut) pour inhiber la contamination sanguine dans le NLF.
  9. Remplacez les boules de coton par des neuves pour éviter la contamination par le sang.
  10. Une fois le saignement cessé, injecter 200 μL de PBS stérile dans la choane et recueillir le NLF éjecté des narines dans un tube de 1,5 mL.
  11. Répétez l’étape 1.10 une fois de plus.

2. Détection de la contamination du sang par chimiluminescence du luminol

  1. Dissoudre 1 mg de luminol et 5 mg de peroxyde de sodium (Na2O2) avec 1 mL d’eau stérile à l’aide d’un tube de 1,5 mL pour préparer la solution mère.
    REMARQUE : La concentration finale est de 1 mg/mL de luminol et de 5 mg/mL de Na2O2.
  2. Couvrez le tube d’une feuille d’aluminium et rangez-le à 4 °C jusqu’à utilisation.
  3. Diluez la solution mère 10 fois avec de l’eau désionisée pour obtenir une solution de travail.
    REMARQUE : La concentration finale est de 0,1 mg/mL de luminol et de 0,5 mg/mL de Na2O2.
  4. Pipeter 2 μL d’échantillons NLF dans les puits d’une plaque de 96 puits.
  5. Ajouter 100 μL de la solution de luminol diluée dans chaque puits.
  6. Agitez brièvement la plaque à 96 puits pour mélanger les échantillons avec la solution de luminol.
  7. Observez directement la chimiluminescence du luminol dans l’obscurité.
  8. Semi-quantifier la concentration en Hb à l’aide d’un luminomètre, si nécessaire.

3. Quantification des IgA et des IgG par ELISA

  1. Enduire les puits de plaques de 96 puits avec 100 μL/puits d’anticorps anti-IgA (20 ng/puits ; 200 ng/mL) ou IgG (10 ng/puits ; 100 ng/mL) (voir le tableau des matières).
  2. Fermez les plaques et incubez-les à 4 °C pendant la nuit.
  3. Lavez les plaques trois fois avec 300 μL/puits d’un tampon de lavage contenant 0,05 % de Tween 20 dans du PBS à chaque fois, puis épongez les plaques sur du papier absorbant.
  4. Ajouter 200 μL d’un diluant d’essai contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 0,2 % de Tween 20 dans du PBS dans chaque puits.
  5. Incuber les plaques à température ambiante (RT) pendant 60 min.
  6. Aspirez le diluant de dosage, puis épongez les plaques sur du papier absorbant.
  7. Préparez 100 ng/mL d’un étalon d’IgA ou d’IgG de souris avec le diluant d’essai et effectuez deux dilutions en série : 50 ng/mL, 25 ng/mL, 12,5 ng/mL, 6,25 ng/mL, 3,13 ng/mL, 1,56 ng/mL et 0,78 ng/mL.
    REMARQUE : Le volume requis de chaque étalon est de 100 μL par puits.
  8. Diluer les échantillons avec le diluant de dosage aux dilutions appropriées : sérum (104 à 106), NLF (10, 50, 200 et 500) et BALF (101 à 104).
    REMARQUE : Le volume requis de chaque échantillon est de 100 μL par puits.
  9. Ajouter 100 μL d’étalons d’IgA ou d’IgG et des échantillons dans les puits appropriés.
  10. Incuber les plaques à RT pendant 75 min.
  11. Lavez les plaques trois fois avec 300 μL/puits de tampon de lavage à chaque fois, puis épongez les assiettes sur du papier absorbant.
  12. Diluer un anticorps anti-souris F(ab')2 conjugué à la peroxydase (voir le tableau des matériaux) avec le diluant de dosage à la dilution appropriée : dilution 10 fois4.
    REMARQUE : Le volume requis est de 100 μL par puits.
  13. Ajouter 100 μL de l’anticorps anti-souris F(ab')2 dilué conjugué à la peroxydase dans chaque puits.
  14. Incuber les plaques à RT pendant 75 min.
  15. Lavez les plaques cinq fois avec 300 μL/puits de tampon de lavage à chaque fois, puis épongez les plaques sur des tours de papier.
  16. Ajouter 100 μL d’une solution de substrat contenant de la tétraméthylbenzidine (TMB) et du peroxyde d’hydrogène dans chaque puits.
  17. Incuber les plaques à RT pendant 5 min.
  18. Ajouter 50 μL d’une solution d’arrêt, l’acide sulfurique 2 N (2N H2SO4), dans chaque puits.
  19. Mesurez l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  20. Déterminez les concentrations d’IgA et d’IgG dans chaque échantillon à l’aide des courbes standard.

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Résultats

À l’aide de la méthode conventionnelle ou nouvelle, des échantillons de FLN ont été prélevés sur des souris C57BL/6 par la voie transpharyngée. Comme le montre la figure 1, les échantillons de FLN prélevés par la méthode conventionnelle étaient légèrement teintés de rose (figure 1A) ; les échantillons de FLN prélevés par la nouvelle méthode étaient clairs (figure 1B). Comme la différence semblait résulter d’une contamination sanguin...

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Discussion

Le lavage nasal est une technique précieuse pour acquérir des informations biochimiques, cytologiques et biologiques dans les maladies respiratoires, telles que la grippe et le COVID-1923. Outre l’identification de diverses cellules infiltrantes, la composition non cellulaire des voies respiratoires peut être examinée à partir des échantillons NLF à l’aide de diverses méthodes, telles que l’ELISA, l’immunotransfert et la réaction en chaîne par polymérase quantitat...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Seiichi Omura, Ph.D., Cong Thanh Nguyen, M.D., Ph.D., Kota Moriguchi, M.D., Ph.D., Reona Shiro, M.D., et Sandesh Rimal, M.S., Département de microbiologie, Faculté de médecine de l’Université Kindai, et Hirotaka Ebina, Ph.D., Shinya Okamura, Ph.D., et Yasuo Yoshioka, Ph.D., Virus Vaccine Group, BIKEN Innovative Vaccine Research Alliance Laboratories, Institut de recherche sur les maladies microbiennes, Université d’Osaka, pour des discussions utiles. Nous exprimons également notre gratitude aux membres de l’Institut de recherche en sciences de la vie de l’Université de Kindai pour leur excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie du Japon, par le biais de la bourse Monbukagakusho (MEXT, 2021-2025) (I.A.), de la subvention d’aide à la recherche scientifique KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) JP23K06493 (F.S.), JP21K07287/JP24K10500 (A.-M. P.), et JP22K18378/JP24K10163 (I.T.), et Kindai University Research Enhancement Grant KD2406 (F.S.) et KD2506 (I.T.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille de fixation animaleNatsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, JaponKN-358-ANous avons fixé une souris avec des aiguilles de fixation animales. Inox; longueur totale, 23 mm ; et pointe d’aiguille, 15 mm.
BD OptEIATM  ; Ensemble de réactifs de substrat TMBBD Biosciences, San Diego, CA, États-Unis555214Nous avons ajouté 100 &mu ; L de solution de substrat TMB par puits.
Bell JarNANANous avons utilisé un cloche pour l’anesthésie.
Plaques immuno-non stériles transparentes à fond plat à 96 puits  ;ThermoFisher Scientific, Rochester, NY, États-Unis442404Nous avons utilisé des plaques immuno-non stériles transparentes à 96 puits à fond plat avec traitement de surface MaxiSorp pour les dosages immuno-enzymatiques.
Boule de cotonSansho Co., Ltd., Tokyo, Japon94-1951Nous avons utilisé des boules de coton pour éviter la contamination du sang. Le diamètre des boules de coton était de 7 mm.
Sérum fœtal bovinSigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, États-Unis172012-500 MLNous avons ajouté 10 % de sérum fœtal bovin au diluant de dosage.
Pinces (micro-pinces pour les expériences de recherche, pointe incurvée)Sansho Co., Ltd., Tokyo, Japon91-1506Nous avons utilisé des pinces pour la disection. Modèle, HSC 551-10 ; et sur toute la longueur, 105 mm.
Pinces (pinces à épiler de précision)Sansho Co., Ltd., Tokyo, Japon91-2772Nous avons utilisé des pinces pour la disection. Modèle, HSC 607-12 ; couche sur toute la longueur, 120 mm ; et diamètre de la pointe, 0,3 mm.
Chèvre Anti-souris IgA-UNLBSouthernBiotech, Birmingham, AL, États-Unis1040-01Nous avons enduit des plaques transparentes à fond plat immuno-non stériles à 96 puits avec 100 &mu ; L/puits (20 ng/puits) d’immunoglobuline A totale.
L’isoflurane  ;Viatris Inc., Canonsburg, Pennsylvanie, États-Unis NANous avons utilisé l’isoflurane pour l’anesthésie.
Ensemble de réactifs Luminol RectionFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japon124-06511Nous avons utilisé un ensemble de réactifs de réaction au luminol pour détecter l’hémoglobine dans les échantillons NLF.
MicrotubeWatson Co., Ltd., Tokyo, Japon131-7155CNous avons utilisé des microtubes pour collecter le NLF et le BALF (microtube de 1,5 mL avec capuchon de verrouillage, fond rond, capuchon doux au toucher).
Eau Milli-QMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneMilli-Q Direct 8Nous avons utilisé de l’eau MilliQ pour fabriquer une solution de luminorection supplémentaire.
Mini-Shaker PSU-2TBiosan Ltd., Riga, LettoniePSU-2TNous avons secoué des plaques à 96 puits à l’aide du Mini-Shaler PSU-2T.
Souchede souris CLEA Japan, Inc., Tokyo, JaponNAnous avons utilisé des souris mâles C57BL/6 âgées de 4 mois.
Nunc MicroWell 96 puits, traité Nunclon Delta, microplaque à fond platThermo Fisher Scientific Nunc A/S . Kamstrupvej, Roskilde, Danemark136101Nous avons utilisé la microplaque NuncTM MicroWellTM 96 puits, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom pour le test du luminol.
Fragment AffiniPure F(ab')2 UgG anti-souris de chèvre, F(ab')2 Spécifique (réaction croisée minimale aux protéines sériques humaines, bovines et de cheval)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, États-Unis115-036-072Nous avons ajouté 100 &mu ; L de fragment de chèvre AffiniPure F(ab')2 conjugué à la peroxydase, spécifique du fragment F(ab')2, comme anticorps de détection (dilution 10 000 fois) à chaque puits.
Solution saline tamponnée au phosphateSigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, États-UnisD8537-500MLNous avons utilisé la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (modifiée sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium, liquide, filtrée stérilement, adaptée à l’abattage cellulaire) pour la collecte de NLF et de BALF.
Pipette  ;Watson Co., Ltd., Tokyo, JaponNANous avons utilisé un 200-&mu ; Pipette L pour le lavage nasal.
Pointe de pipetteWatson Co., Ltd., Tokyo, JaponNANous avons utilisé un 200-&mu ; L pointe de pipette multifit pour le lavage nasal.
Polyoxyéthylène(20) Monolaurate de sorbitan (Tween 20)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japon167-11515Nous avons ajouté 0,05 % de Tween 20 au tampon de lavage et 0,2 % de Tween 20 au diluant de dosage.
Anticorps IgG anti-souris de chèvre purifiée (réactivité x minimale)BioLegend, San Diego, CA, États-Unis405301Nous avons enduit des plaques immuno-non stériles transparentes à fond plat à 96 puits avec 100 &mu ; L/puits (10 ng/puits) d’immunoglobuline G totale.
Petits ciseaux, double pointeSansho Co., Ltd., Tokyo, Japon91-7005Nous avons utilisé des ciseaux pour la dissécation. Modèle, S-4A ; et sur toute la longueur, 115 mm.
Acide sulfuriqueWako Pure Chemical Industries, Ltd, Tokyo, Japon192-04755Nous avons ajouté 50 &mu ; L de 2 N d’acide sulfurique à chaque puits pour arrêter la réaction.
Cathéter intraveineux Surflo  ;Terumo Corporation, Tokyo, Japon  ;SR-FS2032Nous avons utilisé un cathéter intraveineux surflo et injecté du PBS dans la trachée pour le lavage broncho-alvéolaire. Cathéter, 20G ; longueur du cathéter, 32 mm ; diamètre intérieur du cathéter, 0,80 mm ; diamètre extérieur du cathéter, 1,1 mm ; et aiguille intérieure, 22G.
Ciseaux droits chirurgicauxSansho Co., Ltd., Tokyo, Japon91-7004Nous avons utilisé des ciseaux pour la dissécation. Modèle, S-3B ; et sur toute la longueur, 120 mm.
Plaque chirurgicaleNatsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, JaponKN-321-BNous avons utilisé une planche en liège pour la dissection. Profondeur, 20 cm ; largeur, 15 cm ; et hauteur 3 cm.
Lecteur de microplaques multimode hybride Synergy H1Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USANANous avons mesuré l’absorbance d’échantillons à 450 nm, à l’aide du lecteur de microplaques multimode hybride Synergy H1.
SeringueTerumo Corporation, Tokyo, Japon  ;SS-01TNous avons utilisé une seringue de 1 mL pour prélever du sang dans le cœur.
Fil  ; Niccho Kogyo Co., Ltd. Tokyo JaponNANous avons attaché un cathéter avec du fil pour assurer un bon positionnement pendant la procédure.

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