Ce protocole permet d’isoler suffisamment de chondrocytes primaires en 6 à 8 heures, ce qui facilite des investigations plus approfondies de la biologie du cartilage et des mécanismes de la maladie du cartilage.
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Article de méthode
Ce protocole permet d’isoler suffisamment de chondrocytes primaires en 6 à 8 heures, ce qui facilite des investigations plus approfondies de la biologie du cartilage et des mécanismes de la maladie du cartilage.
La destruction du cartilage articulaire entraîne une altération de l’activité des chondrocytes, qui est un facteur causal majeur dans diverses maladies du cartilage, notamment l’arthrose et la polyarthrite rhumatoïde. En tant que type de cellule le plus abondant dans le cartilage, une étude approfondie des propriétés biologiques des chondrocytes est essentielle pour le développement de stratégies efficaces de traitement des maladies. L’isolement et la culture de chondrocytes primaires fournissent des matériaux expérimentaux importants pour l’étude des maladies du cartilage et contribuent à démêler les mécanismes de lésion et de réparation du cartilage. Ce protocole fournit une description détaillée des méthodes d’isolement et de culture in vitro des chondrocytes primaires dérivés de souris. En utilisant le protocole optimisé de la collagénase II, l’isolement des chondrocytes peut être terminé en 8 heures pour les échantillons de cartilage de l’articulation du genou de souris néonatale. Le rendement cellulaire est d’environ 1-2 × 10³ cellules/mg de tissu cartilagineux, variant avec la fraîcheur des tissus et la densité cellulaire initiale ; Les cellules isolées présentent une viabilité de >90 %. Ce protocole utilise des chondrocytes primaires de souris comme exemple, montrant les caractéristiques morphologiques et l’état d’adhésion des cellules cultivées pendant 1, 2 et 5 jours après l’isolement. L’amplification en chaîne quantitative par polymérase par transcription inverse (RT-qPCR) et le western blot ont montré que le traitement à l’interleukine-1β (IL-1β) réduisait le collagène de type II alpha 1 (Col2a1) et augmentait l’expression de la métallopeptidase matricielle 13 (Mmp13), confirmant que les chondrocytes isolés répondent aux stimuli inflammatoires. Par rapport aux méthodes conventionnelles, ce protocole utilise une concentration de collagénase plus élevée pour réduire l’impact d’un temps d’isolement prolongé sur la viabilité cellulaire, tout en évitant les dommages cellulaires potentiels causés par le traitement à la trypsine. Les chondrocytes primaires obtenus sont purs et viables, adaptés à des études approfondies sur les mécanismes liés aux lésions du cartilage, ce qui a des implications importantes pour la recherche in vitro et le traitement clinique des maladies du cartilage.
La destruction du cartilage articulaire est une cause majeure de diverses maladies du cartilage, telles que l’arthrose et la RA 1,2. Les chondrocytes, le type de cellule prédominant dans le cartilage, sont essentiels pour maintenir l’homéostasie et faciliter la réparation en réponse à une lésion3. Les altérations de l’activité des chondrocytes affectent non seulement l’intégrité structurelle du cartilage, mais induisent également des réponses inflammatoires et une dégénérescence progressive des tissus4. Par conséquent, une étude ....
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Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’hôpital Xi’an Honghui (n° 202309009), et les procédures expérimentales ont strictement adhéré aux principes des 3R de remplacement, de réduction et de raffinement pour l’expérimentation animale.
La figure 1A illustre un schéma de principe de la préparation des réactifs et de l’équipement. La table des matières comprend des informations sur les réactifs et l’équipement utilisés dans ce protocole.
1. Souris expérimentales
REMARQUE : Quatre s....
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Comme décrit dans les figures 1, 2 et 3, nous avons exécuté le protocole et réussi à isoler les chondrocytes primaires des articulations du genou de souris. À partir d’environ 10 mg de cartilage de souris néonatale, nous avons obtenu environ 1 × 104 cellules avec une viabilité de >90 %. Le premier jour de la culture in vitro , les chondrocytes primaires de souris présentaient une morphologie a.......
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L’isolement et la culture de chondrocytes primaires sont essentiels pour élucider la physiopathologie des maladies du cartilage22. Dans la culture primaire de chondrocytes, l’optimisation de la concentration de la collagénase et du temps de digestion est cruciale, car elle équilibre la dégradation de la matrice extracellulaire tout en réduisant les dommages cellulaires potentiels17. Nous décrivons ici une méthode fiable et reproductible pour isoler les chondrocytes primaire.......
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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82370909). Les figures 1, 2 et 3 ont été créées avec Figdraw.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1& fois ; Poudre PBS (2 L) | Servicebio | G0002-2L | |
| Boîtes de culture cellulaire de 100 mm | Servicebio | CCD-100 | |
| 100 &mu ; Tamis à cellules M | Sangon Biotech | F613463-0001 | |
| Tube à centrifuger conique de 15 ml (stérile, sans enzyme) | Servicebio | EP-1501-J | |
| Tube de centrifugation conique de 50 ml (stérile, sans enzymes) | Servicebio | EP-5001-J | |
| Plaque de culture cellulaire à 6 puits | Servicebio | CCP-6H ; | |
| Anticorps polyclonal anti-COL2A1 de lapin | Voie immunitaire | YT1022 | anticorps primaires ; Indice de la balance bal : 1/500 |
| Anticorps monoclonal anti-GAPDH de souris | Proteintech | Référence 60004-1-IG | anticorps primaires ; Banque mondiale : 1/2000 |
| Anticorps polyclonal de lapin anti-MMP13 ; | Voie immunitaire | YT2796 | anticorps primaires ; WB : 1/1000 |
| Banc aseptique ultra-propre | Thermo Fisher | 51029704 | |
| Incubateur de culture cellulaire | Thermo Fisher | 51033782 | |
| Collagénase II | Solarbio | Réf. C8150 | |
| Amorces personnalisées (Gapdh, Col2a1, Mmp13) ; | Sangon Biotech | Conçu à l’aide de Primer BLAST | |
| DMEM/F12 moyen | Hyclone | SH30023.01 | |
| Sérum fœtal bovin | ExCell | FCS500 | |
| Anticorps polyclonal anti-souris HRP-Goat | Voie immunitaire | Réf. RS0001 | anticorps secondaires ; WB : 1/10000 ; |
| Anticorps polyclonal anti-lapin HRP-Goat ; | Voie immunitaire | Réf. RS0002 | anticorps secondaires ; Balance des blancs : 1/10000 |
| Microscope à contraste de phase inversé | OLYMPE | CKX53 | |
| Micropipette | Thermo Fisher | ||
| Centrifugeuse de paillasse miniature | SUNNE | SN-TDL-6 | |
| Lame chirurgicale n° 11 | Servicebio | QXJZ-11 | |
| Solution de pénicilline-streptomycine (100X) | Beyotime | Réf. C0222 | |
| Ensemble d’instruments de dissection pour petits animaux | Servicebio | QXTZ01 |
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