Ce protocole permet d’isoler suffisamment de chondrocytes primaires en 6 à 8 heures, ce qui facilite des investigations plus approfondies de la biologie du cartilage et des mécanismes de la maladie du cartilage.
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Article de méthode
Isolement et culture in vitro de chondrocytes primaires de souris pour la biologie du cartilage
Dans cet article
Résumé
Résumé
La destruction du cartilage articulaire entraîne une altération de l’activité des chondrocytes, qui est un facteur causal majeur dans diverses maladies du cartilage, notamment l’arthrose et la polyarthrite rhumatoïde. En tant que type de cellule le plus abondant dans le cartilage, une étude approfondie des propriétés biologiques des chondrocytes est essentielle pour le développement de stratégies efficaces de traitement des maladies. L’isolement et la culture de chondrocytes primaires fournissent des matériaux expérimentaux importants pour l’étude des maladies du cartilage et contribuent à démêler les mécanismes de lésion et de réparation du cartilage. Ce protocole fournit une description détaillée des méthodes d’isolement et de culture in vitro des chondrocytes primaires dérivés de souris. En utilisant le protocole optimisé de la collagénase II, l’isolement des chondrocytes peut être terminé en 8 heures pour les échantillons de cartilage de l’articulation du genou de souris néonatale. Le rendement cellulaire est d’environ 1-2 × 10³ cellules/mg de tissu cartilagineux, variant avec la fraîcheur des tissus et la densité cellulaire initiale ; Les cellules isolées présentent une viabilité de >90 %. Ce protocole utilise des chondrocytes primaires de souris comme exemple, montrant les caractéristiques morphologiques et l’état d’adhésion des cellules cultivées pendant 1, 2 et 5 jours après l’isolement. L’amplification en chaîne quantitative par polymérase par transcription inverse (RT-qPCR) et le western blot ont montré que le traitement à l’interleukine-1β (IL-1β) réduisait le collagène de type II alpha 1 (Col2a1) et augmentait l’expression de la métallopeptidase matricielle 13 (Mmp13), confirmant que les chondrocytes isolés répondent aux stimuli inflammatoires. Par rapport aux méthodes conventionnelles, ce protocole utilise une concentration de collagénase plus élevée pour réduire l’impact d’un temps d’isolement prolongé sur la viabilité cellulaire, tout en évitant les dommages cellulaires potentiels causés par le traitement à la trypsine. Les chondrocytes primaires obtenus sont purs et viables, adaptés à des études approfondies sur les mécanismes liés aux lésions du cartilage, ce qui a des implications importantes pour la recherche in vitro et le traitement clinique des maladies du cartilage.
Introduction
La destruction du cartilage articulaire est une cause majeure de diverses maladies du cartilage, telles que l’arthrose et la RA 1,2. Les chondrocytes, le type de cellule prédominant dans le cartilage, sont essentiels pour maintenir l’homéostasie et faciliter la réparation en réponse à une lésion3. Les altérations de l’activité des chondrocytes affectent non seulement l’intégrité structurelle du cartilage, mais induisent également des réponses inflammatoires et une dégénérescence progressive des tissus4. Par conséquent, une étude approfondie des propriétés biologiques des chondrocytes est cruciale pour élucider l’étiopathogénie de ces maladies.
Ces dernières années, le rôle des chondrocytes dans les réponses inflammatoires a fait l’objet d’une attention croissante. Des études ont montré que les cytokines inflammatoires, telles que l’IL-1β et le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), compromettent considérablement les processus métaboliques des chondrocytes, entraînant une augmentation de l’expression des enzymes dégradant la matrice et une diminution de la synthèse matricielle5,6,7. Ces changements conduisent finalement à la dégénérescence progressive du cartilage et à la dysfonction articulaire. Par conséquent, l’étude des altérations biologiques des chondrocytes dans des conditions pathologiques au sein de modèles in vitro est devenue particulièrement impérative. S’appuyant sur la culture monocouche bidimensionnelle (2D) traditionnelle, les progrès récents de la culture tridimensionnelle (3D) de chondrocytes et des technologies organoïdes ont été de plus en plus adoptés dans la recherche liée au cartilage. Ces systèmes raffinés offrent un microenvironnement plus pertinent sur le plan physiologique et fournissent des informations précieuses sur le comportement des chondrocytes dans des contextes pathologiques8.
La sélection d’une source cellulaire détermine de manière critique si les résultats in vitro récapitulent avec précision la physiopathologie des articulations. Contrairement aux lignées de chondrocytes immortalisées ou aux explants de cartilage, les chondrocytes primaires conservent le patrimoine génétique natif, les voies de signalisation calcique mécanosensibles et la stabilité phénotypique du cartilage articulaire, présentant ainsi une capacité chondrogénique supérieure et des comportements biologiques qui reflètent plus étroitement ceux des cellules cartilagineuses résidentes9. Des différences systématiques dans les sources de signalisation calcique et les canaux ioniques clés et les voies en aval ont été documentées entre les chondrocytes primaires et la lignée cellulaire ATDC510. Par conséquent, lors de l’étude de la physiologie ou de la pathologie articulaire, les chondrocytes primaires doivent être prioritaires. Par conséquent, l’optimisation de l’isolement et de la culture des chondrocytes primaires est essentielle pour modéliser avec précision la biologie liée à la maladie et explorer des médicaments thérapeutiques potentiels 11,12,13,14,15. Néanmoins, les méthodes existantes compromettent la viabilité cellulaire ou l’intégrité phénotypique en raison d’une digestion prolongée16,17.
Ici, nous décrivons un protocole pour l’isolement et la culture in vitro de chondrocytes primaires dérivés du tissu cartilagineux de souris, qui produit rapidement suffisamment de cellules. Par rapport aux protocoles conventionnels de digestion prolongée à faible concentration d’enzymes, cette étude a optimisé les conditions de digestion enzymatique et les étapes de prétraitement des tissus. Cette optimisation a considérablement réduit le temps de digestion à 6-8 h tout en évitant les dommages cellulaires potentiels causés par le traitement à la trypsine15,17. En utilisant cette méthode, environ 1-2 × 103 chondrocytes peuvent être obtenus à partir de chaque mg de tissu cartilagineux de souris. Ce protocole offre un guide fiable pour l’isolement et la culture de chondrocytes primaires in vitro, fournissant un modèle robuste pour les études sur les maladies du cartilage.
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’hôpital Xi’an Honghui (n° 202309009), et les procédures expérimentales ont strictement adhéré aux principes des 3R de remplacement, de réduction et de raffinement pour l’expérimentation animale.
La figure 1A illustre un schéma de principe de la préparation des réactifs et de l’équipement. La table des matières comprend des informations sur les réactifs et l’équipement utilisés dans ce protocole.
1. Souris expérimentales
REMARQUE : Quatre souris C57BL/6J de type sauvage âgées de 3 jours ont été utilisées dans cette étude.
- Maintenez les cages à une température constante de 25 °C ± 2 °C et à un taux d’humidité de 50 % à 60 %, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h. Fournir à volonté un régime stérile de souris exempt d’agents pathogènes spécifiques (stérilisé par irradiation à 60Co) et de l’eau stérile à volonté.
- Prélever le cartilage de l’articulation du genou (~10 mg/souris) de quatre souris âgées de 3 jours post mortem pour isoler les chondrocytes primaires.
2. Collecte et traitement des échantillons de cartilage
- Traitement de la souris et dissection tissulaire
- Euthanasier les souris néonatales dans les 3 jours suivant la naissance. Stérilisez la surface du corps en l’essuyant avec de l’alcool médical à 75 %.
- Isolez les articulations du genou de la souris à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles. Placez-les dans du PBS stérile 1x.
- Excise soigneusement les muscles, les os, la synoviale et les autres tissus conjonctifs prolifératifs entourant l’articulation du genou à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles. Ne conservez que le tissu cartilagineux de l’articulation du genou.
- Rincez les échantillons de tissu 3 fois avec du PBS stérile 1x. Jetez le liquide.
REMARQUE : La figure 1B illustre un schéma simplifié de l’acquisition et du prétraitement des tissus cartilagineux.
Figure 1 : Flux de travail simplifié pour la préparation des matériaux et le traitement des échantillons de cartilage. (A) Schéma de principe de la configuration des réactifs et des équipements, y compris les réactifs, les consommables et les principaux instruments. (B) Protocole étape par étape pour le traitement des tissus cartilagineux des articulations du genou de souris. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Isolement et culture de chondrocytes primaires
- Transférez le tissu cartilagineux isolé dans une nouvelle plaque de culture cellulaire à 6 puits. À l’aide d’une lame chirurgicale stérile n° 11, hachez le tissu en petits morceaux d’environ 0,25 mm3 . Rincer une fois avec du PBS stérile pré-réfrigéré. Jetez le liquide.
- Ajouter 2 mL de solution de digestion préchauffée (37 °C) contenant de la collagénase II à haute concentration (25 mg/mL, dissoute dans un milieu basal stérile Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12]) pour couvrir le bloc tissulaire.
- Incuber la plaque de culture cellulaire dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 15 min pour une digestion enzymatique. Après l’incubation, jetez le liquide.
- Répétez les étapes 3.2 et 3.3.
REMARQUE : La digestion enzymatique à haute concentration est une étape préliminaire. Il vise à prédigérer le tissu, à décomposer partiellement sa structure pour une meilleure digestion ultérieure et à éliminer les adhérences matricielles qui peuvent exister en raison de la coupe de la périphérie du tissu. - Ajouter 2 mL de solution de digestion préchauffée (37 °C) contenant de la collagénase II à faible concentration (5 mg/mL, dissoute dans un milieu basal stérile DMEM/F12) pour couvrir le bloc tissulaire.
- Incuber la plaque de culture cellulaire dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 6 à 8 h pour la digestion et observer la progression de la séparation cellulaire. Effectuez occasionnellement une agitation horizontale lente (80-120 tr/min) ou un pipetage doux pour améliorer l’efficacité de la lyse.
REMARQUE : Pour les tissus de souris nouveau-nés, la libération cellulaire est visible vers 3 h, avec une isolation complète réalisable entre 6 et 8 h. Pendant le traitement de 6 à 8 h de collagénase II, observez la lyse toutes les heures et terminez la digestion lorsqu’aucun morceau de tissu évident n’est visible à l’œil nu et que 90 % des cellules sont libres et en suspension au microscope. Au cours du processus de digestion, on peut observer que des chondrocytes de type vacuole se détachent progressivement de la masse de tissu cartilagineux au microscope optique. Cette étape peut être répétée plusieurs fois pour minimiser les dommages aux chondrocytes causés par une digestion prolongée, et la solution de digestion peut être remplacée par une solution fraîche de digestion de la collagénase II à faible concentration pour augmenter le rendement cellulaire. - Filtrer tous les produits de digestion à travers une crépine cellulaire de 100 μm dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL.
REMARQUE : Utilisez une crépine cellulaire de 100 μm pour éviter la perte d’agrégats de chondrocytes et augmenter le rendement. Les fragments de tissu résiduels sont éliminés lors de l’échange de fluide. - Rincez la plaque de culture cellulaire avec du PBS stérile. Filtrez à nouveau à travers la crépine de la cellule.
- Prélever tous les filtrats de l’étape précédente dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante avec le frein desserré. Jeter le surnageant après la centrifugation.
- Ajouter 2 mL de PBS 1x stérile et remettre doucement le précipité en suspension en soufflant légèrement et en aspirant avec une pipette. Transférer dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante avec le frein desserré. Jeter le surnageant après la centrifugation.
- Remettre en suspension le précipité à partir de l’étape 4.10 avec 2 mL de milieu complet DMEM/F12 stérile fraîchement préparé, qui contient 15 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de P/S. Énumérer la suspension cellulaire récoltée à l’aide d’un hémocytomètre, puis plaquer les cellules dans une boîte de culture stérile de 10 cm à 2-2,5 × 105 cellules/cm2. Compléter à un volume final de 10 mL avec un milieu complet.
REMARQUE : La densité d’ensemencement des chondrocytes doit être de 2-2,5 × 105 cellules / cm2, car l’ensemencement de faible ou moyenne densité peut entraîner un déplacement phénotypique des chondrocytes articulaires vers les fibroblastes. L’activité de prolifération et la viabilité des cellules primaires isolées peuvent être évaluées à l’aide de tests MTT facultatifs ou d’une coloration d’exclusion au bleu de trypan (étape facultative). - Incuber dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C.
- Remplacer par un milieu complet DMEM/F12 frais (contenant 10 % de FBS, 1 % de P/S) après avoir observé que les cellules adhèrent complètement à la paroi au microscope optique.
- Changez de support tous les 2 jours. Poursuivre l’élevage jusqu’à ce que la confluence atteigne 70 %, après quoi d’autres expériences peuvent être effectuées.
REMARQUE : La concentration sérique dans le milieu de culture peut être augmentée à 15 % en fonction de l’état cellulaire. La figure 2 illustre un schéma simplifié de la digestion, de l’isolement et de la culture des tissus cartilagineux des cellules primaires.
Figure 2 : Procédure simplifiée pour la digestion des tissus cartilagineux, l’isolement des cellules primaires et la culture. Le cartilage a été haché et digéré en continu avec une solution de digestion de collagénase II à haute concentration pendant 15 min, répété une fois, puis digéré avec une solution de digestion de collagénase II à faible concentration pendant 6 à 8 h pour isoler les cellules. Le tissu digéré a ensuite été filtré, puis le filtrat a été recueilli et centrifugé. La pastille cellulaire a été lavée avec 1x PBS et cultivée dans un milieu DMEM/F12 jusqu’à ce que la confluence atteigne 70 %, moment auquel les cellules étaient prêtes pour les expériences ultérieures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Vérification fonctionnelle des chondrocytes primaires
- Métabolisme et modifications des chondrocytes dans des conditions inflammatoires.
- Traitez les cellules avec 10 ng/mL d’IL-1β pendant 24 h pour simuler des états inflammatoires.
- Pour la RT-qPCR et le western blot, extraire l’ARN total ou la protéine totale pour détecter les indicateurs métaboliques de la matrice extracellulaire des chondrocytes, tels que COL2A1, MMP13.
REMARQUE : La figure 3 illustre un schéma de principe de la validation fonctionnelle des chondrocytes primaires et des procédures expérimentales ultérieures. Les informations sur les anticorps sont fournies dans la table des matières. Les procédures détaillées pour le transfert Western et la RT-qPCR sont fournies dans les tableaux 1, 2, 3, 4 et 5. Toutes les méthodes ont suivi les protocoles standard11,18.
Figure 3 : Schéma de principe du programme de validation fonctionnelle des chondrocytes primaires. Affections inflammatoires induites par le traitement par l’IL-1β ; effets sur les phénotypes associés au cartilage évalués par RT-qPCR et Western blot. Abréviations : IL-1β = interleukine-1β ; RT-qPCR = Réaction en chaîne quantitative par polymérase à transcription inverse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Conditions de flux de travail Western Blot | |
| Pas | Condition / Réactif |
| Préparation du gel SDS-PAGE | 8 % (p/v) de gel séparateur Tris-HCl |
| Électrophorèse par empilement | 80 V, 30 à 40 min |
| Résolution de l’électrophorèse | 120 V, 1 à 1,5 h |
| Transfert | Semi-sec, 15 V, 30 à 60 min |
| Bloquant | Tampon de blocage rapide, 2 h à température ambiante |
Tableau 1 : Conditions de flux de travail du transfert Western. Résumé des conditions de transfert Western, y compris la composition de SDS-PAGE, les paramètres d’électrophorèse, les paramètres de transfert et la procédure de blocage.
| Mélange de réaction de transcription inverse | |
| Composant | Volume (μL) |
| 5× Tampon de réaction de transcriptase inverse du transcripteur | 4 |
| Mélange de désoxynucléotides (10 mM chacun) | 2 |
| Inhibiteur protecteur de la RNase (40 U/μL) | 0.5 |
| Transcripteur Transcriptase inverse (20 U/μL) | 0.5 |
| Eau sans nucléases | à 20 |
| Volume total | 20 |
Tableau 2 : Mélange de réaction de transcription inverse. Composition de réaction de transcription inverse pour la synthèse de l’ADNc.
| Informations sur l’amorce de la RT-qPCR du chondrocyte primaire de souris | ||||
| Nom du gène | Séquence(5'3 ') | Température de recuit (°C) | ||
| mGapdh | En avant | TGGCCTTCCGTGTTCCTAC | 60 | |
| Inverse | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 | En avant | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| Inverse | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| mMmp13 | En avant | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC | 60 | |
| Inverse | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
Tableau 3 : Informations sur l’amorce de la RT-qPCR du chondrocyte primaire de souris. Séquences et température de recuit (60 °C) des amorces utilisées pour quantifier les transcrits Gapdh, Col2a1 et Mmp13 dans les chondrocytes primaires de souris.
| Mélange réactionnel RT-qPCR | |
| Composant | Volume (μL) |
| 2 × SYBR Green qPCR Master Mix | 10 |
| Matrice d’ADNc diluée | 8 |
| Amorce avant (10 μM) | 1 |
| Amorce inversée (10 μM) | 1 |
| Volume total | 20 |
Tableau 4 : Mélange réactionnel RT-qPCR. Mélange réactionnel RT-qPCR (20 μL) avec mélange maître, matrice et amorces SYBR Green.
| Protocole de cyclage RT-qPCR | ||
| Pas | Température (°C) | Heure |
| Dénaturation initiale (×1) | 95 | Durée : 10 minutes |
| Dénaturation (×40) | 95 | 5 secondes |
| Recuit/extension (×40) | 60 | 15 s |
| Rallonge (×40) | 72 | 30 secondes |
| Courbe de fusion (×1) | 95 55 95 | 60 s 30 s 30 s |
Tableau 5 : Protocole de cyclage RT-qPCR. La dénaturation à 95 °C pendant 5 s, le recuit/extension à 60 °C pendant 15 s et une analyse finale de la courbe de fusion ont été effectués pendant 40 cycles.
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Résultats
Comme décrit dans les figures 1, 2 et 3, nous avons exécuté le protocole et réussi à isoler les chondrocytes primaires des articulations du genou de souris. À partir d’environ 10 mg de cartilage de souris néonatale, nous avons obtenu environ 1 × 104 cellules avec une viabilité de >90 %. Le premier jour de la culture in vitro , les chondrocytes primaires de souris présentaient une morphologie a...
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Discussion
L’isolement et la culture de chondrocytes primaires sont essentiels pour élucider la physiopathologie des maladies du cartilage22. Dans la culture primaire de chondrocytes, l’optimisation de la concentration de la collagénase et du temps de digestion est cruciale, car elle équilibre la dégradation de la matrice extracellulaire tout en réduisant les dommages cellulaires potentiels17. Nous décrivons ici une méthode fiable et reproductible pour isoler les chondrocytes primaire...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82370909). Les figures 1, 2 et 3 ont été créées avec Figdraw.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1& fois ; Poudre PBS (2 L) | Servicebio | G0002-2L | |
| Boîtes de culture cellulaire de 100 mm | Servicebio | CCD-100 | |
| 100 &mu ; Tamis à cellules M | Sangon Biotech | F613463-0001 | |
| Tube à centrifuger conique de 15 ml (stérile, sans enzyme) | Servicebio | EP-1501-J | |
| Tube de centrifugation conique de 50 ml (stérile, sans enzymes) | Servicebio | EP-5001-J | |
| Plaque de culture cellulaire à 6 puits | Servicebio | CCP-6H ; | |
| Anticorps polyclonal anti-COL2A1 de lapin | Voie immunitaire | YT1022 | anticorps primaires ; Indice de la balance bal : 1/500 |
| Anticorps monoclonal anti-GAPDH de souris | Proteintech | Référence 60004-1-IG | anticorps primaires ; Banque mondiale : 1/2000 |
| Anticorps polyclonal de lapin anti-MMP13 ; | Voie immunitaire | YT2796 | anticorps primaires ; WB : 1/1000 |
| Banc aseptique ultra-propre | Thermo Fisher | 51029704 | |
| Incubateur de culture cellulaire | Thermo Fisher | 51033782 | |
| Collagénase II | Solarbio | Réf. C8150 | |
| Amorces personnalisées (Gapdh, Col2a1, Mmp13) ; | Sangon Biotech | Conçu à l’aide de Primer BLAST | |
| DMEM/F12 moyen | Hyclone | SH30023.01 | |
| Sérum fœtal bovin | ExCell | FCS500 | |
| Anticorps polyclonal anti-souris HRP-Goat | Voie immunitaire | Réf. RS0001 | anticorps secondaires ; WB : 1/10000 ; |
| Anticorps polyclonal anti-lapin HRP-Goat ; | Voie immunitaire | Réf. RS0002 | anticorps secondaires ; Balance des blancs : 1/10000 |
| Microscope à contraste de phase inversé | OLYMPE | CKX53 | |
| Micropipette | Thermo Fisher | ||
| Centrifugeuse de paillasse miniature | SUNNE | SN-TDL-6 | |
| Lame chirurgicale n° 11 | Servicebio | QXJZ-11 | |
| Solution de pénicilline-streptomycine (100X) | Beyotime | Réf. C0222 | |
| Ensemble d’instruments de dissection pour petits animaux | Servicebio | QXTZ01 |
Références
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