Méthode MALDI-ToF MS pour la caractérisation de polymères synthétiques à dispersion et groupes finaux variables

Résumé

Ce protocole fournit des instructions détaillées et des exemples pour la préparation des échantillons, l’acquisition et l’analyse des données afin de caractériser des polymères synthétiques avec une dispersion et des groupes terminaux variables à l’aide de la spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice.

Résumé

La spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-ToF MS) est un outil analytique efficace pour caractériser les polymères synthétiques, offrant une détermination précise de la masse moléculaire et des informations structurelles telles que des masses unitaires répétées et l’identification du groupe final. Ce protocole détaille les étapes de l’analyse des polymères, y compris la préparation de l’échantillon avec une sélection appropriée de matrices et de cations, l’acquisition de données et une méthode d’étalonnage pour garantir des mesures de masse précises. Il met en évidence la polyvalence de MALDI-ToF MS dans l’analyse des polymères, des matériaux monodispersés aux matériaux hautement dispersés, tout en observant les limites de résolution d’échantillons hautement dispersés. En comparant les masses théoriques et observées, y compris les motifs isotopiques, la méthode permet de confirmer avec certitude les unités de répétition et les groupes finaux. Le protocole soutient les nouveaux utilisateurs en présentant des données représentatives sur la sélection de matrices, l’interprétation spectrale dans toutes les gammes de dispersion et la caractérisation de polymères présentant des caractéristiques isotopiques uniques ou des formations d’ions métastables. Les stratégies de dépannage comprennent la résolution de problèmes tels que les interférences matricielles et les échantillons qui s’ionisent sans cation ajouté lors de la préparation des échantillons. Dans l’ensemble, ce guide sert de base à l’utilisation de MALDI-ToF MS en tant que technique rapide et fiable pour l’analyse des polymères.

Introduction

La spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-ToF MS) est une technique analytique très efficace pour caractériser les polymères synthétiques 1,2,3,4. De nombreux polymères peuvent être caractérisés par résonance magnétique nucléaire (RMN) pour confirmer la structure de l’unité de répétition. Cependant, la plupart des groupes terminaux ne représentent qu’une fraction des pics d’unités répétées, même pour les polymères de faible poids moléculaire, et à mesure que le poids moléculaire d’un polymère augmente, les signaux du groupe final semblent difficiles à quantifier dans la RMN⁵. Cependant, les données MALDI-ToF MS confirment qu’il s’agit des groupes finaux, même à des poids moléculaires plus élevés. Cette technique de spectrométrie de masse est connue pour sa capacité d’ionisation douce et génère principalement des ions polymères chargés individuellement avec une fragmentation très minimale². Cela permet une détermination précise de la masse moléculaire et une analyse structurelle détaillée qui fournit des résultats rapides et précis, fournissant des informations précieuses telles que des masses unitaires répétées, des identifications de groupes terminaux et, pour les polymères à faible dispersité, la détermination de la masse moléculaire moyenne en nombre (M_n), de la masse moléculaire moyenne en nombre (M_w) et de la dispersion (Đ)⁶.

MALDI-ToF MS peut analyser des polymères avec une dispersion variable, mais présente des limites à une dispersion plus élevée. Pour les polymères monodispersés tels que les dendrimères, cette méthode est idéale pour confirmer leur masse et identifier les groupes d’extrémités⁷. Pour les polymères à faible dispersité (1,01-1,09) et certains polymères à dispersion modérée (Đ = 1,1-1,3), MALDI-ToF MS peut également être utilisé pour déterminer la masse unitaire répétée du polymère, la masse du groupe terminal, Đ, M_n et M_w⁸. Cependant, pour les polymères fortement dispersés (Đ = 1,3-10), cela devient difficile. Pour les polymères largement dispersés, les fractions inférieures présentent une intensité beaucoup plus élevée que leurs homologues de poids moléculaire plus élevé, ce qui entraîne une dispersité artificiellement plus faible que d’autres techniques de caractérisation telles que la chromatographie d’exclusion stérique (SEC). C’est ce qu’on appelle un « biais de faible masse ». La masse unitaire répétée moyenne et les groupes terminaux peuvent être confirmés à partir des résultats de masse moléculaire inférieure, mais il est impossible de déterminer les vrais M_n, M_w et Đ pour les polymères à haute dispersivité à partir de MALDI-ToF MS⁹. Par conséquent, la SEC doit être ajoutée comme technique de caractérisation des polymères largement dispersés afin de déterminer les vrais M_n, M_w et Đ.

L’optimisation de la préparation des échantillons est essentielle pour une résolution de crête de haute qualité sur un spectre de masse MALDI-ToF ^2,10. La première étape consiste à sélectionner une matrice appropriée en fonction de la polarité du polymère. Pour les polymères non polaires, des matrices telles que le trans-2-[3-tert-butylphényl)-2-méthyl-2-propénylidène] (DCTB), le radical libre galvinoxyle (DFG) et le 9-nitroanthracène (9-NA) sont couramment utilisées ¹¹. Les polymères polaires sont mieux adaptés aux matrices telles que l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA), le dithranol, l’acide 2-(4-hydroxyphénylazo)benzoïque (HABA) et l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB)12,13,14. Pour ce protocole, le DCTB a été choisi comme matrice primaire en raison de son efficacité avec les polymères non polaires, et l’HCCA a été utilisé pour les polymères polaires. La sélection cationique joue également un rôle important, car les métaux alcalins comme le sodium et le potassium ionisent efficacement les polymères contenant de l’oxygène, tandis que les métaux de transition comme l’argent sont mieux adaptés aux hydrocarbures insaturés^10,14.

Une fois la matrice et l’analyte sélectionnés, les rapports cations :analytes/matrices optimaux pour les mélanges de solutions d’échantillons sont déterminés. Ce mélange de solution d’échantillon sera ajouté à la plaque cible en une quantité de 1 μL. Le fait de ne pas avoir un ou plusieurs des rapports corrects des sélections cation :analyte :matrice peut affecter la sensibilité de l’acquisition de données MALDI-ToF MS. Pour les données représentatives ci-dessous, la préparation de l’échantillon a été optimisée pour la meilleure résolution ^2,15.

Après avoir préparé la solution d’échantillon et l’avoir ajoutée à la plaque cible MALDI-ToF MS, cet échantillon est inséré dans l’instrument MALDI-ToF MS pour commencer l’acquisition des données. Pour cette étude, les données ont été recueillies exclusivement en mode ions positifs, et un spectromètre de masse MALDI-ToF plus récent a été utilisé, en s’appuyant sur les travaux antérieurs de Payne et ^al.16. Les paramètres importants de MALDI-ToF MS, tels que la puissance laser, le diamètre du faisceau laser, le gain du détecteur et le temps de retard d’extraction pulsée, peuvent être ajustés pour améliorer la résolution lors de l’acquisition. Deux modes sont disponibles pour l’acquisition de données MALDI-ToF MS : linéaire et réflectron¹⁷. Le mode Reflectron est préféré pour obtenir une résolution de signal plus élevée par rapport au mode linéaire^18,19. En mode linéaire, les ions accélérés voyagent directement à travers le tube de vol jusqu’au détecteur. En revanche, le mode réflectron consiste à traverser une fois le tube de vol, puis à réfléchir les ions une seconde fois à travers le tube de vol avant d’atteindre le deuxième détecteur, ce qui double environ leur trajectoire de vol. Cette approche permet de différencier des ions de masses similaires mais de vitesses variables^20,21. La puissance du laser peut également être un facteur d’augmentation du rapport signal/bruit ou de diminution de la fragmentation d’un polymère²². La puissance laser la plus faible possible pour l’ablation d’un échantillon améliorera le rapport signal/bruit et réduira également la possibilité de fragmentation²². Après avoir optimisé la résolution du signal et maximisé le rapport signal/bruit, l’acquisition peut fournir des données de haute qualité pour l’analyte polymère sélectionné.

L’étalonnage est essentiel pour une mesure de masse précise dans MALDI-ToF MS. Deux méthodes principales sont utilisées : l’étalonnage interne et externe, toutes deux reposant sur des étalons dont les masses sont connues et qui couvrent^{la plage 6} attendue de l’analyte. Pour les polymères analysés dans les données représentatives, des calibrateurs de dendrimères monodispersés ont été sélectionnés pour l’étalonnage sur de larges gammes de masses²³. L’étalonnage interne, où l’étalon est mélangé avec le cation, l’analyte et la matrice, améliore la précision de la masse car l’étalon et l’analyte sont soumis aux mêmes conditions, et tout décalage de masse d’étalonnage les affecte de la même manière. Cependant, cette méthode peut conduire à un chevauchement des pics avec les signaux polymères résultants, ce qui complique l’analyse²⁴. En revanche, l’étalonnage externe, utilisé dans ce protocole, évite le chevauchement des pics en préparant et en repérant le cation :calibre :matrice séparément du cation :analyte :matrice sur la plaque cible. Cependant, des inexactitudes mineures de masse peuvent survenir en raison de légères différences dans le placement de l’échantillon et la réponse locale de l’instrument, telles que des variations de l’intensité du laser ou de l’efficacité de l’ionisation sur la cible, de sorte que l’étalon et l’analyte doivent être à proximité l’un de l’autre²⁴. Dans les données représentatives, la différence de masse observée à l’aide de la méthode d’étalonnage externe était inférieure à 0,100 Da par rapport à la valeur théorique.

Enfin, pour tous les polymères, les données MALDI-ToF MS peuvent être analysées pour déterminer la masse unitaire répétée et effectuer une analyse du groupe final des polymères. La masse unitaire répétée peut être confirmée en comparant la masse unitaire répétée théorique à l’aide d’outils logiciels à la masse unitaire répétée observée dans les spectres de masse MALDI-ToF. S’ils correspondent, le polymère est susceptible d’avoir la structure unitaire répétitive attendue (ou un isomère). L’analyse du groupe final MALDI-ToF MS pour les polymères commence par le calcul de la masse théorique de l’analyte. Cela inclut la masse combinée de l’unité de répétition, des groupes terminaux et du cation sélectionné lors de la préparation de l’échantillon. Dans le cas de macromolécules monodispersées, le calcul inclut la masse totale d’un analyte ainsi que la masse du cation sélectionné. Des outils logiciels permettant de dessiner des structures chimiques peuvent aider à ces calculs. La masse théorique du logiciel est ensuite comparée à la masse observée des spectres de masse MALDI-ToF pour vérifier si le polymère correspond à la structure moléculaire attendue. Cependant, si la masse unitaire répétée observée correspond approximativement à la valeur théorique, mais que la masse totale d’un n-mer spécifié, y compris les groupes terminaux et le cation, ne le fait pas, l’écart peut suggérer la présence de groupes terminaux inattendus. Pour identifier des groupes finaux inconnus, les conditions de réaction sont examinées afin de déterminer d’autres molécules ou réactifs qui auraient pu réagir pour former les groupes finaux observés. Cette étape est cruciale pour caractériser avec précision l’ensemble de la structure du polymère.

Ce protocole fournit une méthode étape par étape pour l’analyse MALDI-ToF MS des polymères synthétiques, conçue pour aider les utilisateurs, en particulier les débutants, dans la préparation des échantillons, l’optimisation de la méthode des instruments, l’acquisition et l’analyse des données. Des données représentatives illustrent la sélection de la matrice pour un polymère donné ; spectres et analyse de polymères à dispersion variable, y compris des échantillons monodispersés, modérément dispersés et très dispersés ; l’analyse du groupe final des polymères, qui comprend ceux qui ont des profils de résolution isotopique distincts (p. ex., halogénés) et ceux qui sont sujets à la formation d’ions métastables (p. ex., terminés par l’azide) ; l’analyse des données des polymères à l’aide de MALDI-ToF MS, qui comprend une comparaison des masses observées et théoriques pour confirmer la masse unitaire répétée et la masse totale du polymère, y compris les groupes terminaux et les adduits cationiques ; et un exemple de dépannage de l’interférence matricielle de polymères de faible masse et de polymères auto-ionisants.

Ce protocole fournit non seulement une base pour la caractérisation des polymères MALDI-ToF MS, mais offre également des conseils sur la préparation des échantillons, l’optimisation étape par étape des méthodes instrumentales (Figure 1) et l’interprétation des spectres pour les polymères synthétiques nouvellement synthétisés et commerciaux.

Protocole

ATTENTION : Passez en revue les fiches de données de sécurité (FDS) de tous les produits chimiques avant utilisation. Effectuer toutes les préparations d’échantillons et les préparations de plaques MALDI-ToF MS dans une hotte, et porter un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des lunettes de sécurité, une blouse de laboratoire et des gants.

1. Préparation de l’échantillon

1. Préparation d’une solution mère de matrice, de cation, d’étalon et d’analyte
   1. Préparez la solution mère de cations alcalins en dissolvant 2 mg du cation désiré dans 1 mL d’un solvant choisi pour sa compatibilité avec l’analyte et le cation. Pour l’échantillon 1, 2 mg de trifluoroacétate de sodium ont été dissous dans 1 mL de THF.
   2. Préparez la solution mère de la matrice en dissolvant 20 mg de la matrice désirée dans 1 mL d’un solvant compatible basé sur la solubilité de l’analyte. Exemple : Pour les données représentatives (échantillon 1), dissoudre 20 mg de DCTB dans 1 mL de tétrahydrofurane (THF).
   3. Préparez la solution mère d’étalonnage en suivant les instructions du fournisseur.
   4. Préparez la solution d’analyte en dissolvant 10 mg de l’analyte dans 1 mL d’un solvant approprié. Pour l’échantillon 1, 10 mg de l’analyte sont dissous dans 1 mL de THF.
2. Préparation de la plaque cible MALDI-ToF MS
   1. Nettoyez la plaque cible MALDI-ToF MS.
   2. Préparez l’échantillon d’acquisition d’analyte et la solution d’échantillon d’étalonnage. Ajouter les solutions mères de cations, d’analytes et de matrices dans un rapport de 1:5:20 μL dans le tube A et le vortex. Pour l’étalonnage externe : Ajouter les solutions mères de cations, d’étalonnage et de matrice dans un rapport de 1:5:20 μL dans le tube B et le vortex.
   3. Ajouter le mélange de solution d’échantillon d’analyte et d’étalon dans la plaque cible MALDI-ToF MS. Pipeter 0,5 μL du mélange de solution d’échantillon cation :analyte/matrice (tube A) sur la plaque cible MALDI-ToF MS en utilisant la méthode des gouttelettes séchées. Pipeter 0,5 μL du mélange cation :calibre :matrice (tube B) à un endroit adjacent à l’analyte sur la plaque cible MALDI-ToF MS en utilisant la méthode des gouttelettes séchées. Enregistrez l’emplacement exact de chaque point (ligne, lettre et numéro de colonne) pour localiser facilement l’échantillon et l’étalon lors de l’acquisition des données.

2. Acquisition de données

1. Insérez la plaque cible MALDI-ToF MS et sélectionnez une méthode d’acquisition
   1. Insérez la plaque cible MALDI-ToF MS dans l’instrument. Placez la plaque cible sur le support avec la bonne orientation et n’enfoncez pas la plaque cible MALDI-ToF MS trop loin.
   2. Fixez la plaque cible MALDI-ToF MS sur l’instrument à l’aide du logiciel de contrôle de l’instrument.
   3. Sélectionnez et ouvrez un fichier Method sur le logiciel de contrôle de l’instrument. Choisissez une méthode positive réflecteur (RP) ou positive linéaire (LP) dans la plage de masse de l’analyte.
   4. Surveillez le logiciel de contrôle de l’instrument pour confirmer que la plaque cible a été insérée et que la configuration de la méthode est terminée.
      REMARQUE : Ces polymères représentatifs ont des oxygènes ; Par conséquent, le mode positif est sélectionné (la plupart des composés ont une acquisition terminée en mode positif). Pour les données représentatives, une méthode RP a été choisie pour le mode réflecteur sur tous les échantillons.
2. Acquisition initiale des données
   1. Sur le logiciel de contrôle de l’instrument, localisez la caméra affichant la plaque cible MALDI-ToF MS et un schéma des puits avec les lettres des colonnes et les numéros de ligne affichés. Cliquez sur le puits MALDI-ToF MS contenant le mélange cation :analyte :matrice à sélectionner pour l’acquisition de données.
   2. Ajustez la plage de détection de masse sur le logiciel de contrôle de l’instrument sur une large plage de 500 à 20000 Da pour vous assurer que la masse attendue de l’analyte est entièrement capturée. Utilisez le curseur pour ajuster la plage environ 2x en dessous et au-dessus de la masse attendue de l’analyte après une acquisition initiale.
   3. Acquisition de données
      1. Appuyez sur le bouton Start du logiciel de contrôle de l’instrument pour commencer l’acquisition des données MALDI-ToF MS.
      2. Appuyez sur Arrêter ou laissez l’acquisition MALDI-ToF MS se terminer automatiquement.
      3. Cliquez sur Ajouter pour ajouter le spectre unique MALDI-ToF MS à la mémoire tampon de spectre.
         REMARQUE : Le tampon à spectre unique MALDI-ToF MS stocke un spectre de masse MALDI-ToF individuel, et le tampon de spectre total accumule les données de plusieurs acquisitions, augmentant ainsi l’intensité du signal.
      4. Repositionnez le laser MALDI-ToF MS en regardant le flux de la caméra et cliquez n’importe où dans le même puits sélectionné pour déplacer le laser vers une nouvelle position.
      5. Répétez les acquisitions MALDI-ToF MS pour ajouter des spectres simples MALDI-ToF MS à la mémoire tampon de somme. Répéter les étapes 2.2.3.1 à 2.2.3.4 jusqu’à ce que les résultats de l’étude MALDI-ToF MS soient satisfaisants.
      6. Évaluer le spectre de masse MALDI-ToF pour la résolution et le bruit de base. Si le spectre MALDI-ToF MS présente une résolution élevée et un bruit de base minimal, passez à l’étape d’étalonnage. Si ce n’est pas le cas, envisagez d’optimiser la méthode d’acquisition de données (par exemple, en ajustant la puissance du laser, le gain du détecteur ou les paramètres d’extraction d’ions pulsés).
3. Optimisation de l’acquisition de données (voir Graphique 1)
   1. Ajustez la puissance du laser MALDI-ToF MS, le gain du détecteur et l’extraction d’ions pulsés un par un pour améliorer la résolution et/ou réduire le bruit de fond
   2. Pour dupliquer la méthode MALDI-ToF MS, copiez et collez la méthode MALDI-ToF MS LP ou RP sous un nouveau nom. Ouvrez le fichier de méthode MALDI-ToF MS collé qui a été créé et renommez-le.
   3. Acquérir un spectre de masse MALDI-ToF initial en suivant toutes les étapes de la section 2.2 pour l’acquisition initiale des données, dans la section acquisition des données. Zoomez sur un ensemble de pics du MALDI-ToF MS avec l’intensité la plus élevée pour évaluer la résolution et le bruit de base sur le logiciel de contrôle de l’instrument.
   4. Optimisation des acquisitions
      1. Réglage de la puissance laser MALDI-ToF MS
         1. Démarrez à une faible puissance laser MALDI-ToF MS de ~ 4 % et suivez les étapes 2.2.3.1 et 2.2.3.2 pour l’acquisition initiale des données afin de démarrer et d’arrêter l’acquisition des données.
         2. Observez et comparez la résolution et le bruit de référence de la mémoire tampon simple MALDI-ToF MS et le spectre initial de la mémoire tampon de somme.
         3. Augmentez la puissance du laser MALDI-ToF MS par incréments de 2 à 10 % pour améliorer l’ionisation. Suivez les étapes 2.2.3.1 et 2.2.3.2 pour que l’acquisition de données initiale démarre et arrête l’acquisition de données après chaque incrément.
         4. Sélectionnez la puissance laser la plus faible qui fournira des pics de haute intensité avec un minimum de bruit.
            REMARQUE : Lorsque la puissance laser MALDI-ToF MS est de 50 % et plus, il existe une possibilité accrue de fragmentation de l’échantillon.
      2. Optimiser le diamètre du laser MALDI-ToF MS
         1. Dans l’onglet du détecteur, ajustez le diamètre du laser MALDI-ToF MS pour tester les paramètres moyens, grands et ultra. Suivez les étapes 2.2.3.1 et 2.2.3.2 pour que l’acquisition de données initiale démarre et arrête l’acquisition de données.
         2. Observez et comparez la résolution et le bruit de référence de la mémoire tampon simple MALDI-ToF MS et le spectre initial de la mémoire tampon de somme.
         3. Sélectionnez le diamètre laser MALDI-ToF MS qui offre une résolution optimale avec un bruit de base minimal.
            REMARQUE : Le diamètre du laser MALDI-ToF MS contrôle le diamètre du faisceau laser.
      3. Réglage du gain du détecteur MALDI-ToF MS
         1. Par petits incréments, augmentez ou diminuez le gain du détecteur MALDI-ToF MS. Suivez les étapes 2.2.3.1 et 2.2.3.2 pour que l’acquisition initiale des données démarre et arrête l’acquisition des données à chaque augmentation ou diminution du gain du détecteur MALDI-ToF MS.
         2. Observez l’intensité et la résolution du signal des spectres de masse MALDI-ToF sur le logiciel de contrôle de l’instrument à chaque réglage du tampon unique MALDI-ToF MS et du spectre initial dans le tampon de somme.
         3. Conservez le gain du détecteur MALDI-ToF MS qui offre la meilleure intensité et une bonne résolution du signal.
      4. Modifier l’extraction d’ions pulsés MALDI-ToF MS
         1. Ajustez l’extraction d’ions pulsés MALDI-ToF MS par incréments de 10 ns. Suivez les étapes 2.2.3.1 et 2.2.3.2 pour que l’acquisition initiale des données démarre et arrête l’acquisition des données, pour chaque augmentation ou diminution du gain du détecteur.
         2. Évaluez comment les modifications de l’extraction d’ions pulsés améliorent la résolution du signal MALDI-ToF MS.
            REMARQUE : L’extraction d’ions pulsés MALDI-ToF MS est définie comme un délai entre l’ionisation laser. En augmentant ou en diminuant l’extraction d’ions par impulsion, les ions d’énergies différentes resteront dans le champ électrique pendant des périodes plus ou moins longues. Le temps plus long peut permettre aux analytes de même masse et aux ions chargés positivement qui s’ablation à des moments légèrement différents d’accélérer complètement à la même vitesse que les ions analytes de même masse lorsque la tension est appliquée. Cela peut être utilisé pour augmenter la résolution et diminuer le bruit de fond du signal²⁵.
   5. Une fois que la résolution optimale et le rapport signal/bruit le plus élevé sont atteints, enregistrez le fichier de méthode MALDI-ToF MS optimisé pour une utilisation actuelle et future.
4. Étalonnage MALDI-ToF MS
   1. Acquérez le spectre de masse MALDI-ToF d’étalonnage en sélectionnant l’échantillon d’étalonnage sur la plaque cible et en suivant toutes les étapes de la section 2.2 pour l’acquisition initiale des données
      1. Accédez aux points de référence d’étalonnage. Accédez à l’onglet d’étalonnage dans le logiciel de contrôle de l’instrument. Ouvrez la liste de contrôle de masse appropriée correspondant à l’étalon utilisé.
   2. Faites correspondre les pics d’étalonnage du spectre de masse MALDI-ToF avec les masses de référence dans la liste de contrôle de masse.
      1. Dans la liste de contrôle de masse, sélectionnez la masse correspondant au premier pic d’étalonnage dans le spectre de masse MALDI-ToF. Le spectre de masse MALDI-ToF zoomera automatiquement sur le pic d’étalonnage sélectionné.
      2. Réglez le pic de référence en cliquant à gauche du signal d’étalonnage. Le sommet sera sélectionné.
      3. Sélectionnez Appliquer pour définir le signal d’étalonnage comme masse de référence dans la liste de contrôle de masse.
      4. Répétez ce processus pour tous les pics d’étalonnage supplémentaires. Sélectionnez la masse d’intérêt suivante dans la liste de contrôle de masse, alignez le pic d’étalonnage correspondant et appliquez le paramètre de référence.
5. Acquisition d’échantillons d’analytes polymères calibrés
   1. Localisez et sélectionnez le puits contenant le puits de mélange cation :analyte :matrice sur le logiciel de contrôle de l’instrument.
   2. Effectuez l’acquisition des données en suivant toutes les étapes de la section 2.2 avec la méthode optimisée et calibrée ouverte.
   3. Ajoutez un nom de fichier approprié et enregistrez le spectre de masse de l’analyte calibré MALDI-ToF pour une analyse plus approfondie.
6. Retirez la plaque cible MALDI-ToF MS à l’aide du logiciel de contrôle de l’instrument. Nettoyer la plaque cible MALDI-ToF MS

Figure 1 : Arbre de décision pour l’optimisation de la méthode de l’instrument. Ce guide est conçu pour aider les utilisateurs débutants à optimiser systématiquement les paramètres de la méthode de l’instrument. Commencez par les paramètres par défaut ou initiaux et ajustez un paramètre à la fois en augmentant ou en diminuant en fonction des améliorations observées. Ensuite, continuez dans la direction qui améliore (1) l’intensité du pic, (2) la qualité de base (faible bruit) et (3) fournit une résolution de pic et isotopique étroite. Cette approche permet d’identifier les conditions optimales pour des spectres fiables et de haute qualité. Si l’échantillon de polymère ne s’ionise pas ou ne produit pas de spectre utilisable en mode réflecteur, passez en mode linéaire et utilisez ce même arbre de décision pour optimiser les paramètres. Notez que le mode linéaire entraîne souvent des pics plus larges et une résolution isotopique limitée ou nulle, mais il peut être efficace pour les polymères de masse plus élevée ou les polymères qui peuvent perdre de l’ionisation en mode réflecteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Analyse et interprétation des données

1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données MALDI-ToF MS et chargez le spectre d’échantillons d’analytes MALDI-ToF MS.
2. Sélectionnez la méthode de traitement MALDI-ToF MS appropriée pour les échantillons d’analytes. Ici, tous les échantillons avaient une résolution isotopique, et le premier pic a été sélectionné pour tous les pics avec la méthode de traitement MALDI-ToF MS sélectionnée.
   REMARQUE : Les paramètres de traitement MALDI-ToF MS peuvent être adaptés aux échantillons de polymères synthétiques. Par exemple, une méthode de traitement MALDI-ToF MS pour les polymères a été développée lors d’une session de formation technique par un technicien d’instruments MALDI-ToF MS. Une méthode de traitement de masse moyenne MALDI-ToF MS a été créée par Payne et al. pour des applications spécifiques¹⁶. Contactez l’équipe technique polymère du fabricant MALDI-ToF MS pour obtenir des informations et des conseils sur l’édition de la méthode de traitement MALDI-ToF MS.
3. Trouvez des pics à l’aide du logiciel d’analyse MALDI-ToF MS.
4. Comparer la masse théorique et expérimentale du polymère
   1. Enregistrez la masse théorique du polymère. Dessinez la structure attendue de la macromolécule, y compris le cation, dans un logiciel de dessin chimique. Ouvrez la fenêtre d’analyse dans le logiciel de dessin chimique et enregistrez la masse théorique.
      1. Macromolécules monodispersées : Enregistrez la masse exacte et le poids moléculaire de la macromolécule en sélectionnant la structure et le cation ensemble.
      2. Polymères faiblement, modérément et fortement dispersés : pour la masse unitaire répétée, sélectionnez le squelette polymère uniquement pour enregistrer la masse unitaire répétée. Pour la masse totale d’un n-mer spécifié, définissez le numéro d’unité de répétition sur une masse comprise dans la plage de spectre MALDI-ToF MS affichée dans le logiciel d’analyse MALDI-ToF MS. Sélectionnez l’ensemble de la structure du polymère, y compris le cation et les groupes terminaux, pour enregistrer la masse d’un n-mer spécifié.
   2. Comparer la masse théorique enregistrée avec la masse observée du spectre MALDI-ToF MS
      1. Pour calculer la masse totale des macromolécules monodispersées, suivez les étapes décrites ci-dessous.
         1. Zoomez sur le pic avec l’intensité la plus élevée sur le spectre MALDI-ToF MS, en vous assurant que la vue comprend une plage de masse d’au moins 2x en dessous et au-dessus de la masse théorique.
         2. Comparez la masse théorique avec la masse observée dans le spectre de masse MALDI-ToF. Si la différence est inférieure à 0,100 Da, la masse attendue de la macromolécule monodispersée est probablement précise.
         3. Examinez le spectre MALDI-ToF MS à la recherche de pics supplémentaires qui pourraient indiquer la présence de structures inattendues.
         4. Si des écarts sont détectés, évaluez les variations structurelles potentielles. Examinez le schéma de réaction et calculez les masses des structures alternatives à des fins de comparaison.
      2. Pour répéter le calcul de la masse unitaire des polymères faiblement, modérément et fortement dispersés, suivez les étapes décrites ci-dessous.
         1. Sélectionnez et zoomez sur deux pics séparés par l’unité de masse répétée dans le spectre MALDI-ToF MS qui présentent l’intensité la plus élevée.
         2. Pour chaque paire de pics adjacents, soustrayez la masse observée du pic de masse le plus élevé du pic de masse le plus bas pour calculer la masse unitaire de répétition. Répétez ce processus pour la prochaine série de pics afin de confirmer la consistance de la masse unitaire répétée.
         3. Comparez la masse unitaire répétée calculée avec la masse unitaire répétée théorique. Si les valeurs observées et théoriques correspondent et présentent des différences de masse constantes, la masse unitaire répétée du polymère est probablement correcte.
      3. Pour la masse totale d’un n-mer spécifié de polymères faiblement, modérément et fortement dispersés, suivez les étapes décrites ci-dessous.
         1. Zoomez sur le pic sur le spectre de masse MALDI-ToF correspondant à la masse totale théorique, ainsi que sur les pics d’une unité de répétition au-dessus et en dessous.
         2. Comparez la masse théorique avec la masse observée dans le spectre de masse MALDI-ToF. Si la différence est inférieure à 0,100 Da, les groupes finaux attendus sont probablement précis.
         3. Inspectez le spectre de masse MALDI-ToF à la recherche de pics supplémentaires qui pourraient suggérer des structures inattendues.
         4. Si des écarts sont identifiés, évaluez d’autres groupes d’extrémité ou des variations structurelles. Examinez le schéma de réaction et calculez les masses pour d’autres groupes finaux ou structures cycliques alternatifs.

Résultats

Echantillon 1 : Tris[G1](OH)₆ monodispersé
La génération 1 d’un dendrimère monodispersé constitué d’un noyau de 1,1,1-tris(hydroxyméthyl)propane avec trois acides bis(hydroxyméthyl)propioniques protégés par du benzylidène à la périphérie (Tris[G1]Bnz₃) a réagi avec des gaz/C et_H2 dans du méthanol :chloroforme 1:1 pour éliminer les groupes benzylidène et a abouti à un dendrimère avec 6 groupes hydroxyles pour former Tris[G1](OH)₆ (Figure 2A).

Tris[G1](OH)₆ a été analysé à l’aide du NaTFA comme agent cationique et de l’HCCA comme matrice. CHCA a été utilisé parce qu’il est très efficace avec les composés polaires et qu’il interagit avec les groupes hydroxyles de Tris[G1](OH)₆ pour fournir une couche homogène sur la plaque cible. La préparation de l’échantillon MALDI-ToF MS a commencé par la préparation de solutions mères de NaTFA (1 mg/mL dans le THF), de l’analyte (5 mg/mL dans le THF) et de CHCA (5 mg/mL dans le THF). Une fois ces solutions préparées, 1 μL de la solution cationique Na⁺ , 5 μL de la solution d’analyte et 20 μL de la solution matricielle ont été combinés dans un tube de microcentrifugation et vortex (rapport cation :25:100 cation :analyte :matrice pour un total de 26 mL). Ensuite, 1 μL de ce mélange a été retiré du tube de la microcentrifugeuse et séché sur la plaque cible MALDI-ToF MS. Cet échantillon a été analysé en mode réflecteur, et le pic a été confirmé dans le spectre MALDI-ToF MS en comparant les valeurs théoriques et observées (Figure 2B, rouge).

Figure 2 : (A) Schéma de réaction pour la modification de l’échantillon 1 à Tris[G1](OH)₆. Les groupes benzylidène ont été éliminés par une réaction/C et_H2 pour former Tris[G1](OH)₆. MALDI-ToF MS a été utilisé pour déterminer la complétion de la réaction. (B) les spectres de masse MALDI-ToF de l’échantillon 1, Tris[G1](OH)₆ et d’un spectre de matrice vierge superposé, qui comprenait la matrice et le sel ([CHCA + Na]⁺). Le spectre MALDI-ToF MS complet et le zoom avant de Tris[G1](OH)₆ montrent une valeur de masse observée pour [Tris[G1](OH)₆ + Na⁺]⁺ est de 505,239 Da et présente une différence de +0,013 Da par rapport à la masse théorique de 505,226 Da. En comparant le spectre de la matrice MALDI-ToF MS vierge (noir) avec le spectre MALDI-ToF MS Tris[G1](OH)₆ (rouge), tous les pics autres que 505,26 Da peuvent être ignorés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’adduit Na⁺ pour Tris[G1](OH)₆ a été observé. La valeur de masse théorique de [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ est composée de la masse du pic monoisotopique de Tris[G1](OH)₆ (482,2362 Da) plus la masse du cation sodium (22,9892 Da), ce qui donne une masse totale de 505,226 Da. La valeur de masse observée pour [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ est de 505,239 Da, ce qui correspond à la valeur théorique avec une différence de +0,013 Da.

Pour assurer l’élimination complète des trois groupes benzylidène, le spectre MALDI-ToF MS a été analysé plus en détail entre 505 et 769 Da. Cette plage de masse permet de détecter tous les groupes périphériques qui n’ont pas été détectés. Il y aurait présence d’un pic, [Tris[G1]Bnz₂(OH)₂ + Na]⁺, qui indiquerait qu’un benzylidène enlevé à 681,289 Da ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769,3194 Da - 88,0313 Da), et à 593,257 Da pic ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769,3194 Da -176,0626 Da) pour [Tris[G1]Bnz₁(OH)₄ + Na]⁺ qui indiquerait que deux groupes benzylidène ont été retirés de Tris[G1]Bnz₃ (Figure 3). Ces pics et Tris[G1]Bnz₃ ne sont pas présents ; par conséquent, la réaction est allée jusqu’au bout, et Tris[G1](OH)₆ a été synthétisé.

Figure 3 : Structures et masses théoriques de Tris[G1]Bnz₃, les intermédiaires de Tris[G1]Bnz₂(OH)₂, Tris[G1]Bnz₁(OH)₄, et l’échantillon 1 Tris[G1](OH)_6. Le point noir indique le produit. Structures et masses théoriques d’un et deux groupes benzylidène retirés et le Tris[G1](OH)₆ entièrement hydroxylé Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans la région de faible poids moléculaire inférieur à 900, plusieurs pics qui ne s’alignent pas avec la masse monodispersée de Tris[G1](OH)₆ sont présents. La plupart des matrices ont des problèmes de bruit mineurs en dessous de 1000, donc un spectre MALDI-ToF MS vierge est inclus pour confirmer que Tris[G1](OH)₆ est pur. L’échantillon à blanc de matrice comprenait les solutions mères de matrice (CHCA) et de cation (Na⁺). Les mêmes quantités du rapport de concentration cation/matrice du Tris[G1]OH₆ (1:100 mg/mL) ont été utilisées pour le mélange d’échantillons d’analyse. Ensuite, 1 μL du mélange a été ajouté à la plaque d’échantillonnage et séché pour l’analyse.

L’acquisition préliminaire des données, l’acquisition de l’étalonnage et l’acquisition des données ont été effectuées pour acquérir un spectre matriciel MALDI-ToF MS vierge. Dans la figure 2B (en noir), la matrice à blanc MALDI-ToF MS (en noir) et le spectre de l’échantillon Tris[G1](OH)₆ (en rouge) ont été superposés dans l’analyse de flexion pour comparer et confirmer quels pics ne sont pas associés au produit. Tous les pics identifiés dans le spectre vierge de la matrice MALDI-ToF MS et le Tris[G1](OH)₆ peuvent être ignorés, et par conséquent, le seul pic est 505,226 Da, ce qui correspond à l’échantillon 2. Par exemple, les pics de 445,016 Da et 656,141 Da dans le spectre MALDI-ToF MS Tris[G1](OH)₆ (Figure 2B rouge) sont également situés dans le spectre de la matrice MALDI-ToF MS vierge (Figure 2B en noir) à 445,017 Da et 656,144 Da et ont une différence de +0,001 Da et +0,003 Da, respectivement. Ces pics ne seront pas inclus dans l’analyse car ils correspondent et présentent des différences similaires à celles de la matrice vierge et du spectre MS MALDI-ToF Tris[G1](OH)₆ . Par conséquent, la masse de Tris[G1](OH)₆ est confirmée par MALDI-ToF MS, mais d’autres analyses telles que la SEC et la RMN seront nécessaires pour confirmer la pureté de l’échantillon.

Echantillon 2 : Poly(2,2-diméthylpropanoate) avec un chlorure et un groupe proton
L’acide 3-chloro-2,2-diméthylpropanoïque a été polymérisé à l’aide de carbonate de potassium comme base (figure 4A). Un échantillon de poly(2,2-diméthylpropanoate) (PDMP) avec du chlorure à une extrémité et un proton à l’autre extrémité (M_n = 980 Da) a été ionisé avec MALDI-ToF MS pour déterminer les architectures polymères formées au cours de la réaction et pour analyser les différents groupes d’extrémités. La préparation de l’échantillon MALDI-ToF MS a commencé par la préparation de solutions mères de NaTFA (2 mg/mL dans le THF), de l’analyte (5-7 mg/mL dans le THF) et de DCTB (20 mg/mL dans le THF). Une fois ces solutions réalisées, 5 μL de la solution cationique Na⁺ , 5 μL de la solution d’analyte et 10 μL de la solution matricielle ont été combinés dans un tube de microcentrifugation et vortex (rapport cation :25:200 cation :analyte :matrice pour un total de 20 mL). Ensuite, 1 μL de ce mélange a été retiré du tube de la microcentrifugeuse et séché sur la plaque cible MALDI-ToF MS. Pour la matrice, DCTB a été sélectionné car il fonctionne avec de nombreux autres polyesters, cependant, d’autres matrices telles que CHCA, HABA, GFR et DHB ont été essayées. CHCA, HABA et GFR ont bien ionisé l’échantillon, mais le DHB s’est avéré infructueux. L’ion NaTFA a mieux fonctionné que le trifluoroacétate de potassium (KTFA), le trifluoroacétate de césium (CsTFA), le trifluoroacétate de lithium (LiTFA) et le trifluoroacétate d’argent (AgTFA) car il interagit mieux avec les oxygènes des groupes esters.

Le spectre MALDI-ToF MS (figure 4B) a confirmé la distribution de la masse moléculaire du PDMP avec un groupe final chlorure pour l’échantillon 3 dans la gamme de 600 Da à 1600 Da. Cela signifie que l’échantillon présentait une faible dispersité, ce qui a conduit à des valeurs M_n, M_w et Đ de 980 Da, 1070 Da et 1,09, respectivement, à l’aide du logiciel d’analyse MALDI-Tof MS. Le pic monoisotopique a été suffisamment résolu en mode réflectron, ce qui a permis d’utiliser une identification de masse exacte.

Figure 4 : Schéma de réaction et spectre de masse MALDI-ToF MS de l’échantillon 2. (A). Schéma réactionnel pour la synthèse du PDMP à l’aide de l’acide 3-chloro-2,2-diméthylpropanoïque. (B) Spectre de masse MALDI-ToF MS de l’échantillon 2. Ce spectre MALDI-ToF MS complet montre la distribution globale de l’échantillon de PDMP avec un groupe terminal chlorure (M_n = 980 Da) ionisé avec du Na⁺. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour confirmer la masse unitaire répétée du polymère, la différence de masse entre deux pics adjacents a été calculée. L’unité de répétition du polymère a une masse moléculaire moyenne observée de 100,056 Da et cela a été confirmé en prenant la masse moyenne de huit pics (distribution principale) dans la gamme de 600 Da à 1300 Da, ce qui n’est que de +0,004 Da en dessous de l’unité de répétition théorique de PDMP (100,052 Da) et, en outre, a une masse du groupe terminal qui correspond à un hydrogène (à l’extrémité avant) et à un chlorure (à l’arrière) fin).

Le spectre MALDI-ToF MS a révélé trois distributions distinctes, chacune correspondant au polymère résultant avec des groupes d’extrémités différents. Ces groupes finaux ont été identifiés et confirmés en calculant leurs masses théoriques et en les comparant aux masses observées dans le spectre MALDI-ToF MS. Afin de mieux identifier les groupes finaux, un n-mer individuel a été sélectionné pour l’analyse (figure 5).

La distribution principale du PDMP a montré que le polymère avait un hydrogène (à l’avant) et un chlorure (à l’arrière ; bleu). La valeur de masse théorique du 8-mère du PDMP (Figure 5) est composée de la masse des unités répétées (100,0524 Da x 8) plus la masse du groupe final Cl (+ 34,9689 Da) et la masse du groupe terminal de l’hydrogène (+ 1,0078 Da) plus la masse du cation sodium (+ 22,9892 Da), ce qui donne une masse totale de 8 mères de 859,385 Da. La valeur de masse observée pour les 8-mères [H-PDMP_8-Cl + Na]⁺ est de 859,426 Da, ce qui n’est que de +0,041 Da de différence par rapport à la valeur théorique.

La distribution suivante (orange) montrait que le polymère remplaçait le proton à l’extrémité avant par un sodium et un chlorure à l’extrémité arrière. La valeur de masse théorique de la 8-mère du PDMP déprotoné est composée de la masse des unités de répétition (100,0524 Da x 8) plus la masse du groupe final Cl (+ 34,9689 Da) et la masse de deux groupes sodium (+ (22,9892 Da x 2)) ce qui donne une masse totale de 8 mères de 881,367 Da. La valeur de masse observée pour le 8-mer [Na-PDMP_8-Cl + Na]⁺ est de 881,413 Da, ce qui n’est que de +0,046 Da de différence par rapport à la valeur théorique.

Enfin, la troisième distribution (en vert) du PDMP a confirmé la présence d’espèces oligomères cycliques. La valeur de masse théorique du 8-mère du PDMP cyclique est composée de la masse des unités répétées (100,0524 Da × 8) plus la masse d’un groupe sodium (+ 22,9892 Da), ce qui donne une masse totale de 8-mères de 823,409 Da. La valeur de masse observée pour le 8-mer cyclique [PDMP8 + Na]+ est de 823,448 Da, ce qui n’est que de +0,039 Da de différence par rapport à la valeur théorique.

La présence d’halogènes sur le polymère peut être identifiée par MALDI-ToF MS. Le groupe final du polymère linéaire a un Cl, qui est indiqué par le rapport d’environ 3:1 des pics [M⁺] et [M+2]⁺ . La différence entre les pics observés et théoriques [M^+] et [M+2]⁺ a été montrée dans le tableau 1. Le pourcentage d’abondance théorique et observé pour le deuxième pic à 761,3 Da [M+2]⁺ est respectivement de 42,3 % et 42,2 % (le premier pic étant de 100 %), ce qui confirme la présence d’un groupe Cl sur le groupe final polymère. L’espèce cyclique s’est avérée être à 36 Da en dessous du composé sodié linéaire et à 58 Da en dessous du composé disodié. De plus, ce composé cyclique n’avait pas le rapport 3:1 qu’une espèce monochlorée a. Ce chlorure aurait pu être éliminé par une attaque S_N2 avec le carboxylate à l’extrémité opposée, conduisant à la fermeture du cycle.

Figure 5 : Spectre de masse MALDI-ToF MS d’une répétition individuelle de l’échantillon 2. Ce spectre MALDI-ToF MS montre le pic majeur sous forme de PDMP avec des groupes terminaux hydrogène et chlorure (M_n = 980 Da) ionisés avec du Na⁺. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Comparaison entre le pourcentage de pic d’abondance observé et théorique et l’intensité isotopique maximale des pics [M⁺] et [M+2]⁺ (avec [M⁺] = 100 %) du PDMP linéaire avec le groupe final hydrogène et chlorure (M_n = 980 Da) de MALDI-ToF MS. Le groupe final du polymère linéaire a un Cl qui est indiqué par le rapport d’environ 3:1 des pics [M⁺] et [M+2]⁺ . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Echantillon 3 : Poly(2,2-diméthylpropanoate) avec des groupes terminaux d’ammonium quaternaire et de protons.
L’acide 3-bromo-2,2-diméthylpropanoïque a été polymérisé à l’aide de triéthylamine (TEA) comme base, mais il a été déterminé que le TEA remplaçait le BR sur le groupe terminal (figure 6A). Un échantillon de PDMP avec un ammonium quaternaire d’un côté et un proton de l’autre extrémité (M_n = 1410 Da) a été utilisé pour comparer la distribution isotopique avec ceux ayant un groupe final Cl. La préparation de l’échantillon MALDI-ToF MS a commencé par la préparation de solutions mères de KTFA (2 mg/mL dans le THF), de l’analyte (5-7 mg/mL dans le THF) et de DCTB (20 mg/mL dans le THF). Une fois ces solutions réalisées, 5 μL de la solution cationique K⁺ , 5 μL de la solution d’analyte et 10 μL de la solution matricielle ont été combinés dans un tube de microcentrifugation et vortex (rapport cation :25:200 cation :analyte/matrice pour un total de 20 mL). Ensuite, 1 μL de ce mélange a été retiré du tube de la microcentrifugeuse et séché sur la plaque cible MALDI-ToF MS. Pour la matrice, DCTB a été sélectionné car il fonctionne avec de nombreux autres polyesters. Le cation potassium a été ajouté pour confirmer si l’échantillon était auto-ionisant.

Le polymère contient de l’azote quaternaire (chargé positivement) sur le groupe terminal, qui peut s’auto-ioniser. Cela a été confirmé par les spectres MALDI-ToF MS puisque le rapport masse/charge (m/z) n’a pas changé, que K⁺ ou Na⁺ ait été utilisé dans la préparation de l’échantillon. De plus, les spectres MALDI-ToF MS ont confirmé la présence d’ammonium quaternaire chargé positivement sur le groupe terminal, car Br est un bon groupe partant.

Les spectres MALDI-ToF MS ont confirmé que la distribution de la masse moléculaire du PDMP avec un groupe final d’ammonium quaternaire se situait dans la gamme de 600 Da à 2200 Da (Figure 6B). Cela signifie que l’échantillon présentait une faible dispersité, ce qui a conduit à ce que les valeurs M_n, M_w et Đ soient respectivement de 1410 Da, 1540 Da et 1,08, en utilisant le logiciel d’analyse MALDI-Tof MS.

Figure 6 : Schéma réactionnel et spectre de masse MALDI-ToF MS de l’échantillon 3. (A) Schéma de réaction pour l’échantillon 3. Schéma réactionnel pour la synthèse du PDMP à l’aide de l’acide 3-bromo 2,2-diméthylpropanoïque avec de la triéthylamine comme base. (B) Ce spectre MALDI-ToF MS complet montre la distribution globale du PDMP linéaire avec un groupe final d’ammonium quaternaire (M_n = 1410 Da). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour confirmer si le polymère avait la même unité de répétition (monomère), la différence entre deux pics adjacents a été calculée. L’unité répétée du polymère a une masse moléculaire moyenne observée de 100,0535 Da. Cela a été confirmé en regardant la moyenne de douze pics (distribution principale), allant de 900 Da à 2300 Da, ce qui n’est que de +0,0011 Da au-dessus de l’unité de répétition théorique (100,0524 Da).

Le spectre MALDI-ToF MS présentait deux distributions différentes. L’une des distributions a montré que le polymère a un acide carboxylique et un ammonium quaternaire chargé positivement comme groupes terminaux (noir), tandis que l’autre distribution (violet) a montré la perte de proton de l’acide carboxylique et un ajout d’ion potassium. Afin d’identifier davantage les groupes finaux, un n-mer individuel a été sélectionné pour l’analyse (figure 7).

La valeur de masse théorique de la 12-mère de PDMP avec le groupe final de l’ammonium quaternaire est composée de la masse des unités répétées (100,0524 x 12) plus la masse du groupe final de l’ammonium quaternaire (+ 101,1199) et la masse du groupe final de l’hydrogène (+ 1,0078), ce qui donne une masse totale de 12 mères de 1302,757 Da. La valeur de masse observée pour le 12-mère [H-PDMP_12-TEA]⁺ est de 1302,730 Da, ce qui n’est que de -0,027 Da en dessous de la valeur théorique.

La valeur de masse théorique de la 12-mère de PDMP avec le groupe final de l’ammonium quaternaire d’un côté et le remplacement du proton par un autre ion potassium est composée de la masse des unités répétées (100,0524 × 12) plus la masse du groupe final de l’ammonium quaternaire (+ 101,1199) et la masse du groupe final de potassium (+ 38,9637), ce qui donne une masse totale de 12 mères de 1340,713 Da. La valeur de masse observée pour les 12-mères [K-PDMP_12-TEA]⁺ est de 1340,700 Da, ce qui n’est que -0,013 Da en dessous de la valeur théorique.

Figure 7 : Spectre de masse MALDI-ToF MS d’une répétition individuelle de l’échantillon 3. Ce spectre MALDI-ToF MS montre la distribution primaire du PDMP linéaire avec un groupe final d’ammonium quaternaire (M_n = 1410 Da). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Echantillon 4 : Poly(éthylène-brassylate) linéaire
L’échantillon de polymère suivant caractérisé par MALDI-ToF MS est le poly(éthylène-brassylate) linéaire (l-PEB). Celui-ci a été synthétisé à partir du monomère macrocyclique éthylène brassylate, qui a un cycle de dix-sept membres contenant deux groupes esters (Figure 8A). Pour comprendre le groupe fonctionnel et le changement architectural au sein de la structure polymère, quatre techniques de caractérisation différentes ont été explorées : MALDI-ToF MS, ¹H-NMR, SEC et spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). ¹La RMN-H, la SEC et la FTIR confirment l’élimination du diester cyclique et la formation de α-propargyl-ω-hydroxy-PEB. Cependant, ces techniques n’ont détecté aucun type de formation de sous-produit. D’autre part, le spectre MALDI-ToF MS (Figure 8B) du l-PEB présente trois distributions de masse différentes qui indiquent la formation de trois PEB différents : α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1), α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) et α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3), respectivement (Figure 8B).

Figure 8 : Spectre MALDI-TOF des l-PEB avec Na⁺. (A) Structures linéaires en poly(éthylène brassylate). (1) α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (2) α-propargyl-ω-propargyl-PEB (3) α-propargyl-ω-hydroxy-PEB. (B) Trois distributions, y compris α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1), α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) et α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3), ont été identifiées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’échantillon de l-PEB a été analysé sur le MS MALDI-ToF en utilisant le DCTB comme matrice pour les polymères non polaires. La préparation de l’échantillon MALDI-ToF MS a commencé par la préparation de solutions mères de NaTFA (1 mg/mL dans le THF), de l’analyte (5 mg/mL dans le THF) et de DCTB (20 mg/mL dans le THF). Une fois ces solutions préparées, 1 μL de la solution cationique Na⁺ , 5 μL de la solution d’analyte et 20 μL de la solution (4) de la matrice ont été combinés dans un tube de microcentrifugation et vortex (rapport cation :25:400 cation :analyte/matrice pour un total de 26 mL). Ensuite, 1 μL de ce mélange a été retiré du tube de la microcentrifugeuse et séché sur la plaque cible MALDI-ToF MS. Les MW observés pour chaque distribution se situaient à un écart de 0,03 Da par rapport aux poids moléculaires exacts des ions [M + Na]⁺ .

La valeur de masse théorique pour le 6-mère du α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1) est composée de la masse des unités répétées (270,1831 Da x 6), plus la masse du groupe final 2-hydroxyéthoxy (+ 61,0290 Da), plus la masse du groupe terminal hydrogène (+ 1,008 Da), plus le cation sodium (+ 22,9892 Da) qui donne un total de 1706,124 Da. La valeur de masse observée pour le 6-mère de α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1) est de 1706,133 Da, soit seulement +0,009 Da au-dessus de la valeur théorique.

La valeur massique théorique du 5-mère du α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) est composée de la masse des unités répétées (270,1831 Da x 5), plus la masse de l’éthylène-brassylate moins OCH₂CH₂O (+ 210,1620 Da), plus la masse de deux groupes terminaux d’éther propargylique (+ 55,0184 Da x 2), plus le cation sodium (+ 22,9892 Da) qui donne un total de 1694,103 Da. La valeur de masse observée pour le 5-mère de α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) est de 1694,127 Da, soit seulement +0,024 Da au-dessus de la valeur théorique.

La valeur de masse théorique du 6-mère du α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3) est composée de la masse des unités répétées (270,1831 Da x 6), plus la masse du groupe final de l’éther propargylique (+ 55,0184 Da), plus la masse du groupe final de l’hydrogène (+ 1,008 Da), plus le cation sodium (+ 22,9892 Da) qui donne un total de 1700,113 Da. La valeur de masse observée pour le 6-mère de α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3) est de 1700,139 Da, soit seulement +0,026 au-dessus de la valeur théorique.

Echantillon 5 : Poly(éthylène-brassylate) linéaire azidifié
De plus, l’I-PEB (échantillon 6) a été fonctionnalisé avec de l’acide 6-azidohexanoïque au moyen de l’estérification de ses groupes alcooliques (Figure 9), ce qui a donné du l-PEB azidifié (échantillon 7). Le produit obtenu a également été analysé sur le MS MALDI-ToF (Figure 10) en utilisant les techniques de préparation de l’échantillon comme polymère parent (échantillon 6). Les MW observés pour chaque distribution se situaient à un écart de 0,04 Da par rapport aux poids moléculaires exacts des ions [M + Na]⁺. Après l’estérification, les ions [M + Na]⁺ des l-PEB avec deux groupes hydroxyles (1) montrent un décalage de masse en raison de leur conversion de (1) en α-azido-ω-azido-PEB (4). De plus, les l-PEB avec un groupe terminal hydroxyle et un groupe final propargyle (3) ont été convertis en un α-propargyl-ω-azido-PEB (5). Cependant, (2) n’a pas réagi en raison de ses deux groupes terminaux alcynes.

Figure 9 : Estérification du poly(éthylène brassylate) linéaire avec le groupe final alcool via un schéma de réaction de l’acide 6-azidohexanoïque. α-hydroxy-ω-hydroxy-PEB (1) se transforme en α-azido-ω-azido-PEB (4) et α-propargyl-ω-hydroxy-PEB (3) en α-propargyl-ω-azido-PEB (5). Le α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2) n’a pas réagi en raison des groupes terminaux alcynes qui ne subissent pas de réaction d’estérification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La valeur de masse théorique pour le 6-mère du α-propargyl-ω-azido-PEB (5) est composée de la masse des unités répétées (270,1831 Da × 6), plus la masse du groupe final de l’éther propargylique (+ 55,0184 Da), plus la masse du groupe final azidohexanoate (+ 140,0824 Da), plus le cation sodium (+ 22,9892 Da) qui donne un total de 1839,188 Da. La valeur de masse observée pour le 6-mère de α-propargyl-ω-azido-PEB (5) est de 1839,184 Da, ce qui n’est que de -0,004 Da en dessous de la valeur théorique. De plus, la présence de pics d’ions métastables (5-N₂) pour (5) est une autre indication de la fonctionnalisation des azides, car les ions métastables ne se formeront que s’il y a un azide présent dans la molécule.

La valeur de masse théorique pour le 6-mère du pic métastable (5-N₂ + Na⁺) est de 1815,126 Da, qui a été déterminée à l’aide de l’équation du graphique de la différence de masse du pic métastable et des pics α-azido-ω-hydroxy-PEG (Figure 11). La valeur de masse observée pour 6-mer du pic métastable est de 1815,089 Da, ce qui n’est que -0,031 Da en dessous de la valeur théorique. Le graphique indique que, dans la gamme de masse de 1000 à 2000 Da, la valeur de masse théorique du pic métastable est inférieure de 24 à 24,1 Da à celle de (5).

La valeur de masse théorique pour le 6-mère du α-azido-ω-azido-PEB (4) est composée de la masse des unités répétées (270,1831 Da × 6), plus la masse du groupe terminal 6-azidohexanoate (+ 140,0824 Da), plus la masse du groupe final 2-oxyéthyl-6-azidohexanoate (+ 200,1035 Da), plus le cation sodium (+ 22,9892 Da) qui donne un total de 1994,273 Da. La valeur de masse observée pour le 6-mère de α-azido-ω-azido-PEB (4) est de 1994,296 Da, soit +0,023 Da au-dessus de la valeur théorique.

Figure 10 : Spectre MALDI-ToF des l-PEB azidifiés avec Na⁺. Il s’agit notamment de trois distributions de α-propargyl-ω-propargyl-PEB (2), α-azido-ω-azido-PEB (4) et α-propargyl-ω-azido-PEB (5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Illustration graphique de la différence de masse entre le α-azido-ω-hydroxy-PEG et son composé métastable par rapport à la masse du α-azido-ω-hydroxy-PEG (masse moyenne 1700 Da). Ce graphique est dérivé du spectre MALDI-ToF du α-azido-ω-hydroxy-PEG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Echantillon 6 : Un polymère en peigne largement dispersé
Le schéma de réaction final est un polymère en peigne qui a des unités répétitives de thioéther avec des chaînes latérales en poly(éthylène glycol)⁹. L’échantillon de polymère en peigne composé de 400 M_n méthyléther-PEG-propargyl et de 1,6-hexanedithiol (CP MeO-PEG-400 HDT ; Figure 12A) a été analysé à l’aide de NaTFA. Le sodium a été choisi comme contre-ion parce que les éthers et les thioéthers s’ionisent plus facilement avec le sodium, le lithium et le potassium plutôt qu’avec les métaux alcalino-terreux plus élevés tels que le césium. Ces échantillons ont été analysés avec une matrice non polaire, DCTB, bien que d’autres matrices (CHCA et DT) aient également été testées avec de mauvais résultats. La préparation de l’échantillon MALDI-ToF MS a commencé par la préparation de solutions mères de NaTFA (1 mg/mL dans le THF), de l’analyte (5 mg/mL dans le THF) et de DCTB (20 mg/mL dans le THF). Une fois ces solutions préparées, 1 mL de la solution cationique, 5 mL de la solution d’analyte et 20 mL de la solution matricielle ont été combinés dans un tube de microcentrifugation et vortex (rapport cation :25:400 cation :analyte :matrice pour un total de 26 mL). Ensuite, 1 mL de ce mélange a été retiré du tube de microcentrifugation et séché sur la plaque cible MALDI-ToF MS. Comme le NaTFA a été ajouté à l’échantillon en tant que contre-ion, le spectre de masse MALDI-ToF MS a présenté les adduits Na⁺ attendus de l’échantillon connu. De plus, des augmentations d’environ 16 Da, 32 Da et 48 Da au-dessus de ces pics ont également été observées et seront discutées plus loin dans cet article.

Figure 12 : Schéma réactionnel pour l’échantillon 6 et le spectre de masse MALDI-ToF de l’échantillon 6 (A) Structure chimique et conditions de réaction d’un polymère en peigne à base de dithiol-yne avec plusieurs espaceurs HDT et des chaînes latérales 400 M_n PEG. (B) Spectre de masse MALDI-ToF de l’échantillon 6, CP MeO-PEG-400 HDT. Unité de répétition majeure = 550,30 Da, Unité de répétition mineure = 44,02 Da Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La spectrométrie MALDI-ToF a confirmé la large distribution (dispersion par SEC = 2,88 ; Figure 12B) du CP MeO-PEG-400 HDT. Le pic monoisotopique (comprenant exclusivement les isotopes élémentaires les plus abondants, à savoir ¹²C, ¹H, ¹⁶O et ³²S) a été suffisamment résolu, ce qui a permis d’utiliser une identification de masse exacte. Tous les calculs de masse théoriques ont été déterminés à l’aide des masses monoisotopiques de chaque élément. En raison de la grande dispersion de l’échantillon (2,88 par SEC), le spectre de masse MALDI-ToF n’a pas pu être utilisé pour calculer les valeurs M_n, M_w ou Đ. La spectrométrie de masse MALDI-ToF excelle dans la caractérisation des polymères étroitement dispersés (Đ < 1.3) mais peut avoir du mal à caractériser complètement les polymères largement dispersés. Lors de la description de polymères à larges dispersités, seule l’extrémité inférieure du spectre de masse de poids moléculaire sera bien résolue et visible avec MALDI-ToF MS, à l’exclusion de toute espèce de poids moléculaire supérieur. Ce phénomène est appelé biais de faible masse. En raison de ce phénomène, il est impossible de caractériser complètement les polymères en peigne par le seul MALDI-ToF MS. Pour cette raison, la SEC a été utilisée en tandem avec MALDI-ToF MS pour obtenir des valeurs précises de M_n, M_w et Đ.

Pour confirmer la présence du polymère en peigne, une approche similaire pour un polymère linéaire ou cyclique standard a été adoptée. Chaque unité répétée du polymère en peigne contient une distribution étroite de M_n = 400 chaînes latérales PEG, de sorte que les unités répétées du polymère en peigne ont été explorées pour déterminer la présence du produit prévu dans chacune d’elles. De plus, il restait une petite quantité de matériau de départ de la polymérisation dans la solution réactionnelle (300-700 Da) qui a également été caractérisée.

Dans l’ensemble du spectre MALDI-ToF MS, on peut voir les MW inférieurs et supérieurs pour 6 à 15 mères du MeO-PEG-OH. À l’origine, dans le spectre MALDI-ToF MS du matériau de départ MeO-PEG-propargyl, ces MeO-PEG-OH n’étaient pas visibles (Figure 13 ; spectre supérieur). L’apparition de ces pics est due à la concentration relative du MeO-PEG-propargyl par rapport au MeO-PEG-OH. Au fur et à mesure que la réaction du polymère en peigne se déroule, le MeO-PEG-propargyl est incorporé dans le produit. Pour cette raison, le rapport entre le matériau de départ de l’alcyne et le MeO-PEG-OH commence à diminuer, ce qui montre des MeO-PEG-OH non fonctionnalisés dans le spectre MALDI-ToF MS (Figure 13 ; spectre inférieur).

En ce qui concerne la distribution de la masse du produit, des valeurs de masse exactes ont été utilisées pour tous les calculs ultérieurs. La valeur de masse théorique d’une unité répétée du matériau de départ [MeO-(PEG₁₀)-CH₂CCH + Na]⁺ est de 44,0262 Da. Cette masse unitaire répétée multipliée par le nombre d’unités répétées, qui sera de 10 pour chaque chaîne latérale, (44,0262 Da x 10) plus la masse du groupe final α-méthoxy (+ 31,0183 Da) et la masse du groupe terminal ω-propargyle (+ 39,0235 Da) plus la masse du cation sodium (+ 22,9892 Da) donne une masse totale de 10-mères de 533,2932 Da. La valeur de masse observée pour les 10-mères PEG + Na⁺ est de 533,239 Da, soit -0,054 Da en dessous de la valeur théorique (Figure 13). Dans le spectre complet de MALDI-ToF MS, il y a les 6 à 9 mères ci-dessous et les 11 à 15 mères ci-dessus pour cette série. La séquence de pics décalés plus petits dans le spectre de faible poids moléculaire correspond à un matériau de départ MeO-PEG-OH non fonctionnalisé où la valeur de masse théorique du 11-mère est composée de la masse des unités répétées (44,0262 Da x 11) plus la masse du groupe final α-méthoxy (+ 31,0184 Da) et la masse du groupe final ω-hydrogène (+ 1,008 Da) et la masse du cation sodium (+ 22,9892 Da) qui donne un total de 11-mère masse de 539.304. La valeur de masse observée pour le 11-mer + Na⁺ est de 539,252 Da, ce qui n’est que de -0,052 Da en dessous de la valeur théorique.

Figure 13 : Spectres de masse MALDI-ToF (zoom avant de 530 à 615 Da) du matériau de départ (en haut) et des espèces de faible poids moléculaire de l’échantillon 8 (en bas), CP MeO-PEG-400 HDT. Le rapport entre le matériau de départ de l’alcyne et le MeO-PEG-OH (spectre supérieur et rouge) commence à diminuer, ce qui montre un MeO-PEG-OH non fonctionnalisé (spectre inférieur et bleu) dans le spectre de masse CP MeO-PEG-400 HDT MALDI-ToF (spectre inférieur). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En ce qui concerne les polymères en peigne cyclique, leurs masses avec des degrés variables de polymérisation peuvent être multipliées par les parties individuelles du n-mer souhaité. La valeur de masse théorique du 2-mère [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ est composée de la masse des unités répétées de chaque chaîne PEG, au nombre d’environ 8 par chaîne, (44,0262 Da x 16) plus la masse des groupes terminaux méthyles terminaux de chaque chaîne PEG (+ 15,0235 Da x 2) plus la masse des carbones qui étaient autrefois le groupe propargyle et qui ont maintenant réagi avec les thiols (+ 41,0391 Da x 2) plus la masse du HDT qui a réagi avec les alcynes (+ 148,0380 Da x 2) et la masse du cation sodium (+ 22,9892 Da) qui donne une masse totale de 2-mères de 1167,599 Da. La valeur de masse observée pour le 2-mère [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ est de 1167,626 Da, soit +0,027 Da au-dessus de la valeur théorique (Figure 14). Bien que les structures cycliques de poids moléculaire inférieur aient été observées, les composés linéaires avec des thiols aux deux extrémités ou des doubles liaisons aux deux extrémités n’ont pas pu être observés.

Ces polymères contenant du thioéther peuvent également subir une oxydation, convertissant les thioéthers en sulfoxydes⁹. Cela explique l’ajout de plusieurs oxygènes (+ 15,9949 Da x n) en fonction du degré d’oxydation ; cela diffère de l’adduit K+, qui est une différence de +15,9739 Da par rapport à l’adduit Na⁺ . Pour l’oxydation simple du 2-mère [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]^+, la valeur de masse théorique est de 1183,594 Da, tandis que la valeur de masse observée était de 1183,620 Da avec seulement une augmentation de +0,026 Da par rapport à la valeur théorique. Pour la double oxydation du 2-mère [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺, la valeur de masse théorique est de 1199,590 Da, tandis que la valeur de masse observée était de 1199,613 Da avec une augmentation de seulement +0,023 Da par rapport à la valeur théorique. Enfin, pour la triple oxydation du 2-mère [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]⁺, la valeur de masse théorique est de 1215,585 Da, tandis que la valeur de masse observée était de 1215,617 Da avec une augmentation de seulement +0,032 Da par rapport à la valeur théorique.

Figure 14 : Spectre de masse MALDI-ToF de l’échantillon 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Zoom avant de 1165 à 1254 Da montre des produits polymères cycliques à peigne 2-mères avec différentes quantités d’unités de répétition PEG attachées et différents degrés d’oxydation du thioéther. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’oxydation peut être confirmée davantage en effectuant une étude de contre-ion. Cela implique d’utiliser un cation ionisant différent, tel que K⁺, et de comparer le décalage des pics dans les spectres MALDI-ToF MS. Un échantillon de CP MeO-PEG-400 HDT a été analysé sur le MALDI-ToF MS en utilisant KTFA plutôt que NaTFA (Figure 15). Cela décale toutes les masses des pics vers le haut de +15,9739 Da en raison de la différence de masse entre Na⁺ et K⁺. Pour l’analyse avec l’adduit K⁺ , aucun polymère non oxydé (1183.574 Da_Theo) n’était présent dans les spectres MALDI-ToF MS. Pour l’oxydation simple du 2-mère [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ , la valeur de masse théorique est de 1199,569 Da tandis que la valeur de masse observée était de 1199,567 Da (seulement -0,002 Da), pour la double oxydation du 2-mère [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ , la valeur de masse théorique est de 1215,564 Da tandis que la valeur de masse observée était de 1215,572 Da couvrant une différence (seulement +0,008 Da), pour la triple oxydation du 2-mère [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ , la valeur de masse théorique est de 1231,558 Da tandis que la valeur de masse observée était de 1231,563 Da (seulement +0,005 Da), et pour la quadruple oxydation nouvellement formée du 2-mère [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ , la valeur de masse théorique est de 1247,553 Da tandis que la valeur de masse observée était de 1247,551 Da (seulement -0,002 Da). Il convient de noter que les polymères se sont oxydés davantage entre le passage des adduits Na⁺ et K⁺ , ce qui a entraîné la perte du produit non oxydé et la formation de la quadruple oxydation du CP MeO-PEG-400 HDT. Il peut également être noté que si le polymère vole effectivement avec les adduits Na⁺ et K⁺ , le rapport signal/bruit est significativement plus élevé pour les adduits Na⁺ , ce qui accentue l’option d’utiliser Na⁺ pour la caractérisation primaire.

Figure 15 : Spectre de masse MALDI-ToF de l’échantillon 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Le zoom avant de 1195 à 1254 Da montre des produits polymères cycliques à peigne 2 mers avec différentes quantités d’unités de répétition PEG attachées et divers degrés d’oxydation du thioéther. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

MALDI-ToF MS est une technique très efficace pour la caractérisation des polymères synthétiques, offrant des mesures précises avec une fragmentation minimale grâce à son mécanisme d’ionisation douce. Dans cette méthode, la matrice absorbe l’énergie d’un laser et la transfère à l’analyte²⁶. Cette énergie provoque la vaporisation du polymère, son ionisation par interaction avec un agent de cationisation et sa désabsorption dans le vide. Les analytes ionisés voyagent à travers le tube de vol, où ils sont détectés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z)^26,27. Cette méthode convient pour déterminer la masse des molécules monodispersées et est tout aussi efficace pour les polymères modérément dispersés (Đ = 1,1-1,3) que pour les polymères très dispersés, où la masse unitaire répétée et les groupes finaux peuvent être déterminés. Pour les polymères modérément dispersés, MALDI-ToF MS fournit également la dispersion (Ð), la masse moléculaire moyenne en nombre (M_n) et la masse moléculaire moyenne en poids (M_w).

Cependant, plusieurs limites de la technique sont à noter. La MS MALDI-ToF présente un biais de faible masse lors de l’analyse de polymères à haute dispersité (Đ > 1.3), ce qui signifie que les polymères de faible masse dans la distribution dominent le spectre tandis que les espèces de masse plus élevée ont des pics de faible intensité ou sont absentes^28,29. De plus, la résolution diminue considérablement pour les polymères supérieurs à 10 000 Da, et les polymères supérieurs à 15 000 Da pourraient être mieux analysés en mode linéaire. Cependant, le mode linéaire sacrifie la résolution du pic isotopique par rapport au mode réflecteur. De plus, MALDI-ToF MS repose sur la capacité du polymère à s’ioniser efficacement. Les polymères à systèmes conjugués ou hétéroatomes s’ionisent plus facilement que les hydrocarbures saturés comme le polyéthylène ou le polypropylène, qui nécessitent souvent des modifications chimiques pour ioniser^30,31.

La préparation des échantillons est une étape cruciale pour obtenir des résultats réussis. L’un des aspects les plus importants est le choix de la matrice appropriée pour l’analyte polymère^11,32. Par exemple, les matrices telles que DCTB et GFR fonctionnent bien pour les polymères non polaires, tandis que DHB et CHCA peuvent être comparées pour les polymères polaires afin d’identifier quelle matrice fournit les pics les plus résolus. De plus, le choix d’un solvant approprié pour dissoudre à la fois la matrice et l’analyte garantit une cocristallisation correcte, ce qui améliore l’ablation laser et améliore la résolution dans les spectres MALDI-ToF MS résultants 33,34,35. De même, le choix de l’agent de cationisation approprié est essentiel pour maximiser l’efficacité de l’ionisation et produire des pics clairs et distincts.

Une fois la matrice et l’agent de cationisation sélectionnés, le rapport matrice :analyte :cation peut être optimisé. Commencez par préparer des solutions mères du cation sélectionné (1 mg/mL dans le THF), de l’analyte (5 mg/mL dans le THF) et de la matrice (20 mg/mL dans le THF). Un rapport volumique de départ de 1:5:20 μL (cation :analyte :matrice) est recommandé, correspondant à des rapports de concentration d’environ 1:25:400 mg/mL dans un volume total de 26 μL. Si ce mélange initial ne donne pas de spectres bien résolus, une optimisation systématique peut être effectuée à l’aide d’une approche basée sur une grille (Tableau 2)^10,16. Dans cette configuration, le volume de l’analyte est fixe, tandis que le volume de la matrice est multiplié par 4 sur les colonnes, et le volume de cations est multiplié par 4 vers le haut des lignes. Cette grille permet aux utilisateurs d’identifier le rapport optimal pour l’ionisation et la résolution. Si l’une des conditions de la grille externe offre des performances améliorées, une nouvelle grille peut être générée centrée sur ce rapport, en continuant le multiple de 4 ajustements pour un raffinement supplémentaire. Un bon point de départ consiste à évaluer si le spectre contient des pics de haute intensité, un faible bruit de base et une résolution isotopique bien résolue. Ce processus peut prendre beaucoup de temps, en particulier pour les polymères nouveaux ou complexes qui peuvent nécessiter de tester plusieurs matrices et cations dans une grille de préparation 3 x 3.

Tableau 2 : Une grille systématique de rapports expérimentaux peut être créée et testée. Un rapport de 1:5:20 μL de cation, d’analyte et de matrice, respectivement, sera utilisé pour démarrer (1:25:400 mg/mL) cation :analyte :matrice pour un total de 26 mL. Le volume de l’analyte est fixé à 5 μL (25 mg/mL). La matrice et le rapport cationique sont multipliés par 4 sur les colonnes et sur les lignes, respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Après l’application de l’échantillon sur la plaque cible MALDI-ToF MS, à l’aide de la méthode des gouttelettes séchées, la plaque MALDI-ToF MS est ensuite chargée dans l’instrument MALDI-ToF MS. Les paramètres d’acquisition de données MALDI-ToF MS, tels que la puissance laser, le diamètre du faisceau laser, le gain du détecteur et l’extraction d’ions d’impulsions, peuvent être affinés pour obtenir une résolution plus élevée et une séparation des pics plus claire. Ceux-ci peuvent être modifiés systématiquement pour déterminer l’intensité maximale, réduire le bruit de base et améliorer la résolution de crête (Figure 1).

L’optimisation des paramètres instrumentaux et des ratios de préparation des échantillons ne suit pas un flux de travail strictement linéaire. Les opérateurs peuvent commencer par une méthode de préparation d’échantillon préférée et effectuer un criblage en mode linéaire pour évaluer si le polymère s’ionise, ou ils peuvent d’abord affiner la méthode de l’instrument (p. ex., puissance laser, extraction par impulsions) avant de modifier les rapports de mélange d’échantillons à l’aide de la grille de préparation 3 x 3. La flexibilité du flux de travail est souvent nécessaire, en particulier lors de l’analyse de matériaux nouveaux, inconnus ou mal caractérisés.

Une fois l’optimisation terminée, un protocole de préparation d’échantillon peut être réutilisé, bien qu’une légère variabilité inter-opérateurs ou inter-journalière puisse encore se produire. L’exécution d’un étalonnage pour chaque cycle d’acquisition minimise les variations, et les différences de masse maximale restent généralement inférieures à 0,1 Da lorsque des protocoles cohérents sont suivis. Par conséquent, la reproductibilité d’un utilisateur et d’un jour à l’autre est réalisable si la méthode de l’instrument et la préparation de l’échantillon restent les mêmes. Si les problèmes persistent, le Tableau 3 présente les problèmes courants rencontrés par l’utilisateur et les solutions.

Tableau 3 : Problèmes courants et stratégies de dépannage basées sur l’expérience pratique. Le tableau permet de résoudre les problèmes rencontrés lors de la préparation des échantillons, de l’acquisition et de l’analyse des données. Pour un dépannage spécifique à l’instrument, consultez le manuel du fabricant du MALDI-ToF MS ou un technicien qualifié. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

L’étalonnage est une étape critique pour garantir la précision des mesures de masse. Des étalonnages externes et internes peuvent être utilisés, mais il est essentiel que les calibrateants utilisés se situent dans la plage de masse de l’analyte polymère. Un étalonnage approprié garantit que la masse de l’analyte est correctement déterminée.

L’analyse des données est effectuée là où le spectre de masse MALDI-ToF MS est ouvert, et le pic de sélection peut être sélectionné pour une analyse plus approfondie. La masse des macromolécules monodispersées, ainsi que des polymères faiblement, modérément et fortement dispersés d’un n-mer spécifié, peut être confirmée en comparant la masse observée avec des valeurs théoriques calculées à l’aide d’un logiciel de dessin chimique. Ces comparaisons permettent de vérifier la masse totale d’une macromolécule monodispersée ou, dans le cas de polymères faiblement, modérément et fortement dispersés d’un n-mer spécifié, les groupes terminaux sont identifiés et la masse unitaire répétée est confirmée.

En résumé, l’optimisation de la matrice, des conditions de cationisation et des rapports expérimentaux est essentielle pour obtenir des données MALDI-ToF MS à haute résolution. L’étalonnage garantit des mesures de masse précises. L’analyse des données à l’aide de la sélection des pics et de la comparaison théorique de la masse permet une caractérisation approfondie du polymère, y compris l’identification des groupes finaux et de la masse unitaire répétée. Cette technique peut être utilisée pour les macromolécules monodispersées, ainsi que pour les polymères synthétiques faiblement dispersés, modérément dispersés et très dispersés. Les orientations futures comprennent l’élargissement de la caractérisation des architectures polymères complexes telles que les mélanges de couches minces de polymères, les polymères cycliques et les polymères hyperramifiés grâce à des méthodes de préparation d’échantillons sans solvant et à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)36,37,38. Des combinaisons d’instruments, telles que l’utilisation de la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) pour fractionner un échantillon, suivie de MALDI-ToF MS pour l’analyse structurelle, peuvent être utilisées pour identifier des structures de faible masse, déterminer la dispersion fractionnée et caractériser les groupes terminaux dans des échantillons de polymères hautement dispersés 39,40,41. De plus, de nouvelles approches d’analyse de données, y compris la saisie manuelle ou la génération assistée par logiciel de tracés de défauts de masse Kendrick, permettent de convertir des spectres de masse en cartes bidimensionnelles, facilitant ainsi l’identification de plusieurs groupes d’extrémités au sein d’un échantillon ^2,42.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide	Produits chimiques TCI	D1601	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/D1601
1,1,1-Tris(hydroxyméthyl)propane	Millipore Sigma	148083	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/148083?srsltid=AfmBOoqaMzcy1xravp1h2QE 0myfY5gjuEBfOIv2o882Wb _xcB4Ol4CMW
1,5,7-Triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene	Millipore Sigma	345571	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/345571?srsltid=AfmBOooLQXIhWaMnO63nE xu-Y5MJoJID6RJiby0NXyu DHOxXYjle_kMT
1,6-hexanedithiol à 98 % (HDT)  ;	TCI	N° H0334	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/H0334
Acide 2-(4-hydroxyphénylazo)benzoïque) (HABA)	Millipore Sigma	N° H5126	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h5126
Acide 2,2-bis(hydroxyméthyl)propionique	Millipore Sigma	106615	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/106615?srsltid=AfmBOopCRoa1N_UiDK 56NKhDKdlAN8feUrMxVYhul Muz2en6NYEGIh4b
2,2-diméthoxy-2-phénylacétophénone à 99 % (DMPA)  ;	Sigma-Aldrich	196118	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/196118?srsltid=AfmBOoqVTif6KNwIr6A -bIgnXbkrvWKIUNH6qOsc RseQLNVKi0DMWPb-
Acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB)	Millipore Sigma	149357	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/149357
4-(diméthylamino)pyridine	Millipore Sigma	522821	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/522821?focus=products&page=1&perpage= 30& sort=pertinence& term=522821 & type=produit  ;
Acide 6-bromohexanoïque	Millipore Sigma	150452	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/6-bromohexanoic-acid?focus=products&page=1 & par page=30& sort=pertinence& term= 6-Bromohexanoïque %20acid& type=produit  ;
Benzaldéhyde diméthylacétal	Millipore Sigma	226076	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/226076?srsltid= AfmBOorbjP7zD9MO3g5Xk LL3rNZ02PhfkXoRfe3EjRK7 TrqJ-kEOrTCN
Acide benzoïque	Millipore Sigma	242381	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/242381?srsltid=AfmBOook_iIcMnwuB3e _j-KetQyyHJ6Qq86jSK8 ZVxC3BorQgkO8Xg5I  ;
Bruker UltraFlextreme  ;	Bruker Daltonics		https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/maldi-tof/ultraflextreme.html
Chloroforme	Fisher Scientific	AA32614K7	https://www.fishersci.com/shop/products/chloroform-acs-99-8-thermo-scientific/AA32614K7 ?searchHijack=true& searchTerm= chloroform-acs-99-8-thermo-scientific & searchType=Rapide& matchedCatNo =AA32614M6
Dithranol, PA, 98,5-101 % (DT)	Fisher Scientific	18-602-270	https://www.fishersci.com/shop/products/dithranol-bp-98-5-101-spectrum-chemical/18602270
Éthylène brassylate	Millipore Sigma	W354309	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/w354309?utm_source=google&utm_medium= CPC et utm_campaign=8692675663& utm _content=86098110623& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiApY-7BhBjEiwAQMr rEdJTcKN5TEFkP1uHvRlVign3lwg2cj5 _spBUCrfi6exZ3Ur5sJkARxoCfWsQ AvD_BwE  ;
Galvinoxyl, radical libre	Millipore Sigma	G307	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/g307?srsltid= AfmBOopoWGDMXtLk5Erf0rVyl 7j442uyg8rIWkfBjhHZ2z0dDktH3y8-
Méthanol	Fisher Scientific	A456	https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-optima-lc-ms-grade-thermo-scientific/A4564
Palladium, 10 % sur carbone, Type 487, sec	Fisher Scientific	AAA1201206	https://www.fishersci.com/shop/products/palladium-10-carbon-type-487-dry-thermo-scientific-1/AAA1201206#?keyword=palladium%20on%20carbon
Poly(éthylène  ; Glycol) Monométhyl Ether 350  ; Mn  ; (MeO-PEG-OH 360)  ;	Fisher Scientific	AA4156022	https://www.fishersci.com/shop/products/polyethylene-glycol-monomethylether-350-thermo-scientific/AA4156022
Trifluoroacétate de potassium (KTFA)	Millipore Sigma	281883	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/281883
Alcool propargylique	Fisher Scientific	A10295.0F	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10295.0F?SID=srch-hj-A10295.0F
Bromure de propargyle à 97 % (80 % p/p dans du toluène stabilisé au MgO)	Fisher Scientific	AAL1059514	https://www.fishersci.com/shop/products/propargyl-bromide-97-80-w-w-toluene-stab-magnesium-oxide-thermo-scientific/AAL1059514#?keyword=Propargyl%20bromide%2097%%20(80 %%20w/w %20in %20toluène %20stabilisé %20avec %20MgO)
Azoture de sodium	Millipore Sigma	S2002	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/s2002  ;
Dispersion de l’hydrure de sodium à 60 % dans l’huile minérale  ;	Millipore Sigma	452912	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/452912?srsltid= AfmBOooZhbCm_qtgKU99922Y91zI qEOWONlEGxjZn0mdSJF2L5hW1uVn
Trifluoroacétate de sodium (NaTFA)	Oakwood	MFCD00013217	https://www.oakwoodchemical.com/ProductsList.aspx?CategoryID=-2&txt Recherche=1549& ExtHyperLink=1
Kit SpheriCal Neat Low Range (250 - 7 500 Da)	Usine de polymères	PFS-104	https://www.polymerfactory.com/product-page/spherical-low-range-kit-500-7-500-da
Tétrahydrofurane (THF)	Fisher Scientific	T427	https://www.fishersci.com/shop/products/tetrahydrofuran-optima-fisher-chemical-3/T4274#?keyword=tetrahydrofuran%20optima
trans-2-[3-(4-tert-butylphényl)-2-méthyl-2-propénylidène]malononitrile (DCTB)	TCI	Réf. B3635	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/B3635
Acide &alpha ;-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA)	TCI	Vers 1768	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/C1768