Article de méthode

Développement d’un dispositif d’éclairage LED innovant pour l’application in vitro de la thérapie photodynamique avec Rose Bengal

DOI :

10.3791/68462

⸱

12 septembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce manuscrit présente un dispositif d’éclairage innovant imprimé en 3D pour l’étude in vitro de la thérapie photodynamique médiée par Rose Bengal.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit un nouveau dispositif de thérapie photodynamique (PDT) permettant d’évaluer l’efficacité de la PDT médiée par Rose Bengal (RB) in vitro. Le dispositif, appelé CELL-LED-550/3, se compose de deux pièces imprimées en 3D, l’une générant une lumière verte de 550 nm à partir d’une seule LED (la partie source lumineuse) et l’autre distribuant cette lumière à une plaque de culture cellulaire à 96 puits (la partie distributrice de lumière). La partie source lumineuse est contrôlée par un pilote avec trois modes différents, ce qui permet à la partie distributeur de lumière de fournir trois niveaux d’irradiance différents à la surface extérieure inférieure des puits : 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 ou 0,62 mW/cm2. La partie répartiteur de lumière a été conçue pour éclairer les puits individuellement et simultanément. Pour démontrer la pertinence du dispositif CELL-LED-550/3, sa capacité à induire la mort cellulaire par PDT médiée par RB sur des cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2 a été évaluée. Tout d’abord, les cellules HepG2 ont été traitées pendant 2 h avec des concentrations croissantes de Rose Bengal, un photosensibilisant avec un pic d’absorption (le plus élevé) à environ 550 nm. Les cellules traitées ont ensuite été éclairées à l’aide de l’appareil CELL-LED-550/3 réglé à son niveau d’irradiance maximal à des doses lumineuses de 0,3 J/cm2, 0,6 J/cm2 et 1,2 J/cm2 (respectivement, avec des durées d’éclairage de 8 min et 4 s, 16 min et 8 s et 32 min et 16 s). Enfin, la viabilité a été mesurée à l’aide de Cell-Titer Glo 24 h après la PDT. Les résultats expérimentaux montrent que la PDT médiée par RB à l’aide du dispositif CELL-LED-550/3 est capable d’induire une diminution de la viabilité des cellules HepG2, d’une manière qui dépend à la fois de la concentration de Rose Bengal et de la dose de lumière administrée. Sur la base de la preuve de concept présentée dans cet article, le dispositif CELL-LED-550/3 ajoute un outil supplémentaire à l’étude de la PDT médiée par RB.

Introduction

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Avec plus de 905 000 nouveaux cas et 830 000 décès en 2020, le cancer primitif du foie est le septième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde1. Parmi les cancers primitifs du foie, le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la forme la plus fréquente, représentant environ 90 % des cas2. En raison d’une maladie hépatique chronique non détectée et d’une faible observance de la surveillance, seuls 25 % des patients atteints de CHC sont diagnostiqués à un stade précoce de la maladie3. Ces patients diagnostiqués précocement sont généralement traités par résection hépatique, transplantation hépatique ou thérapies ablatives locales à visée curative et présentent un bon pronostic avec un taux de survie à cinq ans supérieur à 70 %4,5. Pour les 75 % restants (ceux atteints d’un CHC diagnostiqué intermédiaire ou tard), bien que des modalités de traitement innovantes, notamment des thérapies ciblées, des immunothérapies et des schémas thérapeutiques combinés, apportent un bénéfice en termes de survie6, le pronostic reste très sombre : le taux de survie à cinq ans ne dépasse en effet pas 30 % pour ce groupe de patients et tombe à 2 % pour le sous-groupe de patients métastatiques6. Il est donc essentiel d’explorer d’autres options de traitement pour améliorer les résultats du traitement et prolonger la survie des patients atteints d’un CHC de stade intermédiaire ou avancé. La thérapie photodynamique (PDT), qui est une thérapie anticancéreuse largement pratiquée en dermatologie7, pourrait être un candidat alternatif approprié.

La PDT est un traitement photochimique qui combine l’utilisation d’un agent photosensibilisant (PS), d’une longueur d’onde appropriée de la lumière visible et de l’oxygène moléculaire pour générer des espèces réactives de l’oxygène (ROS) cytotoxiques8. Les effets anticancéreux de la PDT sont dérivés de trois mécanismes induits par les ROS9 : d’abord, des effets cytotoxiques directs sur les cellules malignes10, puis des dommages au système vasculaire tumoral qui induisent l’hypoxie du tissu tumoral, la privation et la régression des nutriments11, et enfin l’induction d’une réaction inflammatoire par la libération de signaux de danger et d’antigènes tumoraux à partir de cellules tumorales endommagées ou mourantes12. Depuis plus de trois décennies, la PDT fait l’objet d’intenses recherches visant à évaluer son potentiel à traiter divers types et formes de cancer 13,14,15,16,17,18. Sur la base de son efficacité prouvée par ces investigations 19,20,21, la PDT est aujourd’hui utilisée en dermatologie pour le traitement des cancers de la peau autres que le mélanome 7. Pour les autres indications, le nombre d’études cliniques a augmenté ces dernières années, ce qui démontre les efforts importants déployés pour intégrer la PDT, utilisée seule ou en association avec des traitements standard, dans la pratique clinique 22,23,24.

Il existe une variété d’agents photosensibilisants utilisés pour la PDT25. Parmi eux, il a été démontré que Rose Bengal (RB) agit comme un agent photodynamique efficace contre les cellules tumorales du larynx26, les cellules de mélanome27, les cellules cancéreuses du sein28 et les tissus cancéreux de la prostate29. Les travaux présentés dans cet article sont basés sur la nécessité d’évaluer si la PDT médiée par RB est également efficace pour les cellules CHC.

Une telle évaluation a en effet nécessité le développement préalable d’un dispositif à base de LED vertes dédié à l’éclairage à 550 nm de plaques de culture cellulaire à 96 puits. Une conception en deux parties a été mise en œuvre pour ce dispositif30 : une partie source lumineuse génère une lumière verte de 550 nm à partir d’une seule LED, tandis qu’une partie distributrice de lumière distribue cette lumière, grâce à l’utilisation d’un faisceau de fibres optiques, aux 96 puits individuellement et loin de la LED. Cette conception en deux parties empêche d’abord les cellules des effets thermiques nocifs qui peuvent survenir en raison de la chaleur incontrôlée générée à l’intérieur de la LED et, deuxièmement, permet d’éclairer les cellules à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire tout en gardant la partie source lumineuse avec ses composants électroniques (y compris la LED) à l’extérieur. Ces caractéristiques innovantes confèrent au dispositif CELL-LED-550/3 des avantages majeurs par rapport aux systèmes à LED déjà publiés qui ont été spécialement conçus pour l’éclairage à plaques multipuits 31,32,33,34,35.

Dans cet article, l’appareil CELL-LED-550/3 est d’abord décrit en détail. Ensuite, à titre de preuve de concept, une étude de viabilité cellulaire démontre l’efficacité de la PDT médiée par RB à l’aide de CELL-LED-550/3 dans un modèle de culture cellulaire HCC 2D (HepG2)30. En plus d’être peu coûteux et portable, le dispositif CELL-LED-550/3 est donc également un outil particulièrement pertinent pour les expériences PDT médiées par RB.

Protocole

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Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Construction de l’appareil

REMARQUE : Les deux parties de l’appareil CELL-LED-550/3 sont fabriquées séparément et, ce n’est qu’en dernier ressort qu’elles sont branchées ensemble.

  1. Construction de la partie source lumineuse
    1. Fixez un ensemble de dissipateur de chaleur de ventilateur de taille appropriée à l’arrière de la carte de circuit imprimé (PCB) sur laquelle la LED 550 nm 3 W est montée.
    2. Couvrez la LED avec une lentille collimatrice en PMMA (polyméthacrylate de méthyle) transparente afin d’homogénéiser le faisceau lumineux et de réduire l’angle du faisceau de 120° à 10°. Une telle réduction permet d’augmenter la quantité de lumière délivrée à la partie distributrice de lumière.
    3. Connectez la LED au pilote de courant avec une gradation trimode, ce qui permet de fournir différents niveaux d’irradiance.
    4. Construire séparément le boîtier, la façade du boîtier et la fermeture du boîtier en impression 3D (encadrés rouges sur la figure 1).
    5. Installez le pilote et le voyant équipé de la lentille et du dissipateur de chaleur du ventilateur à leurs emplacements dédiés dans le boîtier (cases bleues de la Figure 1).
    6. Installez la prise d’alimentation et l’interrupteur à bascule à leurs emplacements dédiés dans la fermeture du boîtier (cases bleues sur la Figure 1).
    7. Connectez le pilote et le dissipateur de chaleur du ventilateur à la prise d’alimentation via l’interrupteur à bascule.
    8. Assemblez le boîtier, la fermeture du boîtier et la façade du boîtier.
    9. Vérifiez que la LED est alignée avec l’axe de l’ouverture cylindrique de la façade du boîtier.
      REMARQUE : L’ouverture cylindrique de la façade du boîtier est destinée à la connexion optique de la partie source lumineuse (connecteur femelle) avec la partie répartiteur de lumière (connecteur mâle).

figure-protocol-1
Figure 1 : Vues tridimensionnelles de face (A), de dos (B) et éclatée (C) de la partie source lumineuse. Adapté de Lefebvre, A. et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

  1. Construction de la partie distributeur de lumière
    1. Construisez séparément la fermeture inférieure du boîtier, le boîtier et la fermeture supérieure en impression 3D (ensemble, ils forment une boîte creuse) (boîtes rouges sur la figure 2).
    2. Construisez l’entretoise à 96 puits en impression 3D blanche (boîte rouge sur la figure 2) de manière à ce qu’elle s’adapte exactement à la boîte creuse mentionnée au point 1.2.1. La couleur blanche a pour but de maximiser la réflexion de la lumière et donc d’optimiser la répartition de la lumière.
      REMARQUE : Le diamètre et l’espacement central des ouvertures circulaires présentes dans l’espaceur de 96 puits doivent être égaux au diamètre et à l’espacement central des puits de la plaque de 96 puits utilisée pour les essais biologiques.
    3. Percez 96 petits trous dans la fermeture supérieure de la boîte creuse de manière à ce qu’ils soient alignés avec le centre des 96 ouvertures circulaires de l’entretoise à 96 puits, lorsque cette dernière est placée sur la fermeture supérieure.
    4. Insérez une fibre optique plastique de 0,5 mm de diamètre, de bas en haut, dans chacun des 96 petits trous de la fermeture supérieure.
    5. Appliquez de la résine polyester au bas de la fermeture supérieure pour lier les 96 fibres optiques à la fermeture supérieure.
    6. Une fois la résine sèche, polissez les extrémités distales des fibres optiques jusqu’à ce qu’elles s’ajustent au haut de la fermeture supérieure.
    7. Rassemblez les fibres optiques à l’intérieur de la boîte creuse mentionnée à l’étape 1.2.1 en un seul faisceau protégé par une gaine, qui s’étend sur environ deux mètres hors de la boîte.
      REMARQUE : La hauteur du boîtier doit être suffisante pour éviter la flexion des fibres optiques et l’atténuation optique qui peut être causée.
    8. Assemblez le caisson creux de manière à ce que le faisceau de fibres passe par l’ouverture dédiée du boîtier.
    9. Assemblez les extrémités proximales des fibres optiques dans un connecteur mâle imprimé en 3D, permettant la connexion à la partie source lumineuse (connecteur femelle).
      REMARQUE : Ce connecteur ne doit pas nécessiter de colle pour éviter l’atténuation de la lumière que cette colle peut provoquer.
    10. Placez l’entretoise à 96 puits sur la boîte creuse.
    11. Créez un écran en insérant un papier calque entre une plaque de PMMA transparente (face inférieure) et une feuille de mylar anti-rayures (face supérieure) afin de diffuser le faisceau étroit délivré à chaque extrémité distale de la fibre optique en un faisceau aussi grand que le diamètre du puits de la plaque de 96 puits utilisée pour les tests biologiques.
    12. Construisez le cadre de l’écran en impression 3D (boîte rouge sur la figure 2) de sorte que son ouverture centrale corresponde exactement à la taille de la plaque de 96 puits utilisée pour les tests biologiques et, ainsi, les puits s’alignent parfaitement avec les ouvertures circulaires de l’espaceur de 96 puits.
    13. Fixez l’écran au sommet de l’entretoise à 96 puits avec le cadre de l’écran.

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Figure 2 : Vues tridimensionnelles de la partie distributrice de lumière. Adapté de Lefebvre, A. et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

  1. Assemblage de la partie source lumineuse avec la partie distributeur de lumière
    1. Branchez le connecteur mâle de la partie répartiteur de lumière dans le connecteur femelle de la partie source de lumière.
      REMARQUE : Une fois le connecteur mâle branché sur le connecteur femelle, le faisceau lumineux délivré par la partie source lumineuse doit couvrir un peu plus que la surface de l’élément récepteur de lumière de la partie distributrice de lumière, assurant ainsi l’alimentation en lumière des 96 fibres optiques.

2. Essais biologiques

  1. Procédé de culture cellulaire
    1. Cultiver la lignée cellulaire d’hépatocarcinome HepG2 dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de sérum bovin inactivé par la chaleur et 1 % de streptomycine et de pénicilline.
    2. Maintenir les flacons de culture contenant des cellules HepG2 dans un incubateur de culture de cellules à 5 % de CO2 à 37 °C.
    3. Changer le milieu de culture tous les 3 jours en aspirant le milieu de culture des flacons et en le remplaçant par un milieu de culture RPMI 1640 préalablement chauffé à 37 °C.
    4. À l’aide d’un microscope, vérifiez la confluence des cellules dans les flacons de culture jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % à 90 %.
  2. Processus d’ensemencement
    1. Retirez les cellules de l’incubateur et placez-les sous le poste de sécurité microbiologique pré-nettoyé.
    2. Retirer le milieu de culture des flacons de culture.
    3. Lavez les flacons de culture avec une solution tampon de phosphate.
    4. Appliquez 3 mL de trypsine (0,25 %, 0,53 mM) sur les cellules et placez les flacons de culture dans l’incubateur à 37 °C pendant 5 min pour détacher les cellules.
    5. Après 5 min, récupérer la trypsine des flacons de culture avec 7 mL de milieu de culture et récupérer toute la solution de milieu + trypsine + cellules dans un tube de 15 mL.
    6. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Pour ce faire, prélevez 20 μL de la solution contenant les cellules et placez-la dans un tube. Ajouter 20 μL de solution de bleu de trypan et placer la solution de cellule + bleu de trypan sur la lame de comptage et l’insérer dans le compteur de cellules.
    7. Une fois les cellules comptées, diluez-les dans un milieu de culture pour obtenir une solution de 150 000 cellules/ml et ensemencez les cellules dans une plaque blanche de 96 puits à fond plat clair à raison de 1,5 x 104 cellules/puits. La couleur blanche vise à maximiser la réflexion et la distribution de la lumière à l’intérieur des puits.
      REMARQUE : Le nombre de cellules par puits doit être ajusté en fonction de la lignée cellulaire utilisée. Un test de densité préalable peut être nécessaire pour trouver le bon nombre de cellules à ensemencer.
    8. Préparez deux planches pour chaque temps de lecture de viabilité. Une assiette sera éclairée et une autre restera sombre.
    9. Incuber les plaques pendant 24 h avant le traitement pour permettre la fixation des cellules.
  3. Traitement Rose Bengal
    1. Préparez une solution mère de Rose Bengal en reconstituant la poudre de Rose Bengal dans une solution saline à 10 %. Cette solution doit être préparée juste avant le traitement cellulaire pour éviter toute dégradation du Rose Bengal dû à sa stabilité.
    2. Préparez des solutions de Rose Bengal à des concentrations croissantes (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) en diluant la solution mère de Rose Bengal préalablement préparée dans le milieu de culture cellulaire.
    3. Une fois les solutions préparées, retirer le milieu de culture des plaques contenant les cellules et ajouter 100 μl de solutions de traitement Rose Bengal.
    4. Incuber les cellules avec le traitement Rose Bengal pendant 2 h pour permettre l’internalisation de Rose Bengal.
      REMARQUE : Le temps d’incubation de la solution Rose Bengal peut varier selon la lignée cellulaire utilisée. Il peut être nécessaire d’affiner la cinétique de l’incorporation du Rose Bengal par mesure de fluorescence afin de trouver le bon moment d’incubation pour chaque lignée cellulaire étudiée.
    5. Après 2 h, retirez les solutions de Rose Bengal, lavez les cellules deux fois avec du PBS et ajoutez 100 μL/puits de milieu de culture sans Rose Bengal.
      REMARQUE : Des lavages supplémentaires avec du PBS peuvent être nécessaires pour des concentrations plus élevées de Rose Bengal. Un contrôle visuel peut être effectué pour s’assurer que les cellules ont été correctement lavées. Une fois suffisamment rincé, le PBS ne doit pas prendre une couleur rose en raison de la Rose Bengale présente à l’extérieur des cellules.
    6. Couvrez les microplaques d’une feuille d’aluminium pour les protéger de l’exposition à la lumière. Éclairez la moitié des plaques pour le test PDT (voir étape 2.4). Les plaques non éclairées fourniront des données de contrôle pour les résultats PDT (état sombre). Ils fourniront également des données sur l’impact de la rose bengale non photoactivée sur la viabilité cellulaire. Les autres microplaques seront utilisées pour l’exposition à la lumière dans l’appareil (condition PDT).
  4. Mode d’emploi de l’appareil CELL-LED-550/3
    1. Connectez le connecteur mâle du distributeur de lumière au connecteur femelle de la source lumineuse. Branchez ensuite la source lumineuse sur une prise électrique.
    2. Retirez deux microplaques (PDT + condition sombre) de l’incubateur, retirez l’aluminium pour la condition PDT et placez cette plaque sur le distributeur de lumière.
    3. Réglez le variateur du pilote à son niveau maximal pour maximiser la puissance délivrée par la LED et obtenir un irradiance moyen de 0,62 mW/cm2 sur les 96 puits.
      REMARQUE : Le variateur du pilote doit être réglé sur la valeur la plus appropriée pour les tests biologiques (parmi les trois disponibles). Quel que soit le gradateur du conducteur, le faible irradiance délivré ne nécessite pas l’utilisation de lunettes de sécurité.
    4. Illuminez la plaque jusqu’à ce que la dose de lumière souhaitée sur les cellules soit atteinte. Pour obtenir la dose de lumière souhaitée, deux paramètres peuvent être ajustés, le temps et l’irradiance, en se référant à l’équation suivante :
      Dose lumineuse (J/cm2) = Irradiance (W/cm2) × Temps (s) (équation 1).
      L’irradiance peut être modulée en réglant le variateur du pilote pour obtenir 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 ou 0,62 mW/cm2, respectivement. À partir de l’irradiance choisie, l’équation 1 peut être utilisée pour calculer le temps d’éclairage nécessaire pour atteindre la dose lumineuse cible.
    5. Une fois que la dose de lumière souhaitée a été atteinte, éteignez l’appareil. Remplacez la microplaque PDT en aluminium et remettez-la dans l’incubateur avec la plaque de contrôle jusqu’à ce que le test de viabilité soit effectué.
    6. EN OPTION : Éclairez les autres plaques si nécessaire, en utilisant la même procédure décrite ci-dessus.
  5. Essai de viabilité cellulaire
    1. Après le test PDT, laissez la plaque éclairée dans l’incubateur pendant 24 h avant de mesurer l’impact de la PDT sur les cellules éclairées en mesurant leur viabilité. Le temps d’incubation peut être varié pour étudier les effets à plus ou moins long terme de la PDT sur les cellules. Pour chaque temps d’incubation post-PDT, une plaque non éclairée (état sombre) doit être incubée pendant la même période.
    2. Après la période d’incubation, prendre une plaque éclairée et une plaque non éclairée et ajouter 100 μL de réactif du kit de test de viabilité cellulaire dans chaque puits pour mesurer la viabilité cellulaire en fonction du métabolisme mitochondrial et de la production d’ATP par les cellules.
    3. Incuber le multiplaque dans l’obscurité pendant 10 minutes avant de mesurer la viabilité cellulaire.
    4. Après 10 min d’incubation, lire la luminescence émise dans chaque puits à l’aide d’un lecteur multimodal. La luminescence émise est proportionnelle à la production d’ATP par les cellules vivantes au moment de l’ajout de la solution d’essai de viabilité cellulaire.
    5. Considérez la valeur de luminescence de l’état non traité (NT) comme une viabilité de 100 %, et normalisez les valeurs de luminescence des conditions traitées à l’état NT pour obtenir le pourcentage de viabilité induit par chaque traitement.
    6. Répétez le même protocole de lecture de la viabilité cellulaire pour chaque temps de lecture post-PDT (par exemple, 24 h, 48 h et 72 h après le traitement).

Résultats

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Comme le montre la figure 3, le dispositif CELL-LED-550/3 permet l’éclairage homogène, par le dessous, d’une plaque de 96 puits avec une lumière verte de 550 nm.

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Figure 3 : Images de l’appareil CELL-LED-550/3 lors de l’éclairage illustratif d’une plaque à 96 puits lorsque la lumière ambiante est allumée (A) ou éteinte (B). Adapté de Lefebvre, A. et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Chaque puits est éclairé individuellement et à l’opposé de la LED unique (jusqu’à deux mètres) à l’aide d’un faisceau de fibres optiques (Figure 4).

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Figure 4 : Le faisceau de fibres optiques permettant l’éclairage individuel des puits d’une plaque de 96 puits à l’écart de la LED unique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Pour établir l’efficacité du dispositif CELL-LED-550/3, sa capacité à induire la PDT médiée par RB sur la lignée cellulaire de l’hépatocarcinome HepG2 a été évaluée. Les cellules ont été traitées avec des concentrations croissantes de Rose Bengal, allant de 0 à 100 μM pendant 2 h avant l’illumination. L’utilisation d’une telle gamme de concentrations visait à déterminer la dose efficace (CE50) de Rose Bengal qui tuerait les cellules HepG2 lorsqu’elles étaient exposées à la lumière verte. L’impact de la dose lumineuse délivrée par le dispositif CELL-LED-550/3 sur l’induction de la mort cellulaire dans les cellules HepG2 a également été étudié. Pour ce faire, les cellules ont été exposées à la lumière pendant 8 min 9 s, 16 min 18 s ou 32 min 36 s à une intensité de 0,62 mW/cm2 afin d’obtenir des doses lumineuses de 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 et 1,22 J/cm2, respectivement.

Tout d’abord, il a été observé que l’éclairage seul, en l’absence de Rose Bengal (condition de lumière, figure 5), n’avait aucun effet sur la viabilité des cellules HepG2, quelle que soit la dose de lumière reçue. Il a également été observé que la rose du Bengale seule, en l’absence de lumière (condition RB, figure 5), n’induisait aucun changement dans la viabilité cellulaire pour l’une ou l’autre des conditions testées. En revanche, les résultats montrent que la PDT médiée par RB à l’aide de CELL-LED-550/3 est capable de tuer les cellules HepG2. De plus, une efficacité accrue a été observée en corrélation avec une dose de lumière accrue, avec une concentration efficace maximale (CE50) de 34,3 μM pour une dose légère de 0,30 J/cm2, de 26,6 μM pour une dose de 0,60 J/cm2 et de 6,8 μM pour une dose de 1,2 J/cm2.

Ces résultats ont confirmé l’efficacité de ce nouveau dispositif PDT pour la PDT médiée par RB (Figure 5).

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Figure 5 : Efficacité du dispositif par rapport à la viabilité de la lignée cellulaire HepG2. Pourcentage de viabilité 24 h après le traitement de l’hépatite G2. NT, non traité ; RB, photosensibilisateur uniquement (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM et 100 μM) ; lumière, éclairage pour 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 et 1,22 J/cm2 ; PDT, éclairage avec traitement RB. Les résultats sont présentés sous forme ± moyennes SEM de trois expériences indépendantes, exprimées en pourcentage du NT. Un test ANOVA bidirectionnel a été effectué, avec p ≤ 0,01 (**) ; p ≤ 0,0001 (****) considéré comme statistiquement significatif, et p ≥ 0,05 considéré comme non significatif (NS). Adapté de Lefebvre, A. et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit à la fois le protocole de développement d’un dispositif d’éclairage innovant dédié à la PDT médiée par RB in vitro et le protocole de mise en œuvre d’une preuve de concept pour le dispositif CELL-LED-550/3, ainsi développé30.

CELL-LED-550/3 se compose de deux parties, chacune avec une fonction spécifique. L’objectif de la première partie, appelée partie source lumineuse, est de générer, à partir d’une seule LED, un faisceau de lumière verte homogène d’un diamètre supérieur à celui du faisceau de fibres optiques de la deuxième partie. Cette dernière, appelée partie distributrice de lumière, vise à distribuer, à travers le faisceau de fibres optiques, la lumière fournie par la partie source lumineuse aux puits d’une plaque de 96 puits individuellement et loin de la LED. À une distance de la LED allant jusqu’à 2,5 m, les cellules peuvent être éclairées aussi longtemps que nécessaire sans aucun risque d’effets thermiques nocifs pouvant survenir en raison de la chaleur incontrôlée générée à l’intérieur de la LED.

Cette caractéristique offre un premier avantage significatif du CELL-LED-550/3 par rapport aux autres systèmes à base de LED spécialement conçus pour l’éclairage de plaques à 96 puits 31,32,33,34,35,36. En effet, tous les autres systèmes impliquent un positionnement de la ou des LED à seulement quelques centimètres sous les cellules (généralement en dessous de 5 cm), ce qui est insuffisant pour éliminer le risque d’effets thermiques nocifs liés aux LED pour les cellules. Pour limiter un tel risque, la plupart de ces autres systèmes (malheureusement, certains n’en ont pas) intègrent un système de refroidissement LED 32,34,35 parfois positionné très (trop) près des cellules, qui peuvent alors être contre-productivement affectées par les fluctuations thermiques qui en résultent. La conception de l’appareil CELL-LED-550/3 en deux parties offre un autre avantage significatif par rapport à la plupart des autres systèmes à LED existants 31,32,33,35,36 : cela permet d’éclairer les cellules à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire sans aucun risque pour l’appareil. La partie distributeur de lumière, qui ne comprend aucun composant électronique, peut en effet être placée à l’intérieur de l’incubateur, tandis que la partie source lumineuse, qui comprend les composants électroniques sensibles aux environnements humides, est maintenue à l’extérieur pour prévenir les risques de corrosion ou de défaillance. Certains systèmes existants à base de LED, y compris les composants électroniques, permettent un éclairage à l’intérieur d’un incubateur, mais une telle utilisation, d’une part, n’est pas recommandée par les concepteurs/fabricants et, d’autre part, nécessite un séchage « adéquat » après utilisation33,34. La capacité d’éclairer les cellules à l’intérieur d’un incubateur et donc de maintenir les cellules dans les mêmes conditions physiologiques (température, humidité et concentration de CO2) pendant le protocole est cruciale pour éviter les biais potentiels dans l’évaluation de la viabilité cellulaire après PDT, en particulier pour les protocoles nécessitant de longs temps d’éclairage. Il convient également de souligner que le dispositif CELL-LED-550/3 comprend une seule LED pour éclairer les 96 puits individuellement et simultanément. Cette caractéristique originale et innovante n’est disponible avec aucun des autres systèmes à LED mentionnés ci-dessus 31,32,33,34,35,36. La plupart de ces systèmes comprennent 96 LED, avec une LED placée sous chaque puits, et délivrent donc 96 faisceaux individuels 31,33,34,36 tandis que les systèmes restants délivrent, de 6 à 25 LED positionnées à quelques centimètres de la plaque du puits, un faisceau global couvrant tout ou partie des puits 31,32,35. D’après la littérature, la génération de 96 faisceaux individuels à partir d’une seule LED, comme le fait CELL-LED-550/3 grâce à l’utilisation d’un faisceau de fibres optiques, n’a jamais été proposée auparavant.

La partie source lumineuse comprend une LED 550 nm 3 W sélectionnée selon deux critères principaux. Tout d’abord, le spectre d’émission de la LED (et donc sa longueur d’onde centrale) doit chevaucher le spectre d’absorption du photosensibilisateur RB. Un tel chevauchement, qui est parfaitement réalisé avec la LED sélectionnée (longueur d’onde centrale : 554,4 nm ; FWHM : 106,4 nm ; les deux estimés selon la méthodologie décrite dans Lefebvre et al.30) (Figure 6), sont essentiels pour la photo-activation du RB et donc pour l’induction d’une PDT médiée par le RB. Deuxièmement, la puissance optique de la LED doit être inférieure à 5 W. Cette limitation de puissance est imposée par la puissance admissible de la lentille collimatrice incluse dans la partie source lumineuse et par celle du faisceau de fibres optiques inclus dans la partie distributeur de lumière.

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Figure 6 : Spectre d’absorption du Rose Bengal dans l’eau. Le spectre d’absorption maximal normalisé du Rose Bengal dans l’eau est tracé selon l’axe de gauche, et l’irradiance spectrale moyenne de CELL-LED-550/3 est mise à l’échelle selon l’axe de droite. Le profil de l’irradiance spectrale moyenne est cohérent avec celui de la LED disponible sur le site Web du fabricant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Le couplage optique entre les deux parties de l’appareil est un facteur critique. Ce couplage vise, d’une part, à collecter le maximum de la lumière émise par la LED de 3 W dans un faisceau étroit et, d’autre part, à injecter ce faisceau dans le faisceau de fibres optiques. En ce qui concerne le premier objectif, une lentille de collimation asphérique à courte focale, spécialement conçue pour les LED montées sur PCB (Printed Circuit Board), permet de concentrer le faisceau LED de 120 degrés en un faisceau étroit de 10 degrés avec une distribution spatialement uniforme. De plus, le faisceau résultant projette des images de la puce LED carrée, qui présentent une clarté accrue et des aberrations optiques réduites par rapport à celles obtenues avec le faisceau initial. En ce qui concerne l’injection de ce faisceau étroit dans le faisceau de fibres optiques, quatre points importants doivent être abordés. Tout d’abord, les extrémités proximales des 96 fibres optiques PMMA (polyméthacrylate de méthyle) de 0,5 mm de diamètre (ouverture numérique : 0,2) sont rassemblées dans un connecteur fait maison de sorte qu’elles forment une surface carrée réceptive à la lumière de côtés de 5 mm (Figure 7). Une forme carrée, alignée avec les projections carrées de la puce LED par le faisceau, a été préférée à la forme ronde habituelle pour le connecteur afin de limiter la perte de lumière. Deuxièmement, le connecteur fait maison a été conçu pour ne pas nécessiter de colle et imprimé en 3D à l’aide d’une résine cristalline afin de limiter l’absorption de la lumière et donc d’éviter la surchauffe/carbonisation du matériau. Troisièmement, la surface réceptive à la lumière ainsi que la surface finale du connecteur ont été polies à l’aide d’une roue de polissage afin que le maximum de lumière les traverse. Quatrièmement et enfin, la distance entre la lentille et la surface réceptive de lumière carrée a été déterminée théoriquement, puis ajustée sur un banc optique de sorte que la partie centrale la plus homogène de la projection LED carrée se chevauche un peu plus que la surface réceptive de la lumière.

Avec un tel couplage, une puissance de 1,25 W est obtenue pour le faisceau étroit de 10 degrés, tandis que la puissance totale transmise par le faisceau de 96 fibres optiques est de 0,12 W (un capteur à photodiode adapté à la lumière LED (OPHIR) a été utilisé).

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Figure 7 : Surface carrée réceptive à la lumière obtenue en rassemblant les 96 fibres optiques dans un connecteur fait maison. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

CELL-LED-550/3 fournit un irradiance moyen de 0,62 mW/cm2 (écart type : 0,09 mW/cm2) (Figure 8) à la surface extérieure inférieure des puits. Cette valeur moyenne, qui tient compte de l’efficacité de couplage mentionnée ci-dessus, a été estimée et s’est avérée stable dans le temps (coefficient de variation inférieur à 0,6 %) selon les méthodologies décrites en détail dans Lefebvre et al.30. Avec une irradiance aussi faible (inférieure à celles fournies par les autres systèmes à base de LED spécifiquement conçus pour l’éclairage de plaques à 96 puits), il a été prouvé que l’éclairage seul n’a aucun effet sur la viabilité des cellules HepG2 alors qu’une efficacité très élevée a été atteinte pour la PDT médiée par RB. Pour les protocoles PDT qui nécessitent des irradiances plus élevées pour assurer l’efficacité, plusieurs LED pourraient être utilisées, et donc plusieurs parties de source lumineuse pourraient être mises en œuvre, à condition que la puissance lumineuse injectée dans chaque fibre optique ne dépasse pas la puissance admissible de quelques dizaines de milliwatts.

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Figure 8 : Histogramme représentant la distribution des irradiances délivrées aux 96 puits d’une plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Le remplacement uniquement de la LED dans la partie source lumineuse par une autre appropriée permet d’obtenir un autre appareil CELL-LED. Une LED est considérée comme appropriée si elle émet une puissance optique inférieure à 5 W (pour les raisons mentionnées ci-dessus) dans le domaine visible (selon les spécifications du faisceau de fibres optiques). Comme il existe un nombre important de telles LED, une grande variété de dispositifs CELL-LED pourraient être développés et, par conséquent, de nombreux protocoles PDT pourraient être évalués in vitro. Dans le cas d’un protocole PDT, la LED offrant le meilleur chevauchement avec le spectre d’absorption du photosensibilisateur considéré doit évidemment être préférée parmi toutes les LED appropriées. Dans le cas d’un changement de LED, une attention particulière doit être portée à l’ensemble du dissipateur thermique du ventilateur. En fait, cet ensemble doit être de taille appropriée pour éviter la surchauffe et la dégradation ultérieure de la LED et du pilote. De plus, une nouvelle caractérisation optique et thermique sera nécessaire pour tout changement de LED.

Tant la possibilité de photo-activer la plupart des photosensibilisateurs par simple substitution d’une seule LED, que la possibilité d’éclairer les cellules à l’intérieur d’un incubateur apportent une réelle valeur ajoutée à ce dispositif par rapport aux dispositifs existants.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier l’Hôpital Central de Lille, en France, et l’INSERM pour leur soutien à notre étude.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
550  ; nm 3  ; W LED montée sur une carte de circuit imprimé  ;OSRAMOSTAR KP CSLPM1. F1
Fiole de culture de 75 cm2Sarstedt3911002
Faisceau de 100 fibres optiques en plastique (0,5 mm de diamètre)ARCENCIEL LEDen fibre05EGMBout lumineux PMMA 0,5 dia - Lng  ; 200 m  ;   ;   ;   ; http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
Compteur de cellulesThermoFisherAMQAF2000En option, vous pouvez compter sous microscope
Incubateur de culture cellulairePHCI (Dutscher)MCO-170AICUVD-PE
Titre cellulaire GloPromegaRéférence G7571
Lentille collimative en PMMA transparentBoutique GleccObjectif 14 mm 10° ;Aliexpress - Objectif collimatif DEL avec support 14 mm
Colorfab Ngen NoirColorfab  ; Réf. 020014Conformité FDA au contact alimentaire
Colorfab Ngen BlancColorfab  ; Réf. 020013Conformité FDA au contact alimentaire
Pilote actuel avec gradation trimode (pilote CDM)Pilote CDMBD392200 mA
Résine époxyClé ; OpatreCrystal’DiamondCristal Diamant 150 mL
Ensemble dissipateur de chaleur de ventilateurBOYD
Cellules HepG2ATCCRéf. HB-8065
Lecteur multimodal (CLARIOstar Plus)BMG Labtech430-2927
Solution tampon de phosphateThermoFisher20012-068
Fibres optiques PMMA (polyméthacrylate de méthyle) (ouverture numérique : 0,2)Guangzhou Mayki Lighting Limited
Prise d’alimentationRSpro907-5680
RMPI 1640ThermoFisher21875-091
Interrupteur à bascule  ;RSpro419-744
Rose BengaleThermoFisher / MerckA17053.14 / 330000-1G
Feuille de mylar anti-rayuresRSproRéf. : 785-0802
FourreauAUPROTECTet Oslash ; 8,5 mm / & Oslash ; Ext 11 mmPP Polypropyle è ; gaine ondulée noire résistante aux UV, non fendue
SVFEurobioCVF SVF00-01
Papier calqueCanson79368730
Plaque PMMA transparenteRSproRéf. : 284-6269
Trypan bleuThermoFisher15250061
TrypsineThermoFisher25200-072
Ultimaker 2+Ultimaker
Plaque à fond transparent blanc de 96 puitsDutscher655098

Références

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