Modélisation de l’infection persistante à Pseudomonas aeruginosa chez les larves de poisson-zèbre blessées

Résumé

Il existe actuellement un manque de modèles in vivo permettant le dépistage de médicaments contre les infections bactériennes chroniques. Ici, nous décrivons un protocole d’infection de la plaie par un isolat clinique de Pseudomonas aeruginosa pour générer une infection persistante chez les larves de poisson-zèbre.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène humain majeur, en particulier dans les infections chroniques des plaies et les infections pulmonaires chroniques (en particulier chez les patients atteints de mucoviscidose). Les infections bactériennes chroniques sont réfractaires aux traitements antibiotiques et il existe un besoin urgent de modèles d’infection chronique in vivo se prêtant au criblage de médicaments pour développer des thérapies efficaces. Ici, nous décrivons un protocole d’infection par un isolat clinique de P. aeruginosa provenant d’un patient atteint de mucoviscidose, exprimant constitutivement la protéine fluorescente verte (GFP), pour générer une infection persistante de la plaie chez les larves de poisson-zèbre. Les embryons blessés à la nageoire caudale sont immergés dans une suspension bactérienne pendant 1,5 h, lavés et surveillés pour la charge bactérienne pendant 3 jours. La charge bactérienne a été quantifiée quotidiennement en comptant les unités fluorescentes formant des colonies (UFC) des larves infectées lysées, ce qui a permis une infection persistante. De plus, les bactéries persistantes de P. aeruginosa étaient réfractaires au traitement antibiotique. Ce nouveau modèle in vivo d’infection persistante à P. aeruginosa offre des opportunités pour évaluer l’efficacité de traitements innovants contre les infections chroniques.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène à Gram négatif responsable de la colonisation chronique chez les patients atteints de mucoviscidose (FK) et de plaies ^1,2. P. aeruginosa appartient au groupe des agents pathogènes ESKAPEE et est reconnu par l’Organisation mondiale de la santé comme une priorité critique pour les nouvelles thérapies³. Les infections bactériennes chroniques sont difficiles à traiter avec des antibiotiques en raison de la résistance adaptative aux médicaments, qui est liée à de multiples facteurs, notamment le mode de vie du biofilm, la croissance réduite, la faible activité métabolique⁴, ainsi que le cycle de vie intracellulaire⁵. Les modèles in vivo sont essentiels pour mieux comprendre et traiter l’infection chronique à P. aeruginosa.

Bien que plusieurs modèles in vivo aient été utilisés pour évaluer la virulence de P. aeruginosa , très peu de modèles ont permis d’imiter une colonisation persistante et de tester l’efficacité des traitements sur les infections chroniques⁶. Les modèles animaux pour étudier la pathogenèse chronique de P. aeruginosa reposent principalement sur l’administration de bactéries intégrées dans les billes de gélose dans les poumons⁷. Un modèle murin d’infection cutanée chronique a également été développé⁸. Le poisson-zèbre (Danio rerio), qui présente de nombreux avantages (problèmes éthiques modérés, faible coût, production élevée d’œufs), est un modèle de vertébré in vivo attrayant pour les tests de médicaments, qui permet également une visualisation en temps réel à haute résolution de P. aeruginosa et des cellules hôtes grâce à la transparence de l’embryon⁹.

Comme indiqué dans une revue, dans des études précédentes, les souches de laboratoire de P. aeruginosa (PAO1, PA14 et PAK) ont été principalement utilisées dans le modèle d’infection du poisson-zèbre, où elles ont provoqué une infection aiguë⁹. Nous avons récemment mis au point un protocole d’infection des plaies basé sur l’immersion d’embryons amputés de la nageoire caudale avec la souche PAO1 de P. aeruginosa , qui a provoqué une infection aiguë¹⁰. L’infection par immersion d’embryons blessés, qui reflète un mode d’infection naturel de P. aeruginosa, est un mode d’infection reproductible et plus facile que la microinjection.

Notre objectif était d’établir un protocole d’infection persistante à P. aeruginosa chez le poisson zèbre. À cette fin, notre stratégie a été d’utiliser des souches cliniques de P. aeruginosa, qui ont rarement été prises en compte dans le modèle de poisson zèbre^11,12, combinées à la voie d’infection de la plaie. Ici, nous décrivons le protocole que nous avons développé pour modéliser la colonisation persistante d’embryons de poisson-zèbre à partir d’une infection de plaie par des isolats cliniques de P. aeruginosa CF. Ce nouveau modèle in vivo répond à nos attentes et offre de nouvelles opportunités pour évaluer l’efficacité des traitements dans le contexte d’une colonisation persistante, comme décrit ici et dans un article complémentaire¹³.

Protocole

Toutes les expériences sur le poisson-zèbre décrites dans la présente étude ont été menées à l’Université de Montpellier en suivant les principes des 3R - Remplacement, Réduction et Raffinement - selon les directives de l’Union européenne pour la manipulation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par la Direction Sanitaire et Vétérinaire de l’Hérault et le Comité d’Ethique pour l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques sous la référence CEEA-LR-B4-172-37. Toutes les expériences d’infection ont été réalisées sur des embryons jusqu’à 5 jours après la fécondation. L’élevage du poisson-zèbre adulte (Danio rerio) à partir des poissons AB ou Golden Lines a respecté les directives internationales spécifiées par la directive européenne sur la protection des animaux 2010/63/UE. Installation de poisson-zèbre de l’Université de Montpellier avec des conditions standard définies comme un cycle lumière/obscurité de 12 h :12 h, réservoir en polycarbonate de 3,5 L (maximum 22 poissons par réservoir) connecté à un système de recirculation avec une salinité de 4 % / conductivité de 400 μS et une température de l’eau de 28 °C. Les poissons ont été nourris 2 fois par jour avec de la nourriture pour poissons.

1. Préparation des solutions

1. Préparez une solution de travail 1x pour l’eau de poisson avec ou sans bleu de méthylène pour la croissance des embryons de poisson-zèbre (voir tableau 1).
2. Préparez 20 fois la solution mère (0,4 %) et 1 solution anesthésique de tricaïne fonctionnelle comme décrit dans le tableau 1. Pour éviter la congélation et la décongélation répétées de la solution mère, préparer 10 mL d’aliquotes de tricaïne 20x et les conserver à -20 °C.
3. Préparez une solution de triton à 2 % diluée dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; Tableau 1).

2. Préparation de l’inoculum de  P. aeruginosa fluorescent exprimant la GFP de manière constitutive

REMARQUE : Tous les travaux avec P. aeruginosa sont effectués avec les précautions BSL-2 dans une enceinte de biosécurité. Les souches de P. aeruginosa doivent être génétiquement modifiées pour exprimer constitutivement un rapporteur fluorescent, tel que la GFP (tel qu’utilisé ici et décrit en¹³). L’utilisation de souches avec un rapporteur fluorescent codé chromosomiquement est fortement recommandée pour éviter la perte de plasmide dans le cas d’un rapporteur fluorescent codé par plasmide.

1. 2 jours avant l’infection, faire prélever à partir de -80 °C un stock de P. aeruginosa génétiquement modifié exprimant la GFP sur des plaques de gélose LB (tableau 1) et incuber toute la nuit à 37 °C.
2. Vérifier la fluorescence des colonies à l’aide d’un microscope à fluorescence (grossissement 6x) pour inoculer une colonie GFP⁺P. aeruginosa dans 1 mL de bouillon LB (tableau 1) et faire croître pendant la nuit à 37 °C en agitant (180 tr/min).
3. Le jour de l’infection, diluer la culture de nuit de P. aeruginosa ci-dessus à 1:20 dans 5 mL de bouillon LB frais. Cultivez les bactéries à 37 °C en secouant (180 tr/min) jusqu’à ce que la culture atteigne une DO₆₀₀ = 0,8. Cela devrait prendre environ 2-3 h.
4. Centrifuger la culture bactérienne pendant 10 min à température ambiante (RT) à 3584 x g. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 4 mL d’eau de poisson sans bleu de méthylène.
5. Adapter le volume de culture avec de l’eau de poisson pour avoir 7 x 10⁷ à 1 x 10⁸ UFC/mL. Cela correspond à une DO₆₀₀ d’environ 0,15 (à adapter pour chaque souche).
6. Pour quantifier l’inoculum, procéder à une dilution en série de la suspension bactérienne, déposer 20 μL de la dilution ^10-4 sur une plaque de gélose LB et incuber pendant une nuit à 37 °C.
7. Comptez les colonies GFP⁺ au microscope fluorescent pour déterminer les UFC de l’inoculum.

3. Collecte et préparation des embryons de poisson-zèbre

1. 3 jours avant l’expérience d’immersion bactérienne, mettez en place des couples reproducteurs de poissons-zèbres. Placez un mâle et une femelle reproducteurs dans un bassin de croisement.
2. Le lendemain matin, récupérez les œufs après la fécondation à l’aide d’une passoire à mailles fines. Placez les œufs collectés dans une boîte de Pétri contenant de l’eau de poisson avec du bleu de méthylène.
3. Pour éviter la contamination, ajoutez 1 goutte d’eau de Javel dans la boîte de Pétri. Après 5 min, changez l’eau du poisson avec du bleu de méthylène pour enlever l’eau de Javel.
4. Jetez les ovules dont le développement embryonnaire est anormal (les ovules non fécondés sont similaires à un stade d’œuf à 1 cellule) ou les ovules morts (aspect blanc).
5. Le matin de l’infection (à 2 dpf), déchorionner les embryons à l’aide de deux pinces très fines sous le stéréomicroscope (grossissement 11x). Déchirez le chorion à l’aide d’une pince sans pincer l’embryon afin de le libérer.
6. Placez les embryons déchoionnés dans une boîte de Pétri contenant du poisson avec du bleu de méthylène. Incuber les plats à 28 °C jusqu’à l’infection.

4. Lésion de l’embryon

1. Anesthésier les embryons de poisson-zèbre dans de l’eau de poisson sans bleu de méthylène, contenant 0,02 % de tricaïne, environ 5 minutes avant la blessure dans une boîte de culture cellulaire (35 mm x 10 mm). Les embryons ne bougent plus et ne répondent plus aux stimuli.
2. Placez des aiguilles 25G sur le dessus de deux baguettes pour faciliter la manipulation des aiguilles.
3. Au stéréomicroscope, éliminez les embryons au développement anormal ou morts. À l’aide d’un mouvement circulaire de la parabole, rassemblez tous les embryons au centre.
4. Isolez les embryons un par un à l’aide de deux aiguilles en position verticale (tête vers le bas - queue vers le haut) et placez l’aiguille gauche au niveau de la queue pour la maintenir droite. Coupez l’aileron au bord de la notocorde avec l’aiguille droite. Faites la coupe en une seule fois. Ne pas dépasser 10 min entre la découpe et l’immersion dans la solution bactérienne.

5. Infection des embryons blessés

1. Dans l’enceinte de sécurité biologique de type II, agiter et ajouter la solution de P. aeruginosa à environ 1 x 10⁷ UFC/mL dans une plaque à 6 puits.
2. Prélevez les embryons blessés à l’aide d’une pipette jetable en verre Pasteur et ajoutez-les à la solution bactérienne sous le poteau de sécurité microbiologique. Incuber la plaque à 28 °C pendant 1,5 h.
   REMARQUE : Si un grand nombre de larves infectées sont nécessaires, faites des groupes d’environ 50 larves, faites la plaie, immergez-les et répétez l’opération pour le groupe suivant.
3. Après l’infection, lavez les embryons sous le poteau de sécurité microbiologique comme décrit ci-dessous.
   1. Transférez les embryons à l’aide d’une pipette en verre pour les laver dans 10 ml d’eau de poisson sans bleu de méthylène, en ajoutant le moins de liquide possible, pendant 30 minutes à température ambiante.
   2. Transférez à nouveau les embryons infectés à l’aide d’une pipette en verre pour un deuxième lavage dans 4 mL d’eau de poisson sans bleu de méthylène pendant quelques minutes.
   3. Transférez 24 embryons infectés individuellement dans une plaque multipuits avec 1 mL d’eau de poisson sans bleu de méthylène.
4. Placez les assiettes dans une boîte en plastique dans l’incubateur à 28 °C. Humidifiez le boîtier (avec des essuie-tout humides, par exemple) pour limiter l’évaporation.

6. Survie des embryons infectés

1. Pour les études de survie embryonnaire, vérifiez la viabilité au stéréomicroscope à 18 h, 24 h et 48 h après l’infection (hpi). Un embryon est considéré comme mort lorsque le cœur et la circulation sanguine cessent.
2. Représenter les taux de mortalité/survie à l’aide de représentations graphiques en escalier de Kaplan-Meier (GraphPad Prism 8.3.0) et analyser les données à l’aide d’un log-rank ou d’autres tests statistiques appropriés.

7. Calcul de la charge bactérienne dans les embryons infectés (Figure 1)

1. Effectuer le dosage des UFC à partir d’embryons infectés à quatre moments différents : 1,5 hpi, c’est-à-dire directement après l’infection, et après chaque lavage à 24, 48 et 72 hpi avec 5 embryons/point temporel. Effectuez toutes les étapes sous le poteau de sécurité microbiologique.
2. Préparez pour chaque larve infectée des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 95 μL de 1x PBS. Le volume des larves est d’environ 5 μL.
3. Transférez les larves dans une plaque à 6 puits avec 4 mL d’eau de poisson sans bleu de méthylène pour effectuer un lavage et éliminer les bactéries planctoniques.
4. Placez chaque embryon dans un tube de microcentrifugation contenant du PBS, en ajoutant le moins de liquide possible. Il suffit de toucher la pipette en verre contenant les larves à la surface du PBS pour permettre aux larves de s’enfoncer dans le tube de la microcentrifugeuse sans ajouter de liquide.
5. Écrasez les embryons individuellement à l’aide d’un pilon situé sur le côté du tube de microcentrifugation. Gardez le pilon à l’intérieur du tube. Déterminez le point final lorsqu’il n’y a plus d’embryon intact.
6. Soulevez le pilon et ajoutez 100 μL de PBS-Triton 2 % pour rincer toute bactérie résiduelle du pilon (la concentration finale est de 1 %). Vortex et attendez 10 min. Ne traitez pas plus de cinq embryons en même temps.
7. Déposez 3 fois 10 μL de lysats non dilués sur des plaques de gélose LB pour chaque embryon. Faites une dilution en série des lysats dans une plaque de 96 puits jusqu’à ce qu’une dilution ^{de 10-3} soit atteinte à l’aide d’une pipette multicanaux. Déposez 3x, 10 μL de dilution ^10-1, ^10-2 et ^10-3 à côté des non dilués sur des plaques de gélose LB et incubez les plaques pendant la nuit à 37 °C.
8. Comptez les colonies fluorescentes de chaque dilution au microscope et calculez l’UFC par embryon infecté.

Figure 1 : Chronologie expérimentale de l’évaluation de la virulence et de la persistance bactériennes dans l’embryon de poisson-zèbre. Abréviations : UFC = Unités formant colonie, hpi = heures après l’infection. Le dessin a été réalisé avec BioRender.com. Le chiffre a été modifié au lieu de¹³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Test du traitement contre l’infection persistante (figure 2)

1. Préparez des solutions antibiotiques à 40 fois la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la souche P. aeruginosa . Avant l’expérience, vérifiez que la concentration d’antibiotique choisie n’est pas toxique pour l’embryon.
2. Suivez les étapes 7.1 et 7.2. Placez 1 ml d’eau de poisson avec des antibiotiques dans une plaque de 24 puits et faites un contrôle sans antibiotiques.
3. Transférez cinq embryons de l’étape de lavage par traitement dans la plaque à 24 puits, en ajoutant le moins de liquide possible.
4. Incuber avec les antibiotiques pendant 30 min à température ambiante. Revenez à l’étape 7.3. pour quantifier la charge bactérienne après traitement.

Figure 2 : Procédure expérimentale utilisée pour évaluer l’efficacité des traitements antibiotiques sur des embryons infectés. Abréviations : ATB 30' = traitement antibiotique pendant 30 min, UFC = unités formant colonie, hpi = heures après l’infection. Le dessin a été réalisé avec BioRender.com. Le chiffre a été modifié au lieu de¹³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

L’embryon de poisson-zèbre est un modèle approprié pour surveiller une infection persistante par des isolats de P. aeruginosa FK
Nous avons utilisé le mode d’immersion d’embryons blessés pour évaluer in vivo la virulence de trois isolats de mucoviscidose (A6520, B6513 et C6490)⁹. Nous avons également évalué le comportement d’un isolat de FK tardive bien caractérisé, RP73, connu pour sa colonisation à long terme dans les voies...

Discussion

La modélisation de l’infection chronique bactérienne in vivo est essentielle pour comprendre la pathogenèse et évaluer l’efficacité du traitement. Ici, nous avons établi un modèle d’infection persistante chez le poisson-zèbre adapté pour tester des médicaments contre P. aeruginosa. Cela comble le vide de la méthodologie actuelle en raison du manque de modèles in vivo susceptibles de traiter les infections bactériennes chroniques. Notamment, ce modèle imite une ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Méthanesulfonate d’éthyl-3-aminobenzoate	Sigma	E50521
Granulé de piston	Eppendorf, Dutscher	33522
sels marins	Instant Ocean, Systèmes d’aquarium   ;	218035
Triton	Euromedex	2000-B