Article de méthode

Dissection rapide et dissociation de l’épithélium olfactif de souris pour des suspensions à noyau unique

DOI :

10.3791/68472

⸱

1 août 2025

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1Genetics and Genomics Graduate Program, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 4Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 5Cytometry and Cell Sorting Core, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article fournit un protocole simplifié pour la dissection et la dissociation de l’épithélium olfactif murin à des fins de séquençage de l’ARN à noyau unique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’épithélium olfactif murin est le point d’entrée initial du système olfactif, abritant divers types de cellules, notamment les neurones sensoriels olfactifs, leurs progéniteurs régénérateurs et les cellules de soutien. Les neurones sensoriels olfactifs transduisent les odorants chimiques en signaux neuronaux, mais les mécanismes sous-jacents à la façon dont ces cellules se développent et se renouvellent, créent des synapses avec le bulbe olfactif et régulent leurs récepteurs odorants restent des domaines d’étude intense. Situé sur la face dorsale de la cavité nasale, l’épithélium olfactif adhère à des structures osseuses complexes appelées cornets. Cette anatomie pose des défis uniques pour son extraction et sa dissociation, en particulier dans le contexte de la préparation de suspensions unicellulaires viables. Étant donné que les protocoles de suspension unicellulaire impliquent souvent des étapes préparatoires (par exemple, la dissociation de la papaïne, FACS) qui peuvent stresser la viabilité cellulaire et/ou retarder la préparation de la banque, il est crucial de minimiser le temps d’extraction tissulaire. Cet article présente une méthode simplifiée pour la dissection rapide de l’épithélium olfactif et un protocole pour générer des suspensions mononucléiques de haute qualité.

Introduction

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L’épithélium olfactif murin (OE) est un composant essentiel du système olfactif et est responsable de la détection et de la transmission des signaux odorants dans le système nerveux central. Sa couche la plus superficielle contient les cils détectant les odeurs des neurones sensoriels olfactifs, qui sont recouverts d’une couche de mucus et entourés par les cellules sustentaculaires et microvillanesde soutien 1,2. Les OSN sont bipolaires, étendant leurs cils apicalement pour former un réseau dans la couche de mucus et leurs axones à la base à travers la plaque cribriforme osseuse pour fusionner en glomérules dans le bulbe olfactif. Ces glomérules sont le site des synapses entre les OSN et les neurones en aval. Les cellules progénitrices neuronales appelées cellules basales globuleuses reconstituent constamment les OSN lorsqu’elles meurent3 suite à une exposition directe à des agressions environnementales telles que les toxines en suspension dans l’air, les agents pathogènes et les traumatismes physiques. Les cellules basales globuleuses sont dérivées d’un pool de réserve de cellules basales horizontales multipotentes 4,5, situées le plus basalement et adhérentes à la lame basale des protubérances osseuses appelées cornets nasaux. Les cornets nasaux sont tortueux, ce qui rend l’OE difficile à séparer et à homogénéiser. De plus, l’OE est entouré d’os du crâne, ce qui rend l’accès à la zone difficile et nécessite traditionnellement une procédure chronophage.

Des études antérieures se sont appuyées sur une incubation prolongée de papaïne pour libérer l’épithélium olfactif de l’os6, 7, 8, 9, 10, ce qui peut retarder davantage le traitement en aval de la suspension unicellulaire. Étant donné que le cisaillement des axones OSN déclenche l’apoptose11, il est impératif de minimiser le temps écoulé entre l’extraction des tissus et la préparation de la banque d’ADNc. De plus, l’architecture de l’OE et ses projections vers le bulbe olfactif compliquent l’extraction de cellules intactes pour un séquençage réussi de l’ARN unicellulaire. Heureusement, le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq) est devenu un outil puissant pour profiler les cellules tout en préservant la distribution des types cellulaires, en particulier dans les tissus où la dissociation d’une seule cellule est difficile ou peupratique12,13.

Bien qu’un certain nombre d’étudesaient effectué un séquençage unicellulaire de l’OE de la souris, aucune n’offre une procédure de dissection détaillée optimisée pour une collecte cohérente et rapide de tissus, ce qui est nécessaire compte tenu de la fragilité de l’OE et de son enfermement dans divers os du crâne. De plus, les guides de dissectionexistants 16 se concentrent sur la préservation de la structure anatomique plutôt que sur la vitesse, ce qui peut entraîner des temps de dissection potentiellement longs. Étant donné qu’une préparation tissulaire efficace est essentielle pour minimiser la dégradation de l’ARN et maximiser la qualité des noyaux préparés17,18, un protocole optimisé pour la dissection rapide et l’homogénéisation de l’OE murin en une suspension mononucléaire pour une utilisation dans diverses applications en aval est justifié.

Ce protocole (Figure 1) présente une méthode simplifiée conçue pour surmonter ces défis, permettant la dissection rapide de l’OE murin et la dissociation efficace du tissu dans le but d’isoler les noyaux. Cette approche facilite le séquençage d’un seul noyau de haute qualité19, fournissant une technique fiable pour étudier les fondements moléculaires de la biologie olfactive.

figure-introduction-1
Figure 1 : Anatomie des sutures et des os pertinents du crâne de souris C57BL/6 et coupe transversale représentative de l’épithélium olfactif. (A) Les sutures du crâne sont codées par couleur. Les sutures sont codées par couleur d’un côté du crâne, tandis que l’autre côté n’est pas marqué pour référence (à gauche). Les noms des sutures sont codés par couleur en conséquence (à droite). (B) Os du crâne codés par couleur. Les os sont codés par couleur d’un côté du crâne, tandis que l’autre côté n’est pas marqué pour référence (à gauche). Les noms des os sont codés en couleur en conséquence (à droite). (C) Coupe transversale de la partie centrale de l’OE (disséquée à l’aide de la méthode décrite dans cet article) avec les cornets codés par couleur d’un côté et le côté gauche non marqué pour référence (à gauche). Noms des cornets visualisés (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux de cette étude ont été approuvées et menées conformément à l’IACUC du Baylor College of Medicine. Des souris femelles C57BL/6J (JAX :000664) ont été utilisées. Les détails des réactifs et de l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Dissection de l’épithélium olfactif

  1. Commencez par anesthésier profondément la souris à l’aide de la méthode de votre choix (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par pincement ferme de l’orteil et procéder à une perfusion transcardiaque d’au moins 10 ml de PBS 1x glacé. Retirez la peau pour exposer le crâne (Figure 2A).
    REMARQUE : Le retrait de la tête du corps est facultatif. Si l’on décide d’enlever la tête, il est recommandé d’enlever la peau et les autres tissus mous autour du crâne avant la décapitation.
  2. À l’aide d’une paire de ciseaux fins à pointe pointue, faites deux incisions pour briser les arcs zygomatiques de l’os squamosal bilatéralement en plaçant une pointe de ciseau dans l’orbite postérieure et l’autre adjacente au conduit auditif (lignes vertes sur la figure 2B).
  3. Faites une incision peu profonde d’une orbite à l’autre le long de la face la plus antérieure de l’os frontal. Incisez uniquement la surface dorsale de l’os frontal (~1-2 mm de profondeur), en prenant soin de ne pas couper les structures sous-jacentes ou les os qui composent l’orbite (ligne bleue sur la figure 2B).
    REMARQUE : Pour obtenir une incision peu profonde entre les orbites, tenez les ciseaux perpendiculairement au crâne et utilisez uniquement les pointes pointues pour couper.
  4. Coupez le long de la ligne médiane du crâne à partir du foramen magnum, à travers les sutures sagittales et interfrontales, jusqu’à ce que l’incision interorbitaire pratiquée dans l’os frontal à l’étape 1.3 soit atteinte (ligne rouge sur la figure 2B).
  5. Insérez une paire de pinces dans l’incision pratiquée le long de la ligne médiane du crâne et tirez fermement un hémisphère de la voûte crânienne latéralement. Cette action enlèvera également les os de l’orbite (frontal, maxillaire et lacrymal), exposant les aspects latéraux des cornets olfactifs (Figure 2D).
    REMARQUE : Veillez à ne pas endommager par inadvertance l’OE à partir de ce moment.
  6. En tenant l’os nasal et les incisives, brisez la voûte crânienne controlatérale à l’aide d’une pince. Permettre à l’encéphale (y compris les bulbes olfactifs) d’être enlevé avec l’hémisphère de l’os au fur et à mesure qu’il est arraché (Figure 1E). Les seules structures osseuses visibles qui devraient rester après cette étape sont la base du crâne et les os entourant l’OE (Figure 2F).
  7. À l’aide d’une pince à os ou d’un rongeur, retirez l’os frontal et l’os prémaxillaire (incisif) restants jusqu’à la base des incisives (figure 2G).
  8. Utilisez une pince osseuse pour couper le long de la suture fronto-nasale afin de libérer l’os nasal de la plaque cribriforme, en prenant des précautions extrêmes pour ne pas endommager l’OE exposée sous-jacente ou fracturer la plaque cribriforme.
  9. Soulevez l’os nasal de la plaque cribriforme à l’aide d’une pince pour exposer l’OE (Figure 2H). Si l’os prémaxillaire résiduel masque l’OE dorsal, retirez-le avant de continuer (cercles noirs sur la figure 1I).
  10. À l’aide d’une pince à pointe fine, fixez doucement la face dorsale de la cloison nasale à sa jonction avec la plaque cribriforme et tirez vers l’arrière (Figure 2J,K). Avec une résistance minimale, l’épithélium olfactif principal se détachera sous la forme d’une structure entièrement intacte (Figure 2L).
  11. Procédez immédiatement à la dissociation de l’OE ou congelez le tissu pour un traitement ultérieur.

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Figure 2 : Technique de dissection rapide de l’épithélium olfactif. (A) La tête de souris après l’ablation des tissus mous environnants. (B) Guides à code couleur pour les incisions de la voûte crânienne. (C) Aspect après incisions de la voûte crânienne. (D) Retrait du premier hémisphère de la voûte crânienne ainsi que de la partie de l’orbite adjacente à l’épithélium olfactif. (E) Ablation de la partie controlatérale de la voûte crânienne ainsi que du cerveau. (F) La tête après l’ablation du cerveau et de la voûte crânienne. (G) Ablation de l’os frontal le plus antérieur et du prémaxillaire postérieur, à la suite d’une incision au niveau de la suture frontomaxillaire. (H) Ablation des os du nez. (I) Les cercles noirs mettent en évidence les zones d’os prémaxillaire résiduel qui peuvent être enlevées en option. (J) Mise en place d’une pince pour l’ablation de l’épithélium olfactif intact. (K) Tirez vers l’arrière pour libérer l’épithélium olfactif. (L) Libération totale de l’épithélium olfactif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Dissociation de l’épithélium olfactif et isolement d’un seul noyau

  1. Placez un tube C et deux tubes coniques de 15 ml par échantillon sur de la glace.
  2. Préparez le tampon de lyse en ajoutant un inhibiteur d’ARNase (à une concentration finale de 0,2 U/μL) dans un tampon d’extraction de noyaux préfabriqué.
  3. Ajouter 4 ml de BSA à 1 % dans chaque tube conique de 15 mL, agiter brièvement et jeter l’excédent. Celui-ci recouvre chacun des tubes coniques de 15 mL avec du BSA pour minimiser l’adhérence des noyaux au tube.
  4. Pour un OE entier, ajoutez 2 mL de tampon de lyse glacé dans chaque tube C.
  5. Ajoutez des échantillons OE aux tubes C. À l’aide de la pince #2, tenez chaque échantillon sur son tube C respectif et coupez-le en petits morceaux à l’aide d’une paire de ciseaux à pointe fine.
  6. Placez les tubes C contenant chaque échantillon à l’envers sur les blocs de dissociation tissulaire automatisés. Sur l’écran du dissociateur, le carré correspondant à chaque bloc passera de Libre à Sélectionné.
  7. Appuyez sur l’icône du dossier pour accéder au dossier Miltenyi . À l’aide des flèches, faites défiler jusqu’au programme 4C_nuclei_1 (un programme préchargé dans le dissociateur). Appuyez sur OK pour appliquer le programme à chaque bloc, puis appuyez sur Démarrer pour commencer le cycle. Retirez les tubes C du dissociateur immédiatement après la fin du cycle.
    REMARQUE : Si possible, gardez les tubes C glacés pendant le cycle de dissociation. Il est important de retirer les échantillons du dissociateur immédiatement après la fin du cycle et de passer aux étapes suivantes du protocole pour éviter une surlyse des noyaux.
  8. À l’aide d’une pipette, aspirez la suspension homogénéisée du tube C et filtrez-la à travers une crépine de 70 μm dans le premier tube conique revêtu de BSA. Évitez d’aspirer les fragments d’os qui se sont accumulés au fond du tube C.
  9. Rincez la passoire avec 1 mL de 1x PBS glacé pour assurer une filtration complète.
  10. Centrifuger la suspension filtrée à 500 × g pendant 5 min à 4 °C dans une centrifugeuse à godets oscillants.
  11. Aspirez doucement et jetez le surnageant, en prenant soin de ne pas déranger le granulé. Remettre complètement en suspension la pastille de noyaux dans 1 mL de PBS 1x glacé par pipetage doux.
  12. Passez les noyaux remis en suspension à travers une crépine de 30 μm dans le deuxième tube conique revêtu de BSA. La concentration des noyaux peut être quantifiée à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
  13. Procéder immédiatement avec le protocole en aval choisi (avec ou sans FACS) pour préserver l’intégrité de l’échantillon et prévenir sa dégradation (Figure 3).
    REMARQUE : Il est fortement recommandé aux utilisateurs d’effectuer des exécutions d’entraînement de l’ensemble de ce protocole pour garantir une exécution transparente et rapide.

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Figure 3 : Flux de travail de dissociation de l’épithélium olfactif et d’isolement d’un seul noyau. Suite à la dissection, l’épithélium olfactif est dissocié mécaniquement et chimiquement. Le lysat est ensuite filtré à travers une passoire de 70 μm, rincé avec 1x PBS et centrifugé à 500 × g pendant 5 min. Le granulé est remis en suspension dans 1x PBS avant d’être filtré à travers une passoire de 30 μm. La suspension de noyaux résultante est disponible pour diverses applications de séquençage en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

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Afin de fournir un contexte anatomique pour la dissection et l’analyse, les sutures et les os du crâne de souris C57BL/6, ainsi que la partie centrale de l’épithélium olfactif (OE), ont été visualisés et codés par couleur (Figure 1). Un côté de chaque image a été annoté pour mettre en évidence les sutures, les os et les cornets pertinents, tandis que l’autre côté n’a pas été marqué pour référence. La coupe transversale de l’OE a été préparée conformément aux protocoles établis

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Discussion

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La procédure décrite ici permet l’ablation systématique d’une OE intacte après une perfusion intracardiaque 1x PBS. Cela représente une amélioration notable de la vitesse par rapport aux méthodes précédentes16 et est particulièrement important étant donné que les OSN commencent à dégénérer après l’axotomie2, qui se produit lors de l’ablation du cerveau.

L’ablation soigneuse des os frontaux, prémaxillaires et nasa...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent que cette recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier le Baylor College of Medicine Single Cell Genomics Core. Ce projet a été soutenu par la Cytometry and Cell Sorting Core du Baylor College of Medicine avec un financement des NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 et SS10 RR024574) et l’aide experte de Joel M. Sederstrom. Ce projet a été financé en partie par le NIH/NICHD [P50HD103555], le NIH/NINDS [5R01NS078294] et le NIH/NIA [5F30AG076265]. La figure 3 est créée dans BioRender. https://BioRender.com/5418352.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à centrifuger de 15 mlCelltreat229411
Pince à os  ;Outils scientifiques fins16102-11
Ciseaux à iris miniatures Bonn  ;Miltex  ;18-1392
Solution d’albumine sérique bovineSigma-AldrichA1595
Dumont #3 Forceps  ;Outils scientifiques fins11231-30
Souris femelles C57BL/6JLe Laboratoire JacksonJAX : 000664
Tubes McS C  ;Miltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator  ;Miltenyi Biotec130-096-427
MACS SmartStrainers 30 μnbsp ;Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers 70 um  ;Miltenyi Biotec130-098-462
Micro Friedman-Pearson RongeursOutils scientifiques fins16220-14
Tampon d’extraction des noyaux  ;Miltenyi Biotec130-128-024
Saline tamponnée au phosphate (PBS), 1x sans calcium ni magnésium, PH 7,4 ± ; 0.1CorningRéférence 21-040-CV
Inhibiteur protecteur de l’ARNase  ;Millipore Sigma3335402001
Centrifugeuse réfrigérée Sorvall Legend XTRThermo Scientific50119927-5

Références

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Mots-clés

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