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Article de méthode

Un modèle d’explant ex vivo pour étudier les interactions gliales dans la rétine de la souris

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DOI :

10.3791/68482

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15 juillet 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée pour isoler la rétine de l’œil de la souris pour une expérimentation ex vivo étendue. Ce protocole vise à rendre cette approche techniquement exigeante accessible aux chercheurs qui souhaitent tirer parti des avenues de recherche offertes par le maintien de la glie rétinienne in situ dans les tissus vivants.

Résumé

Le rôle de la glie dans le glaucome est un sujet de recherche de plus en plus important, mais on ignore encore beaucoup de choses sur la façon dont les populations de ces cellules de soutien - à savoir les astrocytes et la microglie - influencent la survie des cellules ganglionnaires rétiniennes. Bien que les modèles in vivo et in vitro fournissent un certain degré d’éclairage, les deux approches présentent des limites importantes, telles que l’impact de la réponse immunitaire périphérique dans le cas de la première et les changements de la fonction physiologique induits par l’isolement cellulaire et la culture dans le cas de la seconde. Pour minimiser ces facteurs de confusion, nous avons développé un système d’explant rétinien ex vivo dans lequel les astrocytes, la microglie et d’autres types de cellules rétiniennes peuvent être maintenus in situ pendant des périodes d’au moins 3 jours, ce qui permet une investigation ciblée à un débit plus élevé que ce qui est généralement réalisable avec des modèles in vivo . De manière cruciale, cette approche se prête très bien à des méthodologies qui seraient difficiles ou irréalisables chez un animal vivant, mais reste compatible avec les tests courants en aval du tissu nerveux intact. Ici, nous présentons un protocole adapté à l’isolement et à la culture d’explants rétiniens intacts, ainsi que des résultats représentatifs de la microscopie d’immunofluorescence documentant les changements subis par les cellules gliales et ganglionnaires rétiniennes dans la rétine ex vivo .

Introduction

La rétine sensible à la lumière, une extension du système nerveux central (SNC) située à l’arrière de l’œil, est essentielle à la vue, mais vulnérable à la fois aux blessures aiguës et aux maladies chroniques. Comme pour d’autres régions du SNC, les neurones de la rétine adulte ne sont pas remplacés lorsqu’ils sont perdus, et les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) qui agrègent et relaient les informations visuelles au cerveau sont particulièrement vulnérables au dysfonctionnement et à la mort dans le glaucome, entraînant une perte de vision irréversible 1,2. Le glaucome est l’une des principales causes de cécité dans le monde3, mais malgré l’impact dévastateur sur les personnes touchées et les coûts globaux pour la société, il reste encore beaucoup d’inconnues sur la façon dont les premiers stades de la maladie contribuent à la perte de CGR4. Le rôle de la glie est un domaine d’investigation majeur dans la physiopathologie du glaucome, car ces cellules de soutien non neuronales sont essentielles à la survie du CGR5 mais subissent des changements phénotypiques de la maladie qui peuvent diminuer le comportement bénéfique6 ou même conduire à l’adoption de phénotypes délétères7. Bien que le terme glie englobe une gamme de types de cellules spécialisées dans le SNC8, celles-ci peuvent être largement divisées en deux catégories : celles qui partagent une lignée de développement avec les neurones et fournissent un soutien trophique, énergétique et structurel9, et celles d’origine myéloïde, qui effectuent des tâches spécialisées de surveillance immunitaire et de réponse10. Les représentants des deux catégories - astrocytes et cellules de Müller dans les premiers, microglie dans les seconds - peuplent la rétine5 et subissent des modifications majeures du glaucome qui soulèvent des questions importantes sur leur rôle dans la progression de la maladie et la survie des CGR11.

Les efforts pour répondre à ces questions sont entravés en partie par des caractéristiques intrinsèques de la glie rétinienne qui présentent des défis pour l’investigation in vivo et in vitro. Contrairement aux neurones, ils sont relativement silencieux électriquement, ce qui rend les approches telles que l’ERG qui permettent l’évaluation fonctionnelle des CGR et des photorécepteurs in vivo inadaptées à l’étude des changements dans la fonction gliale et le comportement. Et bien qu’il existe des modèles inductibles12 et13 modèles spontanés de glaucome, il reste encore beaucoup d’inconnues sur les changements de la glie aux premiers moments de la maladie, qui peuvent précéder la perte détectable de CGR, un problème aggravé par la pénétrance variable de l’état de la maladie dans bon nombre de ces modèles. De plus, les preuves cliniques et expérimentales du glaucome suggèrent des contributions des cellules immunitaires périphériques qui peuvent être difficiles à désambiguïser de celles de la microglie, malgré les indicateurs indiquant qu’elles peuvent agir dans différentes « directions » pour influencer la progression de la maladie14,15.

L’étude de la glie rétinienne in vitro présente également de nombreux défis. Bien que l’isolement et la culture des astrocytes16,17 et de la microglie18 du cerveau soient bien établis, des travaux récents mettent en évidence une hétérogénéité gliale étendue entre les régions du SNC, en particulier dans les astrocytes19, et les phénotypes présents dans une région peuvent ne pas être présents dans la glie d’une autre, comme la rétine20,21. Cependant, l’isolement direct des astrocytes rétiniens et de la microglie pour l’étude est particulièrement difficile, car les deux types de cellules sont relativement clairsemés - chacun représentant moins de 1 % des 6,5 millions de cellules estimées dans la rétine de la souris 22,23,24. De plus, contrairement aux neurones, les cellules gliales sont très plastiques et s’adaptent rapidement aux changements spectaculaires de leur environnement 16,18,25 ; Par conséquent, les comportements observés dans ces cellules in vitro peuvent représenter des adaptations spécifiques à leur nouvel environnement plutôt que des modèles phénotypiques qui seraient généralement observés dans le domaine de la santé ou de la maladie. Étant donné les limites de l’expérimentation in vivo et de la culture primaire de la glie rétinienne, nous avons recherché une approche intermédiaire - les explants rétiniens - dans laquelle la glie, les CGR et d’autres éléments de la rétine sont préservés in situ dans un contexte ex vivo. Par rapport aux modèles in vivo, cette approche offre un parcours temporel expérimental abrégé26, permet une manipulation expérimentale directe de la glie rétinienne27 et évite l’influence potentiellement confondante de l’infiltration des cellules immunitaires périphériques14. À l’inverse, contrairement à la culture cellulaire primaire, il y a une perturbation minimale de l’environnement extracellulaire, et la glie reste intacte et morphologiquement reconnaissable, ce qui évite les défis associés à la repousse et à l’identification de ces cellules après une perturbation enzymatique et mécanique16,25.

Par rapport aux méthodologies d’explantation rétinien décrites précédemment, cette approche met l’accent sur la fiabilité technique, la reproductibilité et l’optimisation de la « convivialité » de l’approche pour améliorer l’accessibilité26,28. Lors de communications personnelles avec d’autres chercheurs, nous avons constaté que les défis techniques associés à la manipulation de la rétine vivante représentent un obstacle majeur pour de nombreuses personnes cherchant à utiliser des explants, alors que le maintien de la rétine explantée en culture était relativement simple pour les groupes disposant d’installations de culture cellulaire appropriées. Par conséquent, ce protocole comprend un certain nombre d’innovations destinées à réduire la courbe d’apprentissage associée à l’isolement de la rétine et à permettre aux chercheurs de commencer plus rapidement à collecter des données expérimentales. Enfin, bien que nous ayons mis un accent particulier sur le potentiel de ce modèle d’explant pour étudier le comportement de la glie rétinienne et que nous le caractérisions principalement par microscopie à immunofluorescence, d’autres types et structures cellulaires rétiniennes sont également largement conservés, et les rétines explantées restent susceptibles d’un large éventail de techniques d’investigation supplémentaires.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Institut de recherche sur l’œil Schepens (Protocole # 2022N000030, approuvé le 3/4/2025). Les animaux ont été manipulés conformément à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

REMARQUE : La figure 1 montre les étapes clés de l’isolement de la rétine vivante de l’œil de souris énucléé.

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Figure 1 : Une représentation schématique des étapes clés de l’isolement de la rétine vivante de l’œil de souris énucléé. Les numéros d’étape correspondants des étapes clés sont indiqués dans des cercles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation

  1. Désinfectez une pipette de 1 mL et une paire de pinces coudées et placez-les dans l’enceinte de sécurité biologique. Ceux-ci seront nécessaires à la section 3 du protocole.
  2. Modifiez une pipette de transfert en coupant perpendiculairement à travers l’arbre à environ 2 cm sous le réservoir, là où l’alésage est le plus large, afin de raccourcir la pipette et d’élargir l’ouverture. Assurez-vous d’une coupe nette sur laquelle la rétine ne s’accrochera pas.
    REMARQUE : Cet outil peut être conservé pour être réutilisé s’il est propre et rincé à l’eau stérile entre les utilisations.
  3. Préparez 50 ml de milieu d’explant de manière aseptique dans une enceinte de biosécurité en complétant 47,5 ml de milieu neurobasal avec 500 μL de supplément N-2, 1 ml de supplément B-27, 500 μL de glutamax et 500 μL de mélange pénicilline-streptomycine (concentration finale de 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine).
    REMARQUE : Préparez des milieux d’explant frais pour chaque série d’isolements ; L’excès de média peut être conservé à 4 °C jusqu’à 1 semaine et utilisé pour changer de média si nécessaire. Après ouverture, remplacez le milieu neurobasal non utilisé après 1 mois. Le N-2 et le B-27 doivent être conservés congelés sous forme d’aliquotes à usage unique, afin d’éviter les cycles de gel-dégel.
  4. Dans une enceinte de biosécurité, préparer de manière aseptique la ou les plaques de culture en ajoutant un insert dans chaque puits à utiliser, en les manipulant à l’aide des « broches » qui émergent du bord de l’insert pour éviter de toucher les surfaces qui entreront en contact avec le milieu de culture.
    1. Ajoutez 1 ml de milieu d’explantation dans l’insert, puis 3 ml supplémentaires ajoutés dans le puits lui-même. Ajoutez 2 à 3 ml d’eau stérile dans les puits inutilisés pour contrôler l’évaporation.
    2. Transférez la ou les plaques dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pour équilibrer environ 30 minutes avant l’isolement des tissus.
  5. Préparez des carrés de filtre pour créer un substrat pour la stabilisation et le transfert des tissus. Extrayez le filtre d’un kit de filtration sur le dessus d’une bouteille en coupant autour de la périphérie du matériau avec un rasoir ou un scalpel. Veillez à ne pas blesser ou endommager le filtre en le pliant ou en le déchirant.
    REMARQUE : Le retrait du réservoir en plastique transparent à l’aide d’un rasoir robuste pour couper le plastique opaque plus malléable à l’endroit où l’adaptateur fileté rencontre le réservoir simplifie le processus d’extraction, mais des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter les blessures.
    1. Une fois le filtre détaché par coupe, utilisez une pince pour l’extraire. Notez l’orientation du filtre pendant et après l’extraction ; Le côté mat (qui fait face au réservoir) doit être vertical pour le montage de la rétine à l’étape 2.16 pour le transfert.
    2. Coupez le filtre en petits carrés d’environ 7 mm × 7 mm ; Chaque explant rétinien nécessitera un carré. Faites tremper les carrés dans de l’eau stérile dans une boîte de Pétri de 100 mm pendant au moins 20 min.
      REMARQUE : Les carrés filtrants peuvent rester immergés dans de l’eau stérile jusqu’à 1 semaine avant d’être utilisés. En raison de la tendance des carrés de filtre à développer des niveaux élevés de charge statique avant l’immersion, ne préparez que le nombre de carrés nécessaires. Le matériau filtrant sec restant peut être conservé indéfiniment dans une boîte de Pétri stérile de 100 mm pour une utilisation ultérieure.

2. Isolation et montage

  1. Euthanasier la souris selon une méthode approuvée avant de confirmer par une approche secondaire ; cette étude a utilisé l’asphyxie au CO2 suivie d’une luxation cervicale. Énucléez les deux yeux à l’aide d’une pince incurvée à bout émoussé et placez-les dans du PBS stérile.
  2. Préparez l’espace de travail en remplissant une boîte de Pétri de 100 mm de PBS stérile et en la plaçant sur la platine de la lunette de dissection binoculaire.
    1. Coupez une bande de lingette de laboratoire de 1 cm de large et plongez-la dans le plat pour agir comme un substrat stabilisateur.
    2. Transférez un œil dans la boîte de dissection, laissez l’autre dans du PBS et placez-le sur de la glace ou au réfrigérateur à 4 °C.
      REMARQUE : En raison de la sensibilité de la rétine à l’intervalle post-mortem prolongé, l’euthanasie d’une souris à la fois est recommandée.
  3. Positionnez et immobilisez l’œil. Utilisez une pince pour manœuvrer l’œil sur la lingette de laboratoire immergée, ce qui facilitera la stabilisation.
    1. Identifiez un point de maintien approprié, saisissez-le avec une pince coudée et roulez doucement l’œil de manière à ce qu’il soit tenu par le côté ou, idéalement, par le bas. Assurez-vous que l’axe antéro-postérieur (c’est-à-dire de la cornée au nerf optique) est horizontal. Cette orientation améliore la visibilité et minimise la pression sur l’œil pendant la dissection.
      REMARQUE : Si possible, saisissez le tissu extraorbitaire pour éviter de percer ou de comprimer l’œil, favorisant le muscle ou la conjonctive par rapport au nerf optique ou à la graisse.
  4. Tout en maintenant une prise avec la pince coudée, assurez-vous que l’œil est complètement immergé et solidement immobilisé. Faites une incision avec la pointe du scalpel #11 parallèle et à environ 0,5 mm en arrière du limbe, là où la cornée passe à la sclérotique.
    REMARQUE : Cette incision doit être juste assez grande pour s’adapter à la pointe d’une lame des ciseaux à ressort. Comme la netteté de la pointe du scalpel est essentielle pour percer proprement le globe, changez la lame tous les deux rétines.
    1. Insérez une lame des ciseaux à ressort à l’intérieur du globe et commencez à couper circumlimbiquement autour de l’œil, en repositionnant doucement l’œil au besoin à l’aide d’une pince.
      REMARQUE : Cette coupe doit être aussi droite et parallèle que possible au limbe ; Le repositionnement de l’œil peut nécessiter de poser les ciseaux et d’utiliser une paire de pinces avec chaque main. Une fois exposé, gardez la rétine immergée tout au long de la dissection.
  5. Une fois que la coupure a circonscrit l’œil, retirez soigneusement le segment antérieur et la lentille, puis tournez l’œilleton vers le haut pour faciliter l’inspection visuelle et l’ablation du vitré. Si un morceau étendu du nerf optique reste attaché, coupez-le à une longueur plus courte (1 à 2 mm) pour faciliter cela.
  6. Inspectez la rétine à la recherche de dommages visibles et la chambre vitrée à la recherche de débris, tels que des cellules pigmentées de l’EPR ou de la choroïde qui ont pu pénétrer lors de l’ablation du segment antérieur. Utilisez une pince coudée pour immobiliser l’œilleton dans cette position.
    REMARQUE : Pour des résultats optimaux, les débris dans la chambre vitrée doivent être éliminés et les restes vitraux résiduels et adhérents du corps ciliaire à la périphérie de la rétine doivent être minimisés. Ce processus peut être difficile, et des notes supplémentaires se trouvent dans les sections « Reconnaissance et dépannage des lésions mécaniques » et « Lésions métaboliques » des résultats représentatifs.
    1. Utilisez la pipette de transfert modifiée pour rincer la chambre vitrée avec du PBS afin d’éliminer les petits débris particulaires, en évitant les bulles d’air en gardant la pointe de la pipette sous la surface du liquide et en maintenant une quantité adéquate de PBS dans le bulbe du réservoir.
    2. Enlevez les plus gros débris à l’aide d’un pinceau aquarelle fin, en minimisant le contact avec la surface rétinienne. Si nécessaire, retirez les débris les plus persistants à l’aide d’une pince à pointe fine ; Cependant, évitez le contact direct des pointes d’outils métalliques avec la rétine pour éviter de les endommager.
  7. Après avoir éliminé les débris visibles, rincez la chambre vitrée avec du PBS de la pipette de transfert à plusieurs reprises (3 à 5 fois), comme décrit ci-dessus. Cela éliminera le vitré faiblement adhérent qui peut rester après l’élimination des débris. À l’aide de la brosse fine, sondez doucement la chambre, en particulier près de la périphérie si des éléments du corps ciliaire restent. Bien que le vitré soit optiquement transparent, il agira comme une traînée sur les fibres de la brosse et peut être détecté de cette manière.
    REMARQUE : Une mince couche résiduelle de vitré sur la rétine ne semble pas avoir d’impact négatif sur l’isolement ou le maintien de la rétine ex vivo, mais la présence de quantités significatives à la périphérie de la rétine, souvent associée à des structures résiduelles du corps ciliaire, peut provoquer un repliement rétinien et une perte d’échantillon si elle n’est pas retirée.
    1. S’il reste des poches importantes de vitré, utilisez la brosse pour l’enlever en balayant doucement vers l’extérieur vers la périphérie, en vous assurant que si les fibres de la brosse entrent en contact avec la rétine, elles le font à partir d’un angle peu profond et traînent la brosse, tirant plutôt que poussant le vitré hors de la chambre.
      REMARQUE : L’ablation du vitré nécessite une manipulation particulièrement soigneuse pour éviter des lésions rétiniennes qui peuvent ne pas être visibles macroscopiquement ; Des conseils sur la façon de reconnaître et d’éviter ces dommages se trouvent dans les sections « Reconnaître et dépanner les lésions mécaniques » et « Lésions métaboliques » des résultats représentatifs.
  8. Une fois que la chambre vitrée a été débarrassée des débris et qu’il ne reste qu’un minimum de vitré, séparez doucement la rétine externe de l’œilleton tout en continuant à stabiliser l’échantillon avec une pince inclinée. Évitez d’endommager la tête du nerf optique et laissez cette structure intacte pour ancrer la rétine.
    1. Prenez une paire de pinces, en les maintenant en position fermée avec les pointes en contact, et insérez-les doucement entre la rétine et la choroïde, en utilisant un espace préexistant de la manipulation précédente si possible. Utilisez les bras plats de la pince, plutôt que les pointes, pour agrandir la poche entre la rétine et la choroïde jusqu’à ce que ces structures puissent être complètement séparées.
      REMARQUE : Mettez l’accent sur les mouvements latéraux, plutôt que de pousser les pointes, pour élargir l’espace entre la rétine et la choroïde. Tourner doucement la pince pendant ces mouvements peut améliorer la séparation tout en réduisant le stress pur et simple du frottement entre les pinces et les tissus.
  9. Après avoir séparé la rétine externe de la choroïde, continuez à stabiliser l’échantillon tout en utilisant une deuxième paire de pinces pour tirer l’œilleton - sclérotique, choroïde, etc. - vers le bas. Si la rétine a été séparée avec succès, elle doit rester en place, attachée à la tête du nerf optique, tandis que l’œilleton peut être maintenu par une seule paire de pinces. Si la rétine appuie avec l’œilleton, continuez à sonder doucement et à séparer les points de connexion autres que la tête du nerf optique.
  10. Avec la rétine ancrée au niveau de la tête du nerf optique, continuez à immobiliser le tissu et utilisez la deuxième paire de pinces pour regrouper l’œilleton sous la tête du nerf optique.
    1. Assurez-vous qu’aucune partie de la périphérie de la rétine n’est coincée en position repliée en raison d’un excès de vitré dans l’angle entre la rétine et tout corps ciliaire résiduel. Si nécessaire, rincez la chambre avec du PBS à l’aide de la pipette de transfert pour enlever tout débris supplémentaire, et utilisez doucement la brosse pour dérouler le tissu et éliminer l’excès de vitré, tout en prenant soin de ne pas tirer excessivement sur le tissu.
  11. Avec la rétine exposée des deux côtés, utilisez les ciseaux à ressort pour faire une série de coupes de soulagement, espacées d’environ 90°, s’étendant en ligne droite de la périphérie vers la tête du nerf optique, en s’arrêtant à environ 1 mm du centre. Cela minimise la section des axones des cellules ganglionnaires rétiniennes dans la rétine, améliorant ainsi la qualité des explants cultivés.
  12. Tout en maintenant le tissu immergé en place, retirez délicatement la lingette de laboratoire à l’aide d’une pince pour l’éloigner latéralement du tissu avant de la retirer de la boîte. Évitez tout contact avec la rétine pour éviter l’adhérence à la lingette et une éventuelle perte d’échantillon.
  13. Ensuite, continuez à tenir le tissu et utilisez les ciseaux à ressort pour sectionner le nerf optique directement sous la rétine, puis retirez le reste de l’œilleton de la boîte.
  14. Une fois que la rétine est isolée du reste de l’œil, remplissez une boîte de Pétri de 35 mm avec du PBS et utilisez une pince pour placer un carré de filtre en bas avec le côté mat le plus rugueux vers le haut. Veillez à ne pas froisser le filtre, car cela pourrait entraver l’utilisation du filtre comme substrat pour déplacer la rétine.
  15. Aspirez doucement la rétine à l’aide de la pipette de transfert et transférez-la délicatement dans la boîte de 35 mm. Manœuvrez la rétine avec la brosse pour vous assurer que la surface interne de la rétine est droite et que le tissu repose directement au-dessus du carré du filtre.
  16. Aspirez lentement le PBS de la boîte avec la pipette de transfert pour abaisser la rétine sur le filtre. Faites une pause, si nécessaire, pour réajuster le tissu avant de continuer jusqu’à ce que la rétine se soit installée sur le filtre.
    REMARQUE : L’aspiration rapide peut entraîner un mouvement latéral soudain de la rétine, entraînant des dommages ou une perte de tissus. L’intégralité de la rétine doit reposer sur le carré pour éviter les dommages ; cependant, si la rétine s’installe dans une position problématique, le PBS peut être rajouté à la boîte jusqu’à ce que la rétine soit remise en suspension, et le montage peut être retenté.
  17. Une fois que la rétine s’est installée sur le filtre, utilisez la brosse pour dérouler toute rétine périphérique qui aurait pu se replier. Équilibrez soigneusement le niveau de PBS afin que la rétine ne se déplace pas facilement du filtre tout en veillant à ce qu’il en reste suffisamment pour que l’échantillon ne se dessèche pas et que la brosse puisse se déplacer en douceur sans endommager la rétine interne.
  18. Une fois de plus, inspectez la rétine à la recherche de débris. Pour éviter de l’endommager, nettoyez la rétine sans manipulation directe à l’aide de la pipette de transfert pour faire couler le PBS sur la rétine à environ 1 cm au-dessus du tissu. Cela devrait évacuer tous les débris restants, mais si trop de PBS est ajouté à la parabole, la rétine peut remonter. Si cela se produit, effectuez à nouveau une aspiration pour remonter le tissu.
    REMARQUE : Des échantillons « simulés » peuvent être générés en transférant les rétines sur une plaque à 24 puits pour la fixation, le blocage/perméabilisation et la coloration des anticorps, comme décrit ailleurs21. Ces contrôles fictifs sont utiles pour dépanner les lésions mécaniques de la rétine qui peuvent survenir pendant l’isolement.

3. Transfert vers les milieux de culture et entretien

  1. Fermez le couvercle de la parabole de 35 mm pour le transport vers l’enceinte de biosécurité, en maintenant la parabole à niveau pour éviter de déloger la rétine du filtre. Si cela se produit, remontez comme ci-dessus.
  2. Placez la parabole fermée de 35 mm contenant la rétine dans l’enceinte de biosécurité, en prenant soin de ne pas toucher l’équipement ou les surfaces à l’intérieur de l’armoire avant de désinfecter ou de changer de gants.
  3. Décontaminez les gants avec de l’éthanol et/ou remplacez-les, puis déplacez la plaque à 6 puits préchargée avec le milieu d’explant de l’incubateur à l’enceinte de biosécurité. Effectuez les étapes 3.4 et 3.5 à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité, à l’aide des outils qui y sont placés à l’étape 1.1.
  4. Retirez le couvercle de la boîte de 35 mm contenant la rétine et à l’aide d’une pince coudée pour soulever délicatement le carré du filtre sans toucher directement la rétine. Retirez le couvercle de la plaque à 6 puits et positionnez le filtre au centre de l’insert d’un puits approprié, puis abaissez-le lentement dans le média. La rétine va se détacher du filtre pendant cette étape et flotter juste en dessous de l’interface air-liquide.
  5. Une fois que la rétine et le filtre se sont séparés, éloignez lentement le filtre de la rétine et retirez-le du support. À l’aide de la pipette de 1 ml, retirez 500 μL de média de l’insert pour vous assurer que la rétine repose à plat en la piégeant entre le sol de l’insert et l’interface air-liquide.
  6. Remettez le couvercle sur la plaque et remettez-le dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2, en prenant soin de garder la rétine près du centre du puits. Jusqu’à 6 rétines peuvent être conservées dans une seule plaque.
    REMARQUE : Si vous conservez les explants pendant 24 heures ou moins, ils peuvent être laissés dans l’incubateur jusqu’à la fin de l’expérience. S’il est conservé pendant des durées plus longues, il est recommandé de modifier 50 % des milieux après 1 jour in vitro et un jour sur deux par la suite.

4. Fixation pour immunomarquage (facultatif)

  1. Si vous effectuez une immunomarquage, reportez-vous aux étapes suivantes pour la fixation ; Alors que l’immunocoloration peut être réalisée à l’aide de paramètres précédemment détaillés pour les rétines montées à plat21, la fixation de la rétine explantée nécessite des considérations spécifiques.
  2. Retirez les inserts de culture cellulaire avec les explants et les milieux de la plaque de culture à 6 puits et placez-les sur une surface non poreuse (comme le couvercle en plastique de la plaque de culture) qui peut être éliminée correctement après la fixation, car les inserts sont légèrement poreux et de petites quantités de fixateur passeront à travers cette surface sous-jacente.
  3. Retirer délicatement le milieu de culture des inserts, puis ajouter 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à chacun. Laissez les rétines fixer pendant 15 minutes dans une hotte, puis retirez le PFA et éliminez-le conformément à la politique de l’établissement.
    ATTENTION : Le paraformaldéhyde est dangereux et un précurseur du formaldéhyde, un cancérogène connu. Soyez prudent et effectuez la fixation dans une hotte avec les précautions appropriées.
  4. Lavez les rétines 3 fois (pendant 5 minutes chacune) avec du PBS pour éliminer le PFA, puis utilisez une pipette de transfert modifiée pour transférer les rétines dans le PBS vers des puits individuels dans une plaque à 24 puits pour le blocage, la perméabilisation et l’immunocoloration comme décrit ailleurs21. Éliminer les plastiques contaminés par le PFA (pointes de pipette, inserts et surface non poreuse utilisée lors de la fixation) conformément à la politique de l’établissement.
    REMARQUE : La pipette de transfert peut être conservée pour transférer des rétines fixes et colorées sur une lame pour le montage et l’imagerie. Bien qu’il n’ait pas dû avoir de contact direct avec le PFA, il est recommandé d’utiliser des pipettes de transfert différentes pour manipuler des tissus vivants et fixés.

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Résultats

À l’échelle macroscopique, les rétines explantées restent essentiellement inchangées à des moments de 1 et de 3 jours, bien qu’à ce dernier moment, elles deviennent relativement fragiles, nécessitant une manipulation soigneuse avant la fixation ou d’autres paramètres expérimentaux. Les rétines doivent être relativement plates, sans plis (ce qui peut entraîner une perturbation localisée de la diffusion de l’oxygène et des nutriments) et doivent être suspendues dans le milieu entre l’interface air-liquide et l’insert de cu...

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Discussion

Les approches de culture organotypique32 telles que les explants rétiniens exploitent la flexibilité expérimentale et le délai d’exécution rapide de la culture cellulaire tout en préservant une grande partie du contexte in situ des études in vivo , ce qui en fait une voie puissante pour étudier les interactions complexes entre les types de cellules. Nous présentons ce protocole comme un point d’entrée pour les chercheurs qui peuvent avoir une exp...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

M.A.M. a été soutenu par le NIH/NEI R01EY035312, le prix Catalyst for a Cure de la Fondation de recherche sur le glaucome, la Fondation Melza M. et Frank Theodore Barr, la Fondation Robert M. Sinskey, MD, la Fondation de bienfaisance de la famille Ruettgers et la Fondation B.L. Manger. P.F.C. a été soutenu par NIH/NEI 2T32EY007145. Ce travail a également été rendu possible par une subvention de base des NIH pour la recherche sur la vision P30 EY003176.  La figure 1 a été générée avec Biorender. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Nasir Uddin pour ses commentaires sur le manuscrit et le Dr Qiurong Zhu pour son aide et son soutien.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
#11 Lames de scalpelBard-Parker3,71,311
Pipette de 1 mL ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
100 mm Boîte de PétriFalcon351029
16 % ParaformaldéhydeTed Pella Inc18,505Dilué à 4 % pour la fixation
24 Well PlateFalcon353047Pour la fixation, le blocage et incubation d’anticorps
35 mm boîte de PétriFalcon351008
kit de plaques et d’inserts à 6 puitsGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.  ;711-545-152Dilution 1:800
Alexa Fluor 594 IgG anti-rat d’âne (H+L) Invitrogen A-21209 à adsorption croisée élevéeAlexa
Fluor 594-F(ab')2 IgG anti-souris d’âne (H+L)  ;Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.  ;715-586-150dilution 1:800
Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.  ;706-605-148Dilution 1:800
Alexa Fluor 647-F(ab')2 Âne Anti-poulet IgY (IgG) (H+L)  ;Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.  ;703-606-155Dilution 1:800
Pince coudée ('5/45')FST / Dumont11251-35
Anticorps anti-Brn3a (souris)ChemiconMAB1585dilution 1:200
Anticorps anti-CD206 (rat)BioradMCA2235dilution 1:200
Anticorps anti-GFAP (poulet)Abcamab4674dilution 1:1000
Anti-Iba1 anticorps (lapin)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-19741dilution 1:500
Anticorps anti-Tmem119 (cobaye)Synaptic Systems400 004dilution 1:500
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
Pince incurvée émoussée ('Extra Fine Graefe)FST11152-10
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA9647Utiliser 1 % p/v pour le blocage et l’incubation des anticorps
Kit de filtre (0,2 & micro ; membrane mPES, filtre de 150 mL sur le dessus de la bouteille)  ;FisherScientificFB12566508
pinceau fin, taille 3/0Princeton Art & Brush Co.06435-1030
GlutaMaxGibco (Thermofisher)35050061
Lingettes de laboratoire (Lingettes Kim)  ;KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A Medium, moins le rouge phénolGibco (Thermofisher)12349015
Sérum d’âne normalJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.  ;017-000-121Utilisation à 10 % pour le blocage et l’incubation d’anticorps
Pénicilline-StreptomycineGibco (Thermofisher)15140122
pointes de pipette, 1000 µ ; LTipOne1126-7810
Ciseaux à ressort ('Cohan-Vannas')FST15000-11
Eau stérile ('Dnase, sans RNASE')Invitrogen10977-015
Filtre stérile PBSGibco10010-023
Pince droite ('mini')FST / Dumont11200-14
Pipette de transfert, 5,8 mLfisherscientific13-711-9AMMD
Triton X-100Thermo Scientific ChemicalsA16046. APUtilisation à 0,5 % pour le blocage et l’incubation des anticorps

Références

  1. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
  2. Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome. Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).
  3. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  4. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).
  5. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  6. Livne-Bar, I., et al. Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury. J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).
  7. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  8. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  9. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).
  10. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  11. Tezel, G. Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets. Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).
  12. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  13. Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 7, 66(2006).
  14. Paschalis, E. I., et al. Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).
  15. Rutigliani, C., et al. Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).
  16. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  17. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  18. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).
  19. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).
  20. Cullen, P. F., Sun, D. Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma. Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).
  21. Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization. Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).
  22. Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).
  23. Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. Microglia in the developing retina. Neural Dev. 14 (1), 12(2019).
  24. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  25. Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).
  26. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  27. Tao, C., Zhang, X. Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis. Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).
  28. Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries. Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).
  29. Vagaja, N. N., et al. Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).
  30. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  31. Rodrigues, E. B., et al. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).
  32. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  33. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  34. Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy. Front Immunol. 11, 564077(2020).
  35. Reboussin, E., et al. Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model. J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).
  36. Do, M. T. H. Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior. Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).
  37. Yu, A., et al. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).

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