Modèle murin raffiné de fibrose pulmonaire idiopathique

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour induire une fibrose pulmonaire chez la souris par l’administration oropharyngée répétée de bléomycine, produisant des caractéristiques pathologiques ressemblant étroitement à celles de la fibrose pulmonaire idiopathique.

Résumé

Les modèles animaux jouent un rôle crucial dans la compréhension des mécanismes de la maladie et la mise à l’essai d’approches thérapeutiques potentielles. Cependant, les modèles murins traditionnels de fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) qui reposent sur une injection unique de bléomycine ne parviennent pas à reproduire avec précision les caractéristiques pathologiques complexes observées chez les patients atteints de FPI. Cette étude présente une méthode améliorée utilisant deux administrations oropharyngées successives de bléomycine chez la souris, qui imite plus efficacement la progression de la FPI. Ce nouveau protocole induit des changements pathologiques clés, tels que la formation de kystes en nid d’abeille, de foyers fibroblastiques et la bronchiolisation de l’épithélium alvéolaire, ressemblant étroitement à l’histopathologie observée dans la FPI humaine. En utilisant ce modèle, nous sommes en mesure de capturer les changements fibrotiques progressifs sur une période plus longue, ce qui fournit des informations plus fiables sur la pathogenèse de la FPI. De plus, cette approche à deux doses offre plusieurs avantages par rapport aux modèles monodoses conventionnels, notamment une meilleure reproductibilité et une représentation plus robuste du développement de la maladie. Cette méthode améliore notre capacité à étudier les mécanismes sous-jacents à la FPI et à évaluer les interventions thérapeutiques potentielles. Le protocole proposé offre des avancées significatives dans la recherche préclinique et fournit un outil précieux pour étudier à la fois la biologie de la fibrose pulmonaire et l’efficacité de nouveaux traitements.

Introduction

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie pulmonaire interstitielle progressive et mortelle caractérisée par des lésions irréversibles du parenchyme pulmonaire, entraînant des symptômes débilitants tels que la dyspnée et une baisse sévère de la qualité de vie ^1,2. Histologiquement, la FPI se manifeste par une pneumonie interstitielle habituelle, caractérisée par une fibrose spatialement hétérogène, une bronchiolisation de l’épithélium alvéolaire et des foyers fibroblastiques³. Malgré son importance clinique, la pathogenèse complexe de la FPI et les options thérapeutiques limitées soulignent le besoin urgent de modèles expérimentaux robustes pour faire progresser la compréhension mécaniste et le développement de traitements.

Les modèles existants de bléomycine à dose unique, bien que largement utilisés⁴, ne parviennent pas à récapituler les principales caractéristiques pathologiques de la FPI humaine, telles que les pods de cellules basales KRT5+ ^5,6,7 et les foyers fibroblastiques persistants, et présentent une fibrose auto-résolue ⁸. L’administration répétitive de bléomycine améliore la fidélité pathologique ^9,10 mais est entravée par la complexité technique, la mortalité élevée et les cycles de modélisation prolongés^11,12. Pour remédier à ces limitations, nous avons développé un modèle murin optimisé avec l’administration répétée de bléomycine oropharyngée¹³. Cette approche combine la complétude pathologique des modèles de lésions répétitives ^9,10 avec les avantages techniques de l’administration non invasive, permettant d’obtenir une progression fibrotique soutenue au-delà de 60 jours tout en maintenant une faible mortalité. En imitant étroitement la pathologie de la FPI humaine, y compris la formation de kystes en nid d’abeille et la fibrose persistante, notre méthode fournit une plate-forme solide pour étudier les mécanismes de la maladie et évaluer les interventions thérapeutiques.

Le protocole est particulièrement adapté aux chercheurs nécessitant des modèles fibrotiques chroniques sans complications chirurgicales. Elle offre des avantages significatifs par rapport aux approches existantes en termes de reproductibilité, de pertinence clinique et de respect des directives en matière de bien-être animal. S’appuyant sur des techniques oropharyngées établies, ces améliorations font progresser la recherche préclinique sur la FPI en comblant les écarts critiques entre les modèles expérimentaux et la pathologie des maladies humaines.

Protocole

Des souris mâles C57BL/6 âgées de 4 à 6 mois ont été utilisées ici. Toutes les expériences impliquant des souris ont été menées conformément au protocole animal approuvé par le Centre de recherche sur les animaux de laboratoire de l’Université Sun Yat-sen (numéro d’approbation SYSU-IACUC-MED-2021-B0076). L’étude a respecté les directives de soins aux animaux décrites par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Sun Yat-sen.

1. Préparation à l’expérience

1. Réactifs : Acquérir de la poudre de bléomycine, une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et de l’isoflurane.
2. Équipement : Procurez-vous des pointes de pipette (200 μL), une pipette, un support d’injection trachéale, une boîte de pointes de pipette de 1 ml et des boules de coton alcoolisées.

2. Procédure expérimentale

1. Préparez une solution mère de bléomycine à une concentration de 1,5 mg/mL en utilisant du PBS comme solvant. Aliquote 600 μL de la solution mère dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL et la diluer avec 1200 μL de PBS pour obtenir une dilution 3 fois (concentration finale : 0,5 mg/mL).
   REMARQUE : La solution mère de bléomycine a été conservée à −20 °C et est restée stable jusqu’à 3 mois.
2. Pesez chaque souris avant l’administration de l’oropharynx. Calculez le volume requis de solution de bléomycine en fonction du poids corporel de la souris. La posologie est de 1,5 mg/kg, et le volume d’injection (en μL) est égal au poids de la souris (en grammes) multiplié par 3 (en raison de la dilution 3 fois).
3. Placez plusieurs boules de coton imbibées d’alcool au fond d’une boîte de pointes de pipette de 1 ml. Ajoutez 1 ml de liquide isoflurane dans le coton placé au bas de la boîte de l’embout de la pipette. Placez immédiatement la souris à l’intérieur de la boîte à pointes de pipette pour induire l’anesthésie. Surveillez la souris jusqu’à ce que sa respiration ralentisse, indiquant une anesthésie adéquate, puis retirez-la immédiatement.
   REMARQUE : Lors de l’induction de l’anesthésie à l’isoflurane dans une boîte scellée à pointe de pipette, les souris présentent une transition respiratoire caractéristique de la tachypnée initiale à la bradypnée ultérieure. L’élimination immédiate au début de la bradypnée est essentielle pour prévenir un surdosage d’anesthésique. L’ablation prématurée pendant la tachypnée peut entraîner une excitation intempestive lors de l’administration de bléomycine oropharyngée.
4. Fixez la souris sur le support d’injection trachéale en accrochant ses dents. Tirez doucement la langue à l’aide d’une pince et maintenez-la avec le pouce et l’index (évitez d’utiliser des pinces pour minimiser l’inconfort). Couvrez le nez de la souris avec le majeur pour assurer une bonne livraison.
5. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, aspirez le volume calculé de solution de bléomycine diluée, puis administrez lentement la solution de bléomycine dans l’oropharynx de la souris sans insérer la pointe de la pipette profondément. Cette approche minimise les dommages aux tissus et assure un accouchement efficace.
6. Écoutez un gargouillis distinct, indiquant que la solution est entrée dans les poumons. Une fois que le son cesse, retirez la souris du support et placez-la sur un coussin chauffant pour la récupérer.
   REMARQUE : Un gargouillis caractéristique sert d’indicateur fiable de l’administration réussie de la bléomycine dans l’oropharynx. L’absence de ce signal acoustique suggère un dépôt œsophagien, auquel cas le sujet est exclu des procédures expérimentales ultérieures en raison de l’échec de l’administration.
7. Répétez la procédure d’administration de l’oropharynx 7 jours après la dose initiale.

3. Prélèvement de tissus

1. Euthanasier les souris par luxation cervicale aux points temporels prédéterminés (14 et 60 jours après l’administration finale de bléomycine).
2. Effectuez une sternotomie médiane pour exposer la cavité thoracique. L’appendice auriculaire gauche a été incisé chirurgicalement. Par la suite, perfuser les poumons à travers le ventricule droit avec 10 ml de PBS glacé pour éliminer les cellules sanguines circulantes.
3. Canulez la trachée et gonflez les poumons avec du paraformaldéhyde (PFA) à 1 % pour assurer une fixation complète des tissus.
4. Exciser les poumons et les immerger dans 1 % de PFA pendant 1 h à température ambiante pour permettre une bonne fixation.
5. Pour le traitement des tissus, rincez les tissus fixés dans du PBS 3x pendant 5 minutes chacun. Déshydratez les tissus séquentiellement à l’aide d’une série d’éthanol gradué : 70 % d’éthanol, 95 % d’éthanol et 100 % d’éthanol, en assurant une déshydratation complète à chaque étape. Après déshydratation, éclaircir les tissus dans du xylène pendant 1 h à température ambiante. Par la suite, incrustez les tissus dans de la cire de paraffine fondue à 60 °C pendant au moins 2 h, ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement infiltrés. Enfin, sectionnez les tissus incrustés à une épaisseur de 7 μm à l’aide d’un microtome rotatif.

4. Évaluation de l’échantillon

1. Effectuer la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et au trichrome de Masson pour évaluer la gravité de la fibrose.
   1. Pour la coloration H&E, effectuez une déparaffinisation séquentielle du xylène pendant 5 min, 2x et une réhydratation graduelle de l’éthanol avec 100 % d’éthanol pendant 5 min, suivie d’une analyse à 100 % d’éthanol pendant 1 minute, puis d’une analyse à 95 % d’éthanol pendant 1 minute et enfin d’une réhydratation à 80 % d’éthanol pendant 1 minute. Rincer à l’eau distillée. Teindre avec de l’hématoxyline pendant 5 min, puis rincer à l’eau du robinet 3 fois et tremper pendant 5 min. Ensuite, effectuez un trempage à l’éthanol à 80 % pendant 1 min et une contre-coloration à l’éosine pendant 45 s. Effectuez la déshydratation avec de l’éthanol gradué en utilisant de l’éthanol à 95 % pendant 5 trempettes, suivie d’une dose d’éthanol à 100 % pendant 5 trempettes, et enfin, immergez-la dans de l’éthanol à 100 % pendant 2 min. Éclaircir avec du xylène en trempant pendant 5 min, 2x puis effectuer un montage de baume neutre.
   2. Pour la coloration de Masson, après le déparaffinage effectué à l’étape 4.1.1, rincer les lames en ddH₂O et colorer avec du Ponceau S-fuchsin pendant 5 s, puis rincer 1 min avec une solution d’acide faible à 0,2 % (acide acétique/eau). Effectuer la différenciation dans une solution d’acide phosphomolybdique pendant 5 min, suivie d’un rinçage à l’acide faible pendant 1 min, suivi d’une contre-coloration au bleu d’aniline pendant 1 min et d’un lavage final à l’acide faible pendant 1 min. Déshydrater les sections à l’aide d’éthanol gradué en commençant par 95 % d’éthanol pendant 2 à 3 s, puis par de l’éthanol absolu pendant 5 à 10 s, 2x. Transparent en xylène et montage avec de la résine.
2. Effectuer une coloration immunohistochimique (IHC) et d’immunofluorescence (IF) pour des marqueurs tels que α-SMA, KRT5 et ΔN-p63^14,15 afin d’évaluer le remodelage fibrotique et épithélial.
   1. Pour la coloration immunohistochimique, effectuer le déparaffinage et la réhydratation de coupes de tissus enrobées de paraffine avant la récupération de l’antigène dans un tampon de citrate de sodium 0,1 M bouillant (pH 6,0) contenant 0,5 % de Tween-20 pendant 90 s. Inhiber l’activité de la peroxydase endogène avec 3 %_{de H2}O₂, suivie d’une perméabilisation membranaire avec 0,5 % de Triton X-100/PBS et d’un blocage non spécifique. Incuber dans l’anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit, suivi d’une incubation de 1 h à température ambiante avec des anticorps secondaires de l’espèce appariée et d’une conjugaison streptavidine-HRP de 30 min. Pour le développement chromogène, utilisez le substrat DAB Vector SK-4100 avec contre-coloration à l’hématoxyline, déshydratation à l’éthanol et montage de baume neutre pour compléter le protocole.
   2. Pour la coloration par immunofluorescence, après un traitement immunohistochimique standard (déparaffinage, récupération d’antigène, blocage, incubation d’anticorps primaires et secondaires), étiquetez les cibles biotinylées avec Alexa Fluor 594 ou 647 conjugué à la streptavidine (dilution 1:500, incubation de 30 min à température ambiante). Effectuer une contre-coloration nucléaire à l’aide de DAPI (concentration finale de 20 μg/mL) pendant 5 min, suivie d’un montage avec un milieu anti-décoloration pour préserver les signaux de fluorescence.

Résultats

Par rapport à l’administration traditionnelle de bléomycine oropharyngée à dose unique, cette méthode permet de récapituler avec succès les caractéristiques pathologiques caractéristiques de la FPI, notamment les foyers fibroblastiques (Figure 1B), le nid d’abeille (Figure 1G) et la bronchiolisation de l’épithélium alvéolaire (Figure 1H). Il est important de noter que le modèle démontre la persistance de ces caractéristiques au fil ...

Discussion

Dans cette étude, nous présentons un modèle murin affiné de FPI utilisant l’administration oropharyngée répétée de bléomycine. Cette approche répond aux limites critiques des modèles monodoses traditionnels, qui ne parviennent pas à récapituler les principales caractéristiques pathologiques de la FPI humaine, telles que les pods de cellules basales KRT5+ et p63+ ^7,14,15, les foyers fibroblastiqu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif utilisé
bléomycine	MCE	HY-17565
H& Kit de coloration E	Solarbio	G1120
l’isoflurane	RWD	Référence R510-22-10
Kit de coloration de Masson	Solarbio	G1340
PBS	Biosharp	BL302A
Anticorps utilisés			Dilution
&alpha ;-SMA	Abcam	AB5694	1:100
Cytokératine 5	Voie immunitaire	YT1271	1:100
DeltaN p63	CST	67825	1:100
Chèvre Anti-Lapin IgG H& L(biotine)	Abcam	AB6720	1:800
Hydroxyproline	CST	73812	1:100
Streptavidine conjuguée à la peroxydase	Jackson	016-030-084	1:100
Streptavidine / AF594	Bioss	bs-0437P-AF594	1:500