Method Article

Un modèle murin pour évaluer les résultats structurels et fonctionnels à long terme après l’inversion de l’obstruction urétérale unilatérale prolongée

DOI:

10.3791/68492

⸱

July 18th, 2025

 , 
1Division of Nephrology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article fournit des instructions détaillées pour permettre aux chercheurs d’effectuer une obstruction urétérale unilatérale réversible chez la souris à l’aide d’un modèle standardisé qui permet d’analyser les résultats structurels et fonctionnels à long terme après l’inversion de l’obstruction urétérale prolongée.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prise en charge clinique des patients atteints d’obstruction des voies urinaires (UTO) nécessite une intervention précoce pour inverser la cause de l’obstruction, mais malgré cela, les patients atteints d’UTO prolongée courent un risque accru d’insuffisance rénale chronique (IRC) et d’insuffisance rénale aiguë récurrente (IRA). Cependant, à l’exception d’une inversion précoce de l’obstruction et d’un traitement générique pour retarder la progression de l’IRC, aucun traitement n’a amélioré de manière significative les résultats rénaux à long terme après l’inversion de l’UTO. Pour y remédier, un certain nombre de laboratoires ont mis au point des modèles d’UUO réversibles, mais ceux-ci sont techniquement difficiles et n’ont pas été largement adoptés. De plus, bien que les modèles murins de R-UUO soient attrayants car ils peuvent être utilisés pour exploiter la puissance de la génétique de la souris afin d’étudier la physiopathologie de la maladie, ceux-ci ont été particulièrement difficiles car les méthodes utilisées conduisent souvent à une UUO irréversible si l’obstruction dure >3 jours. De plus, en raison de la nature de ces modèles, peu d’études ont évalué les résultats fonctionnels à long terme de l’inversion de l’obstruction urétérale. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment développé un modèle murin de R-UUO avec néphrectomie controlatérale retardée qui permet d’analyser les effets à long terme de l’inversion de l’UTO prolongée sur les résultats structurels et fonctionnels rénaux à long terme. Ces études montrent que, malgré une récupération histologique presque complète 3 mois après l’inversion, il y avait une réduction permanente de la fonction rénale et un défaut marqué et persistant de la capacité de concentration urinaire, indiquant un défaut de la fonction médullaire rénale. Le modèle nécessite trois chirurgies de survie majeures, mais entraîne une réduction robuste et reproductible à long terme de la fonction rénale qui peut être reproduite dans différentes souches de souris en ajustant la période d’obstruction. Dans cet article, nous fournissons des instructions détaillées pour effectuer ces chirurgies, optimiser les conditions d’utilisation dans différentes souches de souris, évaluer les résultats fonctionnels rénaux et prélever des tissus rénaux.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’obstruction des voies urinaires (UTO) peut être unilatérale, souvent asymptomatique, se manifestant tardivement par une uropathie chronique obstructive1, ou peut se présenter de manière aiguë par une colique néphrétique et/ou une hématurie ; pyélonéphrite aiguë ou insuffisance rénale aiguë (IRA)2. La clé de la gestion de l’UTO est l’inversion précoce de l’obstruction2. Cependant, malgré une inversion efficace et l’utilisation de traitements génériques pour retarder la progression de l’insuffisance rénale chronique (IRC), les patients atteints restent exposés à un risque accru de MRC progressive et d’hypertension 3,4. De plus, la capacité de concentration urinaire (UCC) à long terme est souvent altérée5, ce qui peut prédisposer les patients sensibles à la déshydratation et à l’IRA récurrente, accélérant ainsi le déclin progressif de la fonction rénale après UTO.

Cette incapacité à identifier des approches thérapeutiques pour améliorer les résultats à long terme chez les patients atteints d’UTO est en partie due au fait que nous nous appuyons sur l’utilisation de modèles d’obstruction urétérale unilatérale irréversible (UUO) pour explorer la pathobiologie de l’UTO. Cependant, ces modèles ne reproduisent pas la situation clinique dans laquelle les patients subissent une inversion peu de temps après le diagnostic et ne peuvent pas être utilisés pour explorer les mécanismes et les approches thérapeutiques qui pourraient être utilisés pour améliorer la réparation à long terme après l’inversion de l’obstruction. Des modèles UUO réversibles (R-UUO) ont été développés pour résoudre ce problème, mais ils sont plus difficiles sur le plan technique que les modèles UUO irréversibles, plus difficiles à reproduire par différents laboratoires et, par conséquent, n’ont pas été aussi largement adoptés par la communauté scientifique. Les modèles murins sont attrayants car ils peuvent être utilisés pour exploiter la puissance de la génétique murine afin d’étudier la physiopathologie des maladies, mais ils ont été particulièrement difficiles à optimiser car les méthodes conduisent souvent à une UUO irréversible si l’obstruction dure plus de 3 jours6. Diverses approches ont été déployées pour résoudre ce problème, notamment la multichirurgie, la mise en place séquentielle de pinces le long de l’uretère tous les 2 jours 6,7 ; UUO suivie d’une réimplantation vésicale 8,9,10,11 ; et utilisez des pinces et des tubes non dommageables pour obstruer l’uretère 12,13,14. Des études de résultats à long terme chez le rat et la souris ont montré une amélioration de la fonction rénale, une réduction de la fibrose et/ou des lésions glomérulaires après l’inversion de l’obstruction, mais seulement une récupération partielle si l’UUO dure plus de 2 jours 6,7,8,9,12,14,15,16,17,18,19 . De plus, bien que la moelle rénale (RM) soit particulièrement sensible aux dommages causés par l’UTO20,21 jusqu’à récemment, il n’y a pas eu d’études à long terme sur des rongeurs dans lesquelles les effets d’une R-UUO prolongée sur la structure et la fonction de la MR ont été étudiés. Ceci est significatif car l’UCC et la capacité d’excréter des charges de sel sans augmenter la pression artérielle (la réponse dite de natriurèse de pression) dépendent du maintien de l’intégrité anatomique de la RM 22,23,24, de sorte qu’une réparation incomplète de la RM après l’inversion de l’UTO peut expliquer pourquoi les patients ont une susceptibilité accrue à l’IRA récurrente et à l’hypertension après l’inversion de l’UTO. Cependant, de nombreuses techniques requises pour évaluer cela nécessitent plusieurs cycles de chirurgie (cinq chirurgies majeures pour 6 jours d’obstruction 6,7), nécessitent une expertise chirurgicale difficile à enseigner (par exemple, réimplantation chirurgicale de l’uretère dans la vessie 8,9,10,11) et, comme l’obstruction est unilatérale, rendent difficile pour les chercheurs d’évaluer les changements dans la fonction rénale après l’inversion de l’obstruction.

Pour résoudre ce problème, nous avons développé un modèle murin de R-UUO qui est relativement simple à réaliser et à enseigner, nécessite un nombre plus limité de chirurgies que les autres techniques (deux chirurgies pour 5 à 7 jours d’obstruction) et permet l’analyse de la récupération fonctionnelle rénale sans avoir besoin d’études invasives et/ou coûteuses de la fonction rénalefractionnée 25. Pour cela, les souris subissent trois interventions chirurgicales majeures : 1) la mise en place d’une pince vasculaire non traumatique sur l’uretère proximal gauche ; 2) retrait de la pince vasculaire 5 à 7 jours plus tard, selon la souche de souris ; et 3) l’ablation du rein controlatéral 10 jours plus tard pour évaluer la fonction rénale. Environ 20 à 40 % des souris meurent dans les 2 à 3 jours suivant la néphrectomie, ce qui indique que l’UUO ne s’inverse pas chez toutes les souris. Le suivi à long terme des souris survivantes montre que, malgré la récupération histologique presque complète de la médullaire rénale (RM), 3 mois après la R-UUO. Il y a une fonction rénale réduite, mesurée par le débit de filtration glomérulaire transdermique (DFGt)26. De plus, il y a une réduction marquée de l’UCC, déterminée par la mesure de l’osmolalité urinaire après une restriction hydrique, suggérant qu’il y a un défaut permanent dans la fonction RM. Des études sur l’évolution temporelle montrent que si le DFGt s’améliore entre les jours 28 et 56 après l’étude RUUO, il se stabilise entre les jours 56 et 84. En revanche, il n’y a pas d’amélioration de l’UCC entre les jours 28 et 84 après R-UUO25. En utilisant scRNA-Seq de MR isolés, validé par des études de lignage cellulaire et d’immunohistochimie, nous avons identifié de fortes réponses régénératives qui ont restauré les dimensions de RM après R-UUO, mais que tous les principaux compartiments cellulaires du RM ont montré des changements permanents dans le nombre de cellules et les signatures génétiques qui sont susceptibles d’avoir un impact sur la récupération fonctionnelle après R-UUO. Cela comprenait des réponses pro-inflammatoires persistantes dans le canal collecteur de RM et l’anse des populations de cellules de Henle 84 jours après la R-UUO, similaires aux signatures inflammatoires et de sénescence des cellules épithéliales tubulaires proximales de réparation échouées après l’IRA et l’UUO 27,28,29,30. Des changements similaires ont également été observés dans les canaux collecteurs de MR de patients atteints de calculs rénauxrécurrents 31, ce qui suggère qu’il existe une réponse bactérienne commune aux dommages causés par le RM chez les humains et les souris. Dans cet article, nous fournissons des instructions détaillées sur la façon dont nous effectuons ces chirurgies, comment nous optimisons les conditions pour son utilisation dans différentes souches de souris, comment nous déterminons si l’uretère est toujours obstrué après l’inversion, comment nous évaluons les principaux résultats fonctionnels et comment nous prélevons des tissus rénaux pour évaluer les structures médullaires rénales.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici le protocole en quatre étapes utilisé pour les études à long terme (Figure 1). Comme nous l’avons vu à la fin de ce manuscrit, les chercheurs peuvent choisir de n’en effectuer que trois (sections 1, 2 et 4) ou les quatre s’ils souhaitent étudier les résultats à long terme. Toutes les expériences sur les souris de ce manuscrit ont été approuvées par le Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee et respectent les directives d’utilisation des animaux.

1. Mise en place de la pince urétérale (10 - 15 min/souris)

REMARQUE : Comptez sur la connaissance de l’anatomie rénale de souris pour localiser l’uretère car il n’est pas possible de le voir directement sans le tissu conjonctif environnant. L’uretère longe la face postérieure inférieure du tissu hilaire lorsque le rein est exposé (Figure 2). Le choix de la pince vasculaire est important. Ceux-ci peuvent être coûteux mais peuvent être nettoyés, autoclavés et réutilisés plusieurs fois. Ces pinces peuvent être réutilisées au moins 100 fois sans problème.

  1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant l’intervention chirurgicale à 121 °C pendant 30 min. Si vous effectuez des interventions chirurgicales sur plusieurs souris, retirez le sang et les débris des instruments entre chaque utilisation et stérilisez-les pendant 10 à 15 secondes à l’aide du stérilisateur à billes chaudes. Laissez refroidir les instruments avant de les réutiliser.
  2. Pesez la souris.
  3. Anesthésier la souris à l’aide de 5 à 10 mg/kg de xylazine et de 90 à 120 mg/kg de kétamine par injection intrapéritonéale (voir le tableau des matériaux). Cela prend généralement 3 à 5 minutes pour faire effet.
  4. Administrer une analgésie préopératoire si vous utilisez un agent anesthésique différent, tel que l’isoflurane, car, contrairement à la xylazine, celui-ci n’a pas d’effets analgésiques.
  5. Rasez le site chirurgical des hanches à la cage thoracique et sur le côté, avec suffisamment de bordure pour empêcher les poils de contaminer le site d’incision. Effectuer dans une zone préparatoire, pas là où la chirurgie est effectuée.
  6. Couvrez le champ opératoire chauffé avec un champ chirurgical stérile. Il aidera à empêcher les cheveux errants d’entrer dans le champ chirurgical et fournira une zone pour poser des instruments stériles.
  7. Appliquez une pommade lubrifiante ophtalmique sur les yeux.
  8. Appliquez une préparation aseptique à l’aide d’une gaze imbibée de bétadine : frottez du centre du site vers la périphérie 3 à 4 fois, à chaque fois puis essuyez une fois avec un tampon imbibé d’alcool. Retirer toute la bétadine du champ chirurgical avant l’incision.
  9. Faites une incision dorsale longitudinale de 1,5 cm sur la ligne médiane à travers la peau et les couches sous-cutanées à l’aide de ciseaux et de pinces.
  10. Faites une petite incision à travers le muscle du flanc gauche et le fascia au-dessus du rein et extériorisez le rein gauche.
  11. Disséquez soigneusement la graisse du pôle inférieur et une partie du tissu conjonctif autour de l’endroit où l’uretère devrait se trouver. Il n’est pas possible de voir l’uretère directement sans le tissu conjonctif environnant. Ensuite, séparez l’uretère et le tissu conjonctif qui l’entoure du pédicule rénal, qui contient la veine rénale et l’artère, de sorte que le pédicule rénal ne soit pas inclus avec le clamp urétéral (Figure 2).
  12. Utilisez la pince applicatrice pour l’ouvrir et placez-le sur l’uretère directement sous le bassin. Utilisez les marques sur la pince vasculaire pour vous assurer qu’elles sont placées avec la même pression sur l’uretère pour chaque souris (figure 3). Ne pas appliquer, puis retirer la pince pour la repositionner, car cela pourrait endommager l’uretère.
  13. Une fois la pince placée, poussez doucement le rein avec la pince dans l’espace rétropéritonéal à l’aide d’un coton-tige stérile imbibé de solution saline.
  14. Fermez la couche musculaire à l’aide d’une suture résorbable.
  15. Fermez la couche de peau à l’aide de pinces de peau.
  16. Administrer l’analgésie à la buprénorphine à 3,25 mg/kg, comme indiqué dans la section sur les médicaments, et administrer 0,5 mL de solution saline normale stérile par voie sous-cutanée pour hydrater les souris.
  17. Laissez la souris sur le terrain chirurgical chauffé ou transférez-la dans sa cage domestique avec un coussin isotherme chauffé sous la moitié de la cage jusqu’à ce que la souris se réveille.
  18. Remettez la souris dans la salle des animaux.
  19. Surveillez de près la souris et administrez des doses supplémentaires de buprénorphine pour la douleur ou l’inconfort pendant 48 à 72 heures. Les signes cliniques de douleur et de détresse qui indiquent que les souris ont besoin d’une analgésie supplémentaire comprennent la dépression ou d’autres changements de comportement, une apparence anormale ou des postures telles que la piloérection, la posture voûtée, le manque de toilettage et d’alimentation ou l’immobilité.

2. Retrait de la pince urétérale (10 - 15 min/souris)

  1. Suivez les étapes 1.1 à 1.10 de la procédure de mise en place de la pince en utilisant les incisions cutanées et musculaires d’origine pour commencer à retirer la pince. Retirez les clips de plaie avant de nettoyer la zone chirurgicale. Il n’est généralement pas nécessaire de se raser à nouveau car les poils n’ont pas repoussé.
  2. En raison de l’adhérence tissulaire développée, utilisez une pince pour localiser soigneusement la pince dans l’espace rétropéritonéal sans d’abord extérioriser le rein. Utilisez les applicateurs de pince pour ouvrir doucement la pince tout en utilisant la pince pour tirer le tissu vers le bas autour de la tête de la pince pour retirer la pince.
  3. Maintenant, extériorisez le rein de manière à ce que le bassinet du rein puisse être visualisé pour déterminer l’obstruction. Le bassinet du rein doit être enflé, ce qui indique une hydronéphrose.
  4. Une fois le rein inspecté, repoussez doucement le rein dans l’espace rétropéritonéal à l’aide d’un coton-tige stérile imbibé de solution saline.
  5. Suivez les étapes 1.13 à 1.18, comme indiqué ci-dessus.

3. Néphrectomie controlatérale (10 à 15 min/souris)

  1. Rasez la zone s’il y a une croissance des poils.
  2. Utilisez un mélange isoflurane/air de 1 à 5 % pour l’anesthésie afin de permettre une récupération plus facile en raison d’événements anesthésiques antérieurs. Retirez les clips de plaie avant de nettoyer la zone chirurgicale.
  3. Administrer l’analgésie à la buprénorphine avant l’opération (voir la table des matières).
  4. Suivez les étapes 1.1 à 1.9 de la procédure en utilisant l’incision cutanée d’origine pour commencer.
  5. Faites une petite incision à travers le muscle du flanc droit et le fascia au-dessus du rein et extériorisez le rein droit.
  6. Tenez doucement le rein à l’aide d’une pince lisse et incurvée et disséquez soigneusement les pôles supérieur et inférieur du rein pour les libérer des tissus environnants.
    REMARQUE : Le tissu autour du pôle supérieur contient la glande surrénale, transportant son propre approvisionnement en sang, qui peut être retiré du rein mais ne doit évidemment pas être retiré de la souris (voir Figure 2).
  7. Après avoir libéré le rein des tissus environnants, attachez complètement la suture en soie 4-0 autour des vaisseaux rénaux et de l’uretère à l’aide d’un double nœud chirurgical. Si on le laisse pendant ~30 s, le rein devient sombre. Tenez le rein à l’aide d’une pince lisse et incurvée et retirez le rein en coupant distalement au nœud avec des ciseaux incurvés.
  8. Repoussez doucement le pédicule rénal restant dans l’espace rétropéritonéal à l’aide d’un coton-tige stérile imbibé de solution saline.
  9. Suivez les étapes 1.13 à 1.18, comme indiqué ci-dessus.

4. Prélèvement de tissus

  1. Anesthésie avec un mélange d’isoflurane et d’air à 5 % pour obtenir un plan stable d’anesthésie chirurgicale avant l’intervention terminale.
  2. Ouvrez la cavité abdominale pour exposer le rein gauche
  3. Inspectez le rein pour voir s’il y a un gonflement du bassinet du rein (voir l’étape 2.3).
  4. S’il semble que le bassinet du rein est toujours enflé, insérez une aiguille papillon de petit calibre reliée à une seringue contenant 0,5 mL d’une dilution de 1 sur 5000 de bleu de méthylène dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Si l’uretère est perméable, la solution bleue sera visible lorsqu’elle se déplacera du bassinet du rein vers la vessie. Sinon, le bassinet du rein gonflera avec une solution bleue et n’apparaîtra pas dans la vessie.
  5. Pour fixer les reins, ouvrez la cavité thoracique et exposez le cœur.
    1. Pendant que le cœur bat encore, insérez une aiguille papillon de 23 à 25 g dans le ventricule gauche, commencez une perfusion de solution saline normale et coupez l’oreillette ou le ventricule droit pour remplacer le volume sanguin par une solution saline.
    2. Après environ une minute, assurez-vous que les reins sont blancs. Continuez l’infusion saline pendant une minute supplémentaire ou remplacez-la par une perfusion de solution de formol à 10 % pendant 1 à 2 minutes supplémentaires pour fixer les tissus.
    3. À ce stade, la souris sera morte ; Récoltez les tissus. Si les tissus sont prélevés pour des études d’ARN ou de protéines, ne les fixez pas.
  6. Après avoir retiré les reins de l’animal (qu’ils aient été fixés par perfusion ou non), utilisez une lame de rasoir pour couper jusqu’à trois tranches sagittales de 2 à 3 mm d’épaisseur au centre du rein (figure 4). Cela donne des coupes représentatives qui incluent la moelle épinière et le cortex rénal et fournit suffisamment de tissu pour les tests d’histologie, de protéines ou d’ARN.
  7. Poursuivez la fixation/congélation des échantillons selon les exigences de l’étude.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour les études à long terme, nous évaluons généralement la fonction rénale en mesurant l’azote uréique sanguin séquentiel (BUN) et les débits de filtration glomérulaire transdermique (DFGt) chez des souris conscientes (voir un article précédemment publié décrivant ce26), en plus de mesurer la capacité de concentration urinaire (UCC) en évaluant l’osmolarité urinaire à partir d’échantillons d’urine ponctuels prélevés après 18 h de privation d’eau. Bien que nous effectuions toujours des études BUN,...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comparé à certaines des approches qui ont été utilisées pour étudier l’inversion de l’UUO prolongée chez la souris6,7,8,9,10,11,12,13,14, le protocole décrit ici est relativement simple et...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été soutenue par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) dans le cadre des numéros de récompense RO1DK128823 et UC2DK126122.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chlorure de sodium à 0,9 %Pharmacie VUMCmultiple
Suture résorbable Vicryl 6-0Med Vet International- ETHICONJ492G
Tampons imbibés d’alcoolTampons d’alcool isopropylique de marque BDBD 326895
Solution de bétadineHanna Pharmaceutical Supply Co., Inc67618015017
Pince d’application de pince : S& T CAF-4Outils scientifiques fins00071-14
Tampon isotherme DeltaphaseBraintree ScientificLe
Tondeuse électriqueOstermultiple
Gants chirurgicaux texturés en latex ENCOREAnsell5785003
Ethiqa XR Buprofenor (CIII) VI 1,3 mg/mLVétérinaire Patterson- Ethiqa86084010030
Clip EZ 9 mmBraintree ScientificEZC-CSou 7 mm
Applicateur EZ Clip 9 mm  ;Braintree ScientificEZC-APLou 7 mm
EZ Extracteur de clip 9 mm  ;Braintree ScientificEZC-RMVou 7 mm
Éponges de gaze 2 & aigu ; 2Fisher Scientific22-362178
Pointe dentelée coudée ou incurvée GraefeOutils scientifiques fins11049-10
Pointe dentelée droite GraefeOutils scientifiques fins11050-10
Coussin dur chauffant 15 &aigu ; 24Braintree ScientificHHP 2
Connecteurs de pompe à tampon dur chaufféBraintree ScientificConnecteur HHP Gaymar
Stérilisateur à billes chaudesOutils scientifiques fins18000-45
Seringue à insuline 0,5 mL 29 gExel International26028
L’isoflurane  ;Patterson Vétérinaire- Pivetal78949580
Kétamine 100 mg/mLPharmacie VUMC
Suture non absorable Silk 4-0Med Vet International- ETHICON683G
Porte-aiguille Olsen Hegar : avec coupe-sutureOutils scientifiques fins12002-12
Optixcare Lubrifiant pour les yeux 20 gMed Vet InternationalPHOPTIXCARE
Ciseaux-Blunt Lexer-BabyOutils scientifiques fins14078-10
Ciseaux-Sharp courbéOutils scientifiques fins14005-12
Applicateurs stériles à embout en cotonPuritain25806 2WC
Éponges de gaze stériles 4 & aiguë ; 4Fisher Scientific22-415-469
Champ chirurgical stérile jetable 18 & aigu ; 26Med Vet International20001
Poche d’instrument de stérilisation 5 &aigu ; 10Fisher Scientific01-812-54
Pompe de refroidissement de chauffage T / pumpBraintree ScientificTP-700
Pince Taylor courbée, lisseOutils scientifiques fins11017-17
Pince vasculaire : S& T 5 à 15 g de presseOutils scientifiques fins00396-01
Xylazine 100 mg/mLVétérinaire Patterson - CronusCR04305

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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