Enregistrements d’ondes rétiniennes à haute densité à l’aide d’une plate-forme d’électrophysiologie

Summary

Les réseaux de multiélectrodes à haute densité (HD-MEA) sont utilisés pour étudier les ondes rétiniennes spontanées, qui jouent un rôle crucial dans le développement des circuits neuronaux. Ce protocole décrit les étapes de préparation du tissu rétinien de souris et d’exécution d’enregistrements électrophysiologiques à l’aide de HD-MEA sur une plateforme d’électrophysiologie.

Abstract

Les ondes rétiniennes spontanées sont une caractéristique de l’activité du réseau rétinien au cours du développement, jouant un rôle crucial dans la formation du système visuel en influençant le raffinement des axones, la perméabilité du système vasculaire et la maturation globale des circuits neuronaux. Ces ondes sont couramment étudiées dans des préparations rétiniennes ex vivo à l’aide de réseaux de multiélectrodes (MEA), qui permettent des enregistrements électrophysiologiques de grandes populations d’activité des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC). L’électrophysiologie basée sur la MEA est devenue un outil puissant en raison de sa facilité d’utilisation pour collecter rapidement des données à haut débit, ce qui la rend parfaitement adaptée à l’étude de l’activité rétinienne dans diverses conditions expérimentales.

Dans ce protocole, nous décrivons les étapes critiques de la préparation du tissu rétinien pour l’acquisition de données électrophysiologiques à l’aide d’une MEA à haute densité (HD-MEA) sur une plateforme d’électrophysiologie. Le processus commence par l’isolement soigneux des rétines intactes des animaux nouveau-nés dans des conditions physiologiques. Une fois préparée, la rétine est soigneusement montée sur une puce HD-MEA, qui se compose d’une grille de 26 400 électrodes capables d’effectuer des enregistrements extracellulaires simultanés à partir d’au moins 1 000 RGC. Les enregistrements peuvent durer jusqu’à plusieurs heures. En fin de compte, cette approche méthodologique offre des applications précieuses dans l’étude du développement de la rétine, des maladies et potentiellement des études comparatives inter-espèces, contribuant ainsi à des avancées plus larges dans la recherche en neurosciences et sur la vision.

Introduction

Les ondes rétiniennes spontanées sont des poussées périodiques d’activité corrélée observées dans la rétine en développement avant le début de la vision. Chez la souris, les circuits qui initient et propagent les ondes rétiniennes changent rapidement au cours du développement, commençant à l’embryon et se terminant à l’ouverture des yeux (14e jour postnatal)¹. Au fur et à mesure que les circuits rétiniens se développent, les propriétés spatio-temporelles des ondes rétiniennes changent radicalement ^2,3. Plusieurs études soutiennent que ces propriétés spatio-temporelles spécifiques instruisent le développement du système visuel : l’activité asynchrone entre les yeux instruit la ségrégation spécifique de l’œil⁴, la taille de la zone d’onde instruit le raffinement des axones rétinotopiques dans les régions cérébrales binoculaires ^5,6, et la direction de propagation des ondes a été impliquée pour instruire les circuits de sélectivité de direction dans le colliculus supérieur³. Au-delà des circuits neuronaux, les ondes rétiniennes sont responsables du développement de la perméabilité du système vasculaire sanguin⁷. De plus, il a été découvert que les ondes rétiniennes de stade II contrôlent la croissance des zones du champ récepteur et la stabilisent dans les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR)⁸. De manière critique, des ondes rétiniennes aberrantes au cours du développement pourraient être à la base de divers troubles neurodéveloppementaux, et en effet, les ondes rétiniennes sont anormales dans un modèle murin de nystagmus^{congénital 3}. Compte tenu de leur rôle essentiel dans le développement précoce du système visuel et de leurs implications pour la maladie, il est nécessaire d’enregistrer la dynamique spatio-temporelle des ondes rétiniennes à tout âge et dans n’importe quel modèle animal.

Plusieurs méthodes ont vu le jour pour étudier les ondes rétiniennes. L’électrophysiologie unicellulaire ^9,10 et l’imagerie calcique 11,12,13,14,15 ont toutes deux conduit à des découvertes fondamentales sur les circuits et la fonction des ondes rétiniennes. Ici, nous nous concentrons sur les enregistrements multiélectrodes (MEA), une méthode qui a été utilisée depuis l’étude précoce des ondes rétiniennes¹⁶ et qui a continué à s’améliorer en tant que technique². Les MEA permettent l’enregistrement extracellulaire simultané des potentiels d’action de centaines à des milliers de RGC, ce qui permet aux chercheurs de suivre l’initiation, la propagation et la terminaison des ondes de la même manière que ce qui est possible avec l’imagerie calcique. Étant donné que les AEM enregistrent directement le potentiel d’action des CGR, les AEM peuvent être utilisés pour étudier divers modèles génétiques de souris ou d’organismes non modèles sans la complication supplémentaire de l’introduction d’un indicateur de calcium. Les tissus peuvent également être cultivés directement dans le MEA, ce qui permet des durées d’enregistrement très longues. Les MEA sont également très évolutifs, les produits actuels permettant jusqu’à six MEA actifs à la fois, ce qui pourrait permettre une évaluation rapide des rétines et catalyser la découverte de médicaments. La plus grande force des MEA est peut-être leur capacité à échantillonner de nombreuses cellules à un taux d’échantillonnage élevé, ce qui permet aux laboratoires du monde entier d’obtenir rapidement des ensembles de données riches, mais nécessite une expertise en post-traitement.

L’objectif principal de ce protocole est de fournir un protocole détaillé et reproductible pour la préparation du tissu rétinien et la réalisation d’enregistrements électrophysiologiques à l’aide d’un système MEA à haute densité à puits unique (HD-MEA) pour étudier les ondes rétiniennes spontanées ex vivo. Cette méthode garantit une acquisition de données à haut débit et de longue durée, ce qui la rend adaptée à un large éventail d’études sur le développement et les maladies. Le nouveau système avancé HD-MEA basé sur CMOS, qui permet > 1 000 sites d’électrodes à la fois, offre plusieurs avantages par rapport aux approches électrophysiologiques traditionnelles. Son réseau d’électrodes haute densité (26 400 électrodes) permet des enregistrements extracellulaires précis et simultanés à partir de jusqu’à 1 012 RGC, en capturant des modèles d’activité spatiale à petite échelle. La conception à puits unique offre des conditions d’enregistrement uniformes¹⁷. De plus, ce système permet des enregistrements à long terme de plusieurs heures, ce qui permet d’étudier la dynamique des ondes dans diverses conditions physiologiques et pharmacologiques sans dégradation significative du signal¹⁸. En fournissant un protocole, cette étude vise à rendre la technologie HD-MEA accessible à un public plus large de chercheurs en neurosciences, en ophtalmologie et en sciences de la vision. Cette méthode représente une avancée significative dans l’étude des ondes rétiniennes, offrant de nouvelles voies pour étudier le développement précoce du système visuel, les mécanismes de la maladie et les interventions thérapeutiques potentielles.

Protocol

Ce protocole décrit les étapes d’isolement et de préparation du tissu rétinien des souris néonatales pour les enregistrements MEA des ondes rétiniennes à l’aide de la plateforme HD-MEA de Maxwell Biosystems. La procédure est conçue pour préserver les conditions physiologiques, en veillant à ce que le tissu rétinien reste structurellement intact, exempt de dommages et correctement préparé pour un contact optimal des électrodes. Ces expériences ont été approuvées par le programme de soins et d’utilisation des animaux de Vanderbilt, sous le numéro de protocole M2200056-00. Les souris (âgées de 1 à 2 semaines, des deux sexes) ont été logées dans un vivarium jour/nuit de 12 heures et nourries avec un régime alimentaire régulier.

1. Préparation du tissu rétinien

1. Isolement de la rétine
   REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux, l’équipement et les réactifs utilisés dans ce protocole (voir également la figure 1).
   1. Préparer l’espace de travail
      1. Préparez du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) : 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM de glucose, bullé avec du carbogène : 95 % O₂/5 % CO₂ (pH 7,4, osmolarité 290 ± 10 mOsm) et conservez-le à 5 °C. Conservez le LCR aC sur de la glace pendant qu’il est oxygéné pendant 10 minutes avant la dissection.
         REMARQUE : Le CaCl₂ doit être ajouté en dernier, après que la solution ait été bullée avec du carbogène pendant 10 min.
      2. Commencer l’oxygénation de l’aCSF frais et glacé (pendant au moins 10 min).
      3. Installez des outils de dissection et un microscope.
   2. Euthanasier l’animal selon les directives de l’établissement.
   3. Énucléer les yeux à l’aide de ciseaux à ressort incurvés-
      1. Étant donné que les chiots postnatals ont les yeux fermés jusqu’à P11-13 (chez la souris) et que les paupières doivent être ouvertes avec soin, utilisez une micro-pince pour saisir les paupières et des ciseaux à ressort pour les retirer. Retirez soigneusement les yeux à l’aide de ciseaux à ressort, en évitant les lésions oculaires.
      2. Coupez le nerf optique et placez les yeux dans un LCR oxygéné. À l’aide d’une pipette de transfert, déplacez doucement l’œil entre les boîtes de Pétri.
         REMARQUE : Pour le reste du protocole de dissection, rafraîchir avec de l’aCSF oxygéné toutes les 10 min.
   4. Sous un microscope de dissection,
      1. Faites une petite incision dans la cornée à l’aide d’une aiguille tout en stabilisant l’œil avec une pince.
      2. Disséquez brutalement la cornée en la déchirant doucement le long du périmètre scléral.
      3. Retirez l’iris et la lentille. Si la rétine est fixée au cristallin chez les jeunes animaux, séparez-la doucement à l’aide d’une pince.
         REMARQUE : Chez les jeunes animaux, la rétine est parfois attachée au cristallin. Utilisez la pince pour retirer doucement la lentille de la rétine à l’aide d’une paire de pinces pour tirer sur la lentille et l’autre reposant sur les bords extérieurs de la rétine pour maintenir la rétine en place pendant le retrait de la lentille.
   5. Orientez la rétine.
      1. Identifiez la face ventrale à l’aide du tissu choroïde (voir Sondereker et ^al.19 pour un protocole détaillé sur l’orientation) et positionnez-la face au chercheur avec la couche RGC vers le haut.
      2. À l’aide d’un scalpel incurvé, effectuez une coupe de référence de 45° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre à partir de l’axe ventral.
      3. À l’aide d’une pince fine, séparez doucement la rétine de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) et de la sclère.
         REMARQUE : Chez les souris plus jeunes, l’EPR se détache facilement de la rétine. Chez les souris plus âgées, l’EPR est plus attaché à la rétine. Si, après avoir retiré l’EPR de la majorité de la rétine, l’EPR est toujours ancré à la rétine via le nerf optique, utilisez des ciseaux à ressort pour couper cette connexion. Cela permet d’éviter d’endommager le tissu rétinien près du nerf optique.
   6. Les rétines néonatales n’ont presque pas de corps vitré, mais les rétines plus anciennes en ont (apparaît comme un filament brun le long du bord de la rétine, mais les fibres se connectent également les unes aux autres dans l’humeur vitrée). À l’aide de la pince fine, retirez le tissu vitré qui se trouve au-dessus de la couche RGC.
      REMARQUE : Cette couche fibreuse se détache parfois lorsque la lentille est retirée. Si ce n’est pas le cas, il est important d’en retirer le plus possible, sinon cela empêchera le bon contact des CGR avec les électrodes.
   7. À l’aide d’un scalpel, faites quatre coupes en relief pour aider la rétine à rester à plat dans le plat. Pour connaître et maintenir l’orientation par la suite, coupez les deux coins du quadrant ventral à l’aide d’un scalpel.

2. Montage de la rétine sur la puce MEA

1. Montage de la rétine-
   1. Transférez doucement la rétine de la boîte de Pétri vers la puce MEA à l’aide de la pipette de transfert avec la pointe coupée. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’aCSF dans la puce pour couvrir le fond du puits.
   2. Utilisez la brosse à un seul poil pour manœuvrer doucement la rétine à positionner au-dessus des électrodes, la couche RGC face aux électrodes.
   3. À l’aide de la pipette de 10 μL, prélevez délicatement l’aCSF supplémentaire autour du tissu rétinien. Inclinez la puce à un angle pour vous débarrasser de l’aCSF supplémentaire.
      REMARQUE : Ne touchez jamais les électrodes ou les amplificateurs avec la pointe de la pipette. Au fur et à mesure que le LCR est enlevé, la rétine s’aplatit davantage. Si une partie de la rétine est repliée sous elle-même, utilisez la brosse à poil unique pour ramasser doucement sous le dépliant souhaité pour le déplier. Pour éviter que la rétine ne bouge lors du dépliage d’une partie des feuillets, une deuxième brosse à un seul poil peut être utilisée pour appliquer une légère pression au centre de la rétine, là où le nerf optique se connecte.
   4. Séchez le puits autant que possible en inclinant le copeau à un angle de 45° et en retirant le reste de l’aCSF qui s’accumule dans la partie inclinée du copeau.
      REMARQUE : Cela augmentera la connexion entre la rétine et les électrodes.
   5. Utilisez du papier filtre pour tamponner et sécher doucement les bords de la rétine. Placez la puce MEA dans une chambre d’enregistrement.
2. Amélioration du contact des électrodes
   1. À l’aide d’un porte-mouchoir remplaçable, vous pousserez doucement la rétine sur les électrodes, ce qui assurera un contact optimal et améliorera le rapport signal/bruit.
      REMARQUE : L’insert du porte-mouchoir doit cesser d’être abaissé dès qu’il entre en contact avec la rétine (une « tache humide » claire sera visible au point de contact). Un abaissement supplémentaire du porte-électrode risque d’endommager le tissu rétinien. Passer rapidement de l’étape 2.1.4 à l’étape 2.2.1 pour minimiser la durée pendant laquelle la rétine reste sans LCR aoxygéné ; Cette étape est essentielle et doit être réalisée le plus rapidement possible. Il est important d’aller vite lors de l’aplatissement de la rétine sur la puce, cependant, il est également important que la majeure partie de l’aCSF de la dissection soit séchée afin que la rétine établisse un bon contact avec l’électrode. Aller trop vite pour oxygéner la rétine risque de ne pas avoir un bon contact avec les électrodes d’enregistrement, et aller trop lentement risque de voir les cellules rétiniennes devenir hypoxiques et mourir. Nous constatons que 30-60 s conduit à un bon contact et à des rétines saines (c’est-à-dire que nous observons des ondes rétiniennes typiques).
   2. À l’aide du système de perfusion référencé, commencer à bien remplir la puce MEA avec de l’aCSF oxygéné à un débit de 2 mL/min.
      REMARQUE : Un système de perfusion ouvert est recommandé, car le bruit électrique reste faible et il fournit un nouveau LCR à la rétine. Assurez-vous qu’un système de chauffage en ligne est attaché à la configuration de perfusion pour réchauffer l’aCSF dans des conditions physiologiques.
   3. Allumez le chauffage en ligne du système de perfusion pour réchauffer l’aCSF à 32-34 °C.

3. Enregistrements électrophysiologiques

1. Enregistrements extracellulaires-
   1. Allumez le système d’enregistrement.
   2. Sur l’ordinateur d’acquisition, double-cliquez d’abord sur l’icône Serveur , puis sur Étendue pour l’ouvrir.
   3. Cliquez sur l’icône Initialiser dans l’interface Scope et entrez l’ID de la puce MEA pour commencer les enregistrements extracellulaires à l’aide du système MEA.
   4. Cliquez sur l’icône Décalage dans l’interface Scope pour configurer le décalage.
   5. Ajustez les paramètres de gain et de filtre pour optimiser la détection du signal. Utilisez les paramètres par défaut de gain 512 et un passe-haut de 300 Hz ; réglez la fréquence d’échantillonnage à 20 kHz.
   6. Sélectionnez la configuration d’enregistrement appropriée. La surface active totale pouvant être échantillonnée est de 3,85 x 2,1 mm². Le logiciel permet aux utilisateurs de choisir comment configurer l’espacement des électrodes ; Pour suivre ce protocole, utilisez le réglage par défaut qui répartit uniformément les électrodes d’enregistrement sur la zone active maximale, car cela échantillonne sur la plus grande partie possible de la rétine. Cela conduit à un espacement de 87,5 μm par électrode d’enregistrement.
   7. Laissez la rétine s’acclimater à la chambre d’enregistrement pendant 60 min.
   8. Commencez l’enregistrement d’activités spontanées à partir de RGC en accédant à l’onglet Essai et en sélectionnant l’icône Créer un nouveau test. Choisissez le type de test réseau , attribuez un nom de fichier approprié, puis cliquez sur OK pour enregistrer la configuration. Définissez la durée souhaitée pour l’enregistrement en ajustant le paramètre Durée d’enregistrement (s). Activez l’option Seul pic pour vous concentrer sur les données de pointe, puis cliquez sur l’icône Exécuter le test pour commencer la session d’enregistrement.
      REMARQUE : Pour les enregistrements d’ondes rétiniennes de 10 min et plus, nous vous recommandons d’utiliser le paramètre de pointes uniquement , qui enregistre uniquement les horodatages des potentiels d’action à l’aide d’un outil de détection de pointes intégré au lieu de la trace électrophysiologique brute complète par canal. En effet, un enregistrement prolongé (>10 min) sur 1 024 canaux peut facilement aboutir à des fichiers de données de la taille d’un To qui sont techniquement difficiles à analyser et ralentissent considérablement la progression de la recherche. Nous avons confirmé que les données brutes utilisant les temps de pointe ne reproduisent que les propriétés spatio-temporelles connues des ondes rétiniennes : pour les ondes de stade II, nous observons de grandes ondes qui couvrent la majeure partie de la rétine et se produisent à des fréquences qui correspondent aux rapports précédents (voir Figure 2). Nous notons que si le projet de recherche nécessite une analyse plus approfondie des formes d’onde de pointe, l’enregistrement de la trace électrophysiologique brute est une nécessité.
   9. Surveillez périodiquement l’enregistrement en cours pour vous assurer que l’acquisition des données se déroule comme prévu et que le système fonctionne correctement.

4. Procédure de nettoyage

1. Une fois l’enregistrement terminé et les données enregistrées, éteignez le chauffage en ligne, puis éteignez le système de perfusion.
2. Retirez délicatement l’insert du porte-mouchoir et extrayez la puce MEA. Nettoyez la puce en la rinçant d’abord avec de l’éthanol à 70 %, puis avec de l’eau désionisée (DI).
3. Pour éviter l’obstruction de la tubulure, rincez le système de perfusion avec de l’eau DI pendant 15 min.

Results

Enregistrements à haut débit et analyse des ondes rétiniennes avec des MEA HD
Nous avons réalisé un enregistrement HD-MEA d’une heure d’ondes rétiniennes spontanées (Figure 2). Un graphique matriciel de l’activité neuronale montre le modèle structuré des ondes rétiniennes, où chaque point représente un potentiel d’action détecté à partir d’une électrode individuelle (Figure 2A, en bas). La somme de l’activité entre les électr...

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une méthode reproductible et à haut débit pour préparer le tissu rétinien et effectuer des enregistrements HD-MEA, offrant une méthode robuste pour étudier l’activité du réseau rétinien. La technologie HD-MEA offre des avantages significatifs par rapport aux techniques électrophysiologiques et d’imagerie traditionnelles, notamment pour la capture de données à haut débit. HD-MEA fournit des enregistrements en temps réel, à l’échelle de la milliseconde, de l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette de transfert jetable de 3 mL (avec extrémité coupée)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Aide à déplacer la rétine entre les boîtes de Pétri.
Liquide céphalo-rachidien artificiel (LCa)			Maintient les conditions physiologiques du tissu rétinien ; composé de NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glucose et bouillonné avec du carbogène.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Pour préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa)
Approvisionnement en carbogen (95 % O2, 5 % CO2)			Utilisé pour oxygéner le LCR et maintenir la viabilité des tissus.
Scalpel à lame incurvée (#10)	Integra	4-110	Utilisé pour couper les tissus avec précision.
Microscope de dissection (stéréoscope)	Zeiss	Stemi 508	Indispensable pour la visualisation et la manipulation du tissu rétinien.
glucose	Fisher Chemicals	BP350-1	Pour préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF)
Chauffage en ligne	Système multicanaux	TC02	Réchauffe l’aCSF à 32-34° ; C pour des conditions optimales.
Système de perfusion Ismatec	Ismatec	ISM4208	Maintient un flux continu de LCR oxygéné.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Pour préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF)
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	Pour préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF)
Unité d’enregistrement Maxwell Biosystems		MX1-BRD	Interface entre la puce MaxOne et le
système Système MaxOne Maxwell	Biosystems	Système central MX1-SYS	pour les recodrings électrophysiologiques basés sur MEA.
Porte-tissus MaxOne avec micromanipulateur à 3 axes et inserts remplaçables	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Assure un placement précis de la rétine sur la puce MEA.
Puce MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Réseau de microélectrodes haute densité pour l’enregistrement de l’activité neuronale.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Pour préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	Pour préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (LCa)
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Pour préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa)
Aiguille (30 G x ½ ;)	BD Biosciences	305106	Aide à faire des incisions dans la cornée.
Animaux néonatals (P1-P14 ; souris)			Organismes modèles tels que les souris, les rats ou d’autres organismes utilisés pour les études rétiniennes.
PC avec logiciel MaxLab Live Scope	HP	Z4	Utilisé pour l’acquisition de données et l’analyse d’enregistrements.
Boîte de Pétri (35 mm ou 60 mm)	Pyrex	3483E12	Utilisée comme espace de travail pour la dissection.
Roboz micro Pince Adson (RS-5232, 4,75" de long, 1 x 2 dents, pointe de 0,5 mm)	Roboz	RS-5232	Pince spécialisée pour la dissection fine.
Ciseaux à ressort Roboz (RS-5671, tranchant de 10 mm, largeur de pointe de 0,15 mm, 3¾ ; " longueur totale)	Roboz	RS-5671	Ciseaux de précision pour couper des tissus délicats.
Petit			pinceau modifié en un seul poil pour manipuler les tissus délicats.
Deux pinces à pointe fine	Roboz	RS-5060	Utilisé pour la manipulation délicate des tissus.
Papiers filtres Whatman (#1), coupés en petits morceaux	GE Healthcare	1001-042	Utilisés pour la manipulation et le séchage des tissus rétiniens.