Method Article

Modèle tissulaire tridimensionnel à haut débit pour la quantification des seuils d’électroporation

DOI:

10.3791/68494

⸱

August 19th, 2025

 ,  ,  , 
1North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole utilise la modélisation informatique pour quantifier les seuils d’électroporation réversibles et irréversibles en utilisant la distribution spatiale des cellules transfectées dans une imitation tissulaire tridimensionnelle pour l’analyse à haut débit des protocoles d’électroporation.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’électroporation est une technologie prometteuse qui utilise des impulsions électriques pour l’administration de macromolécules et l’ablation des tissus mous, avec des applications qui incluent la prophylaxie de nouvelle génération et le traitement de maladies génétiques telles que le cancer. Cette étude fait la démonstration d’un modèle de culture tissulaire 3D à haut débit pour la quantification des seuils d’électroporation réversibles et irréversibles pour un protocole d’électroporation donné. En utilisant un champ électrique non uniforme et en analysant la distribution spatiale des cellules transfectées, il est possible d’identifier des seuils réversibles et irréversibles dans un seul échantillon, ce qui augmente l’efficacité avec laquelle les protocoles d’électroporation peuvent être caractérisés, en particulier pour la traduction in vivo . Pour montrer cette capacité, des imitations de tissus 3D contenant des cellules HEK293 ont été transfectées à l’aide d’un anneau et d’une électrode à broche pour délivrer un plasmide codant pour la GFP. Des seuils d’électroporation ont ensuite été calculés sur la base d’images de microscopie fluorescente des échantillons transfectés. Ce modèle démontre un potentiel d’utilisation comme moyen d’évaluation à haut débit des protocoles d’électroporation, un avantage clé par rapport aux méthodes actuelles d’évaluation de ces seuils, qui ont tendance à prendre beaucoup de temps et sont moins représentatifs des conditions in vivo .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’électroporation réversible (RE) est une méthodologie bien établie pour délivrer une variété de composés et de molécules normalement imperméables aux membranes dans les cellules 1,2,3. Ici, les champs électriques pulsés (PEF) sont utilisés pour atteindre une intensité de champ électrique critique qui induit des nanopores transitoires et localisés le long de certaines parties de la membrane cellulaire. L’ER a été utilisé pour délivrer une variété de molécules et de composés allant des colorants et des acides nucléiques aux chimiothérapies et autres médicaments 4,5,6,7,8,9,10. Cependant, si l’intensité du champ électrique est suffisamment augmentée, il peut atteindre un seuil critique plus élevé, ce qui entraîne une baisse rapide de la viabilité cellulaire 1,2,11,12. Ce processus est connu sous le nom d’électroporation irréversible (IRE) et a été étudié pour l’ablation des tissus mous, y compris comme traitement des tumeurs autrement inopérables et des arythmies cardiaques 11,12,13,14,15,16. Pour comprendre les résultats des traitements et éclairer les traitements futurs, la quantification de ces seuils d’ER et d’IRE est une pratique courante dans la recherche sur l’électroporation 12,17,18,19,20. Cependant, les seuils d’ER et d’IRE varient en fonction de nombreux facteurs, notamment le type de cellule, la tension appliquée, la durée d’impulsion, le nombre d’impulsions et le taux de délivrance d’impulsions 1,17,18,21,22.

Les protocoles d’électroporation ont un certain nombre de paramètres qui se traduisent par des seuils RE et IRE variés 1,17,18,21,22. Les tensions et les formes d’onde de traitement optimales ont longtemps été étudiées. La plupart des technologies d’électroporation disponibles dans le commerce utilisent des protocoles avec des PEF monopolaires de l’ordre de 100 μs-10 ms23. Bien que ces protocoles obtiennent des résultats cliniquement pertinents, ils induisent des contractions musculaires intenses in vivo 24,25,26. Pour cette raison, les impulsions bipolaires de la microseconde, plus courtes, qui atténuent cette stimulation, sont devenues un sujet d’intérêt récent 1,11,24. Cependant, ces impulsions introduisent de nouveaux facteurs qui affectent les seuils d’ERE et d’IRE, notamment la symétrie d’impulsion, la durée de rafale et la dépendance à la température 1,17,22,27. De plus, il a également été démontré que le type de cellule et les propriétés tissulaires affectent de manière significative les résultats de l’ER et de l’IRE 19,28,29. À mesure que le domaine continue d’évoluer, il est nécessaire de caractériser davantage la façon dont ces facteurs et leurs interactions les uns avec les autres et avec d’autres facteurs environnementaux possibles affectent les seuils d’ER et d’IRE, ce qui rend de plus en plus nécessaire d’améliorer l’efficacité expérimentale pour permettre une expérimentation à plus haut débit.

Des expériences d’électroporation in vitro typiques testent les protocoles en traitant les cellules dans une cuvette avec des plaques conductrices parallèles, ce qui permet d’obtenir une distribution uniforme du champ électrique à l’intérieur de la cuvette pendant le traitement 19,30,31,32,33,34. Comme mentionné ci-dessus, il est nécessaire d’identifier les seuils d’ENR et/ou d’IRE d’un protocole afin d’identifier une tension appliquée optimale pour un traitement donné. Pour que cela soit réalisé dans les études de cuvettes, plusieurs cuvettes doivent être traitées, chacune avec des tensions appliquées discrètes. Cela nécessite un nombre important d’échantillons qui doivent être préparés, traités et analysés séparément, ce qui limite le débit expérimental. Pour améliorer ce processus, des modèles de culture 2D35,36 et 3D 13,20,27,37,38,39 ont été développés pour évaluer un continuum d’intensités de champ dans un seul échantillon en utilisant des électrodes qui créent des distributions de champ non uniformes 13,20,27,37,38 et 39. Les seuils RE et IRE sont ensuite dérivés de modèles informatiques de la distribution du champ électrique 13,20,27,37,38. Cela réduit considérablement le nombre d’échantillons nécessaires, ce qui permet une approche plus à haut débit de la quantification des seuils.

Cet article vise à démontrer cette approche pour la quantification de terrain des RE et IRE dans un modèle 3D in vitro afin de démontrer son potentiel en tant que moyen d’évaluation efficace des protocoles d’électroporation dans plusieurs environnements (e.g., types de cellules, paramètres de traitement, molécules à délivrer).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation cellulaire

  1. Dans une enceinte de biosécurité, les plaques 1 × 105 cellules/mL de la lignée cellulaire HEK293 dans un volume de 10 mL par flacon de culture tissulaire T75 dans le milieu essentiel minimum d’Eagle complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine.
  2. Incuber des cellules HEK293 dans un incubateur humidifié à 37 °C avec un environnement à 5 % de CO2 .
  3. Récoltez les cellules pour les expériences 2 jours après l’ensemencement en prélevant le milieu de culture et en traitant les cellules avec 4 ml de trypsine-EDTA à 0,25 %.
  4. Incuber les cellules et la trypsine pendant 3 à 5 minutes dans un incubateur humidifié à 37 °C avec un environnement à 5 % de CO2 ou jusqu’à ce que les cellules se détachent de la surface de culture.
  5. Inactiver l’activité enzymatique de la trypsine en ajoutant 4 mL du milieu de culture.
  6. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 180 × g et les remettre en suspension dans le milieu de culture jusqu’à une concentration finale de 8 × 106 cellules/mL.

2. 3D création de modèles de tissus

REMARQUE : Utilisez le pipetage inversé pour ces étapes afin d’éviter l’introduction de bulles d’air dans le mélange.

  1. Dans une enceinte de biosécurité, bien mélanger la suspension de cellules de 8 × 10 à6 cellules/mL préparée avec une solution de collagène bovin de type I (3 mg/mL) dans un rapport de 1:1. Placer sur de la glace ou dans un bain de billes froides pour éviter une polymérisation prématurée pendant le travail avec le mélange.
  2. Pipette 500 μL de la solution combinée pour enrober le fond de chaque puits d’une plaque de 12 puits. Assurez-vous que le gel enrobe uniformément le fond en commençant à distribuer la solution au centre du puits, puis en spiralant doucement vers l’extérieur.
  3. Faites tourner doucement la plaque pour vous assurer que les bords du gel entrent en contact avec les parois du puits.
  4. Incuber les gels dans un incubateur humidifié à 37 °C avec un environnement à 5 % de CO2 pendant 6 h ou jusqu’à ce que les gels deviennent fermes et ne bougent pas lors de l’inclinaison de la plaque.
  5. Inclinez la plaque du puits et ajoutez doucement 500 μL de milieu de culture dans chaque puits en le laissant glisser le long de la paroi de la plaque au moins 1 h avant le traitement. Les gels doivent être traités dans les 48 heures suivant leur création.

3. Fabrication de l’électrode

  1. Retirez le raccord Luer en plastique sur deux aiguilles de seringue à embout émoussé en acier inoxydable 304 de 1,64 mm. Mettez une aiguille de côté pour servir d’électrode de broche. Pour l’autre aiguille, aplatissez les derniers 5 mm d’une extrémité.
  2. Créez l’électrode annulaire en découpant une section de tube en acier inoxydable 316 de diamètre extérieur de 19 mm, suffisamment longue pour être alignée contre le fond de la plaque du puits.
  3. Concevez un porte-électrode comme illustré à la figure 1 à l’aide d’un logiciel de CAO. Assurez-vous que le support dispose d’un trou central pour l’électrode à broche, d’une rainure pour l’électrode annulaire et d’un trou qui coupe la rainure afin que l’aiguille aplatie puisse être insérée pour créer un ajustement serré qui maintient l’électrode annulaire en place.
    1. Assurez-vous également que le support a une lèvre conçue pour s’adapter parfaitement à une plaque à 12 puits et pour centrer l’anneau et les électrodes à broches dans le puits de sorte que les électrodes et le puits soient tous coaxiaux38.
  4. Fabriquer le porte-électrode en acrylique à l’aide de techniques de découpe laser éprouvées40.
  5. Assemblez l’électrode en insérant l’anneau et les électrodes à goupille dans le porte-électrode.
  6. Fixez l’électrode annulaire en insérant à la pression l’aiguille avec une extrémité aplatie dans le support.

4. Traitement d’un modèle tissulaire 3D par électroporation

  1. Dans une enceinte de biosécurité, inclinez la plaque et aspirez 400 μL de milieu de culture de chaque puits. Veillez à ne pas entrer en contact avec le gel. 100 μL de milieu doivent être laissés dans chaque puits aspiré pour maintenir l’hydratation du gel. S’il y a moins de 400 μL de liquide à aspirer (la pipette ne laisse aucun liquide/aspire de l’air), ajoutez 100 μL de milieu de culture.
  2. Ajoutez 20 μL de solution plasmidique de GFP de 5 μg/μL dans ces puits aspirés (pour un volume total de 120 μL par puits) en inclinant la plaque et en ajoutant le réactif au fluide qui s’accumule contre la paroi de chaque puits. Agitez doucement pour vous assurer qu’il s’étale uniformément sur la surface du gel.
  3. Incuber les gels dans un incubateur humidifié à 37 °C avec un environnement à 5 % de CO2 pendant 10 min.
  4. Insérez la sonde de température à fibre optique dans l’électrode de la broche et commencez à lire la température.
  5. Connectez le fil positif de l’électroporateur à l’électrode à broche et le fil négatif à l’aiguille fixant l’électrode annulaire.
  6. Allumez la plaque chauffante et chauffez les gels pour qu’ils maintiennent une température de 37 °C.
  7. Insérez l’électrode annulaire et à broche avec la sonde de température à fibre optique dans la broche du puits. Assurez-vous que la broche est perpendiculaire à la plaque et que les deux électrodes sont en contact complet avec le gel.
  8. Assurez-vous que le gel est à 37 °C.
  9. Administrer un traitement d’électroporation.
  10. Ajoutez 100 μL de média à tous les gels qui semblent secs.
  11. Répétez les étapes 4.7 à 4.10.
  12. Une fois tous les traitements terminés, incubez les gels dans un incubateur humidifié à 37 °C avec un environnement à 5 % de CO2 pendant 10 min.
  13. Inclinez la plaque du puits et ajoutez doucement 500 μL de milieu de culture dans chaque puits en le laissant glisser le long de la paroi de la plaque.
  14. Incuber les gels dans un incubateur humidifié à 37 °C avec un environnement à 5 % de CO2 pendant 24 h.

5. Lavage et imagerie

  1. Inclinez la plaque et aspirez le milieu de culture de chaque puits. Veillez à ne pas entrer en contact avec le gel.
  2. Inclinez la plaque et ajoutez doucement 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans chaque puits en la laissant glisser le long de la paroi de la plaque.
  3. Incuber les gels dans un incubateur humidifié à 37 °C avec un environnement à 5 % de CO2 pendant 5 min.
  4. Inclinez la plaque et aspirez le PBS de chaque puits. Veillez à ne pas entrer en contact avec le gel.
  5. Inclinez la plaque et ajoutez doucement 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans chaque puits en la laissant glisser le long de la paroi de la plaque.
  6. Faites tourner doucement la plaque, inclinez-la et aspirez le PBS de chaque puits. Veillez à ne pas entrer en contact avec le gel.
  7. Ajoutez 100 μL de PBS frais pour garder les gels hydratés pour l’imagerie.
  8. Plaque d’image utilisant des techniques de microscopie fluorescente standard. Cela devrait donner des images de gels avec une région verte distincte en forme de tore où les seuils de champ électrique réversibles et irréversibles délimitent respectivement les bords extérieur et intérieur de la région.
  9. Inclinez la plaque du puits et ajoutez doucement 500 μL de milieu de culture dans chaque puits en le laissant glisser le long de la paroi de la plaque.
  10. Incuber les gels dans un incubateur humidifié à 37 °C avec un environnement à 5 % de CO2 pendant 24 h.
  11. Répétez les étapes 5.1 à 5.10 pour chaque point temporel.

6. Création de modèles informatiques

  1. Ouvrez un logiciel de simulation physique et créez un nouveau modèle axisymétrique 2D qui utilise la physique des courants électriques, des transferts de chaleur dans les solides et du chauffage électromagnétique.
  2. Créez des paramètres pour la tension, la température ambiante, la température de la plaque chauffante, le point de consigne de température, le taux de délivrance d’impulsions, la dose électrique intégrée et les dimensions de l’anneau et des électrodes à broches, du gel et de la plaque de puits de la configuration expérimentale.
  3. Créez des géométries de domaine représentant une section radiale des électrodes annulaires et broches, du gel et de la plaque de puits du dispositif expérimental, comme le montre la figure 2A.
  4. Placez un point de sonde à l’intérieur de l’électrode centrale à mi-hauteur du gel pour représenter la sonde de température à fibre optique utilisée lors de l’expérimentation in vitro.
  5. Créez une fonction par morceaux qui utilise la température comme argument d’entrée.
  6. Définissez la fonction de telle sorte que sa valeur soit 1 lorsque la température est inférieure au paramètre de consigne de température défini à l’étape 6.2, et 0 dans le cas contraire.
  7. Appliquez une condition aux limites de tension à la surface la plus haute de la géométrie du domaine représentant l’électrode de broche et réglez la valeur de tension sur le paramètre de tension défini à l’étape 6.2 multiplié par la fonction par morceaux de l’étape 6.6 évaluée à la température du point de sonde créé à l’étape 6.4.
  8. Appliquez une condition aux limites de terre à la surface la plus haute de la géométrie du domaine représentant l’électrode annulaire.
  9. Appliquez une condition limite d’isolation électrique à toutes les limites de domaine restantes.
  10. Créez une fonction continue qui utilise la température.
  11. Définissez la fonction à l’aide d’un modèle27 établi de la conductivité dépendante de la température du gel de collagène comme 0,8277 + 0,0323*T.
  12. Définissez un matériau personnalisé et réglez la conductivité électrique sur la fonction continue définie à l’étape 6.11. Appliquez ce matériau sur le domaine du gel.
  13. Définissez les matériaux ou utilisez les paramètres par défaut du logiciel si disponible pour attribuer des matériaux en acier inoxydable 304 et 316 aux domaines de l’électrode de la broche et de l’anneau, respectivement, et du polystyrène aux domaines de la plaque de puits.
  14. Appliquez une condition aux limites de température à la base du modèle et définissez la valeur de température sur 37 °C.
  15. Appliquez une condition limite de rayonnement ambiant de surface à toutes les autres arêtes de domaine qui n’interagissent pas avec un autre domaine et définissez l’émissivité sur 0,97, 0,9 et 0,075, selon que le domaine faisait partie de la plaque, du gel ou de l’électrode, respectivement27.
  16. Ajoutez un maillage triangulaire libre au modèle. Définissez la taille de l’élément sur Finer.
  17. Si vous évaluez différents niveaux de paramètres, créez un balayage paramétrique qui répertorie toutes les valeurs auxquelles un paramètre doit être évalué.
  18. Lancez la simulation en cliquant sur le bouton Calculer .
  19. Une fois terminé, créez un tracé 2D du champ électrique dans la section Résultats.
  20. Définissez la ligne de coupe à passer de l’électrode à broche à l’électrode annulaire en passant par le milieu du domaine du gel. Cela devrait entraîner une décroissance exponentielle du bord de l’électrode à broche vers le bord de l’électrode annulaire.
  21. Exportez les données de tracé sous forme de fichier .csv ou .xlsx pour créer une table de correspondance.

7. Calcul du seuil

  1. À l’aide du logiciel du microscope, mesurez le diamètre des bords extérieur et intérieur de la région en forme de tore le long des axes vertical et horizontal. Si le logiciel n’a pas cette capacité, utilisez ImageJ pour le faire.
  2. Faites la moyenne des diamètres extérieur et intérieur, respectivement, et divisez par deux pour calculer les rayons extérieur et intérieur de la région en forme de tore. Le rayon extérieur marque le seuil RE. Le rayon intérieur marque le seuil IRE.
  3. À l’aide de la table de correspondance créée à l’étape 6.21, calculez l’intensité du champ électrique aux rayons mesurés.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’anneau et l’électrode à broche ont délivré avec succès un plasmide d’ADN codant pour une protéine fluorescente verte (GFP) dans des imitations de tissu de collagène 3D intégrées avec des cellules HEK293. La quantification du seuil d’ER a été obtenue en mesurant le rayon extérieur de la région transfectée et en dérivant l’intensité de champ correspondante à partir du modèle de calcul du dispositif expérimental, comme le montre la figure 2. Le seuil IRE a été...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grâce à cette méthode, il est possible d’identifier des seuils d’électroporation réversibles et irréversibles sans qu’il soit nécessaire de tester plusieurs échantillons à des tensions discrètes. L’utilisation d’un champ électrique non uniforme permet une quantification basée sur la distribution spatiale des cellules transfectées dans le modèle. Cependant, il existe des limites associées à cette distribution non uniforme. Tout d’abord, les seuils RE et IRE décrits dans le présent documen...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été effectué à l’Université d’État de Caroline du Nord et financé par les National Institutes of Health (R01CA272550).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25 % trypsine-EDTAGibco25200056
Pointes de pipette 1000 uLFisher Scientific13-811-164
Tube conique de 15 mLFisher Scientific14-959-70C
Pointes de pipette de 200 uLFisher Scientific13-811-139
Aiguilles à pointe émoussée en acier inoxydable 304McMaster CarrRéférence 75165A753
Tube en acier inoxydable 316McMaster CarrRéférence 89785K319
AcryliqueMcMaster CarrRéférence 8505K754
Cabinet de biosécuritéFisher Scientific13-261-312
Logiciel de CAODassault SystèmesSolidWorks (en anglais)
CentrifugeuseNuaireNU-C200R
ÉlectroporateurHbio45-0662Un appareil sur mesure et un système BTX ECM 830 ont été utilisés dans cette étude
EMEMFisher ScientificMT10009CVCela peut varier  ; si vous utilisez une lignée cellulaire autre que HEK293
Falcon Plaque de culture cellulaire multipuits à fond plat transparent à fond plat traitée TC, avec couvercleCorning353043N’importe quelle plaque à 12 puits peut être utilisée, assurez-vous simplement que les dimensions du puits sont prises en compte lors de la fabrication du porte-électrode.
FBSFisher ScientificA5670701
Sonde de température à fibre optiqueMicronor Inc.TS5-20MM-02
Plasmide GFPAldeverongWiz-GFP
Cellules HEK293ATCCCRL-1573D’autres lignées cellulaires peuvent être utilisées, il suffit de s’assurer que le bon milieu de culture est utilisé
Plaque chauffanteRefroidissement thermoélectrique Société américaineAHP-301CPV
Bain de glace ou de billes réfrigéréFisher Scientific10-876-001
Logiciel d’analyse d’imagesLeicaLAS X
IncubateurFisher Scientific15-015-2633
Microscope à fluorescence inverséeLeicaDMi8
Découpeuse laserMcMaster CarrRéférence 7344N11
Pénicilline-streptomycineFisher Scientific15140122
Pipette KitFisher Scientific14-388-100
Logiciel de simulationCOMSOLCOMSOL Multiphysique 6.2
Fiole T75Fisher Scientific156499
Solution de collagène bovin de type IBiomatrice avancée50053 mg/mL

References

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