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Article de méthode

Approche évolutive étape par étape de la production durable de bioplastique à partir de déchets alimentaires

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DOI :

10.3791/68499

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18 juillet 2025

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1Department of Biological Systems Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Quasar Energy Group, 3Department of Environmental Science and Technology, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente une méthode évolutive de conversion des déchets alimentaires en bioplastiques biodégradables en polyhydroxyalcanoates (PHA) biodégradables. Il utilise la digestion anaérobie arrêtée pour le prétraitement des déchets alimentaires, la fermentation microbienne halophile pour la biosynthèse des PHA et un processus en aval sans produits chimiques pour la récupération des PHA.

Résumé

La crise mondiale des microplastiques, associée aux défis croissants de l’élimination des déchets alimentaires, nécessite des solutions innovantes pour résoudre ensemble ces problèmes environnementaux. Les polyhydroxyalcanoates (PHA) sont des bioplastiques uniques qui sont entièrement biodégradables dans tous les environnements, y compris les écosystèmes marins, offrant une alternative durable aux plastiques à base de pétrole. Dans le même temps, l’utilisation des déchets alimentaires comme matière première pour la production de PHA constitue une stratégie efficace pour atténuer les défis de l’élimination des déchets alimentaires tout en produisant des plastiques biodégradables de grande valeur. Cette étude fournit un protocole étape par étape pour produire des PHA à partir de déchets alimentaires, en mettant l’accent sur les soins critiques nécessaires pour garantir une teneur et une qualité élevées en PHA cellulaires. Le processus commence par l’arrêt de la digestion anaérobie, qui convertit les déchets alimentaires en acides gras volatils (AGV) assimilables par les microbes en maintenant un environnement anaérobie et en optimisant les paramètres, tels que le temps de rétention des solides, afin de maximiser la production d’AGV, un précurseur clé de la synthèse des PHA. Le digestat riche en VFA est ensuite utilisé pour cultiver Haloflex mediterranei, un micro-organisme halophile capable d’accumuler jusqu’à 66 % ± 5 % de son poids en cellules sèches. L’environnement de culture à haute salinité de H. mediterranei a empêché la contamination des cultures, assurant une production optimale de PHA. La croissance cellulaire est surveillée en mesurant la densité optique afin de déterminer le moment idéal pour la récolte des PHA. Les cellules sont lysées à l’aide d’une méthode sans produits chimiques, à base d’eau, exploitant un gradient de pression osmotique, permettant d’obtenir une récupération de 93 % ± 3 % de PHA, suivie d’une purification à base de solvant pour obtenir une pureté de PHA de 96 % ± 2 %. Chaque étape est essentielle pour garantir la production de plastiques biodégradables de haute qualité. Cet article fournit des méthodes détaillées pour la digestion anaérobie arrêtée, la fermentation en culture pure, la lyse cellulaire sans produits chimiques et la purification du PHA à base de solvants, offrant une approche évolutive et durable pour convertir les déchets alimentaires en bioplastiques biodégradables adaptés aux applications pilotes et à grande échelle.

Introduction

La pollution plastique et l’élimination des déchets alimentaires sont des préoccupations environnementales croissantes, soulignant la nécessité d’approches innovantes qui répondent à ces deux défis grâce à la gestion durable des déchets et au développement des matériaux1. Les plastiques conventionnels à base de pétrole contribuent grandement à la pollution de l’environnement et à la contamination par les microplastiques, persistant dans les décharges et les écosystèmes aquatiques pendant des siècles2. Les polyhydroxyalcanoates (PHA), une classe de bioplastiques microbiens, offrent une alternative entièrement biodégradable avec des propriétés mécaniques comparables aux plastiques conventionnels tout en assurant une dégradation complète dans les milieux naturels3. Cependant, les coûts de production élevés des PVVIH restent un obstacle important à l’adoption commerciale généralisée4. Une approche prometteuse pour surmonter cette limitation consiste à exploiter les déchets organiques comme source de carbone rentable pour la biosynthèse microbienne des PHA, car les matières premières représentent environ 50 % des dépenses de production totales dans les processus industriels actuels qui reposent sur des sources de carbone pures telles que l’amidon de maïs ou le glucose5. En valorisant les déchets, cette approche permet non seulement de détourner les matières organiques des sites d’enfouissement, mais aussi de les transformer en une alternative durable aux plastiques à base de pétrole, tout en s’attaquant aux problèmes d’accumulation de déchets et de pollution plastique.

H. mediterranei, un micro-organisme halophile, démontre un grand potentiel pour l’utilisation de matières premières dérivées de déchets pour la production de PHA en raison de sa capacité à prospérer dans des conditions de salinité élevée (2-5 M NaCl), ce qui empêche naturellement la contamination en inhibant la croissance des microbes non halophiles6. Cet environnement à haute salinité élimine la nécessité d’une stérilisation stricte dans la fermentation industrielle, réduisant ainsi les coûts opérationnels. Contrairement aux producteurs bactériens traditionnels de PHA, H. mediterranei métabolise efficacement une gamme variée de sources de carbone dérivées de déchets et il a été rapporté qu’elle accumule des PHA jusqu’à 70 % de son poids de cellules sèches (DCW) en tant que mécanisme de réponse au stress 7,8. De plus, son environnement à haute salinité permet un traitement simple en aval, car le choc osmotique induit par l’immersion dans l’eau perturbe efficacement les cellules, permettant la libération de PHA sans avoir besoin de traitements enzymatiques ou chimiques9. Ces avantages positionnent H. mediterranei comme un candidat idéal pour la production de bioplastiques évolutifs à base de déchets.

Des études existantes ont exploré divers déchets, y compris le lactosérum de fromage, les eaux usées des moulins à huile et les résidus agro-industriels, pour la fermentation PHA par H. mediterranei 6,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . La grande variabilité de la composition des déchets représente un défi important, nécessitant différentes stratégies de prétraitement, telles que l’hydrolyse enzymatique, l’hydrolyse acide ou le traitement thermique, avant l’assimilation microbienne 11,17,19,20. Ici, la digestion anaérobie arrêtée (aAD) fournit une solution évolutive en convertissant divers déchets alimentaires en un digestat homogène riche en acides gras volatils (AGV), servant de précurseur direct pour la synthèse des PHA par H. mediterranei21,22. Ce processus améliore l’uniformité de la matière première et atténue la variabilité du substrat tout en améliorant l’efficacité de la fermentation microbienne.

Malgré son potentiel, seules quelques études ont réussi à démontrer ce processus en deux étapes intégrant la fermentation aAD et PHA microbienne pour la conversion générale des déchets alimentaires en bioplastique par H. mediterranei 23,24,25. Cette étude fournit un protocole détaillé étape par étape couvrant le prétraitement des déchets alimentaires, la production d’AGV par aAD semi-continu et la fermentation en culture pure de H. mediterranei pour la production d’PHA. De plus, alors que des études antérieures ont validé l’extraction du PHA à l’eau de H. mediterranei, aucune n’a quantifié l’efficacité et la pureté de la récupération du PHA à l’aide de cette méthode11,18. Cette étude comble cette lacune en démontrant la méthode de récupération du PHA sans produits chimiques utilisant la lyse osmotique avec de l’eau et en quantifiant son efficacité de récupération par rapport aux méthodes traditionnelles de récupération du PHA à base d’hypochlorite de sodium (NaClO)26. De plus, cette étude évalue la pureté du PHA récupéré dans l’eau, fournissant une évaluation complète de son efficacité pour la production de bioplastiques à grande échelle.

Pour combler le fossé entre la faisabilité à l’échelle du laboratoire et la mise en œuvre industrielle, ce protocole est conçu pour être évolutif dans les applications industrielles, intégrant la fermentation aAD et PHA à l’échelle pilote, ainsi que la centrifugation sur disque pour la séparation cellulaire, une technique largement utilisée dans les bioprocédés et la fermentation microbienne à grande échelle27. En optimisant la conversion des déchets alimentaires en bioplastique, cette méthode soutient l’industrialisation de la valorisation des déchets à grande échelle, faisant ainsi progresser les initiatives de bioéconomie circulaire. L’intégration de matières premières dérivées de déchets, la fermentation halophile et une stratégie de récupération des PHA respectueuse de l’environnement permettent une conversion efficace des déchets en biopolymères, réduisant ainsi la dépendance aux plastiques à base de combustibles fossiles tout en favorisant la production durable de bioplastiques.

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Protocole

1. Collecte et préparation des déchets alimentaires

  1. Collectez les déchets alimentaires des restaurants locaux, comme le montre la figure 1A. Évaluez visuellement les déchets obtenus. Les observations ont révélé que les déchets étaient principalement constitués d’épluchures de légumes, de viande crue jetée et de composants riches en glucides tels que le riz et les nouilles. Il peut être nécessaire de mesurer le rapport carbone/azote (C :N) comme indiqué aux étapes 5.1 et 5.2, et de l’ajuster si les déchets alimentaires sont principalement riches en carbone, avec un rapport C :N optimal proche de 20:128.
  2. Mettez 10 kg de déchets alimentaires dans un seau de 5 gallons et ajoutez 2,5 L d’eau. Connectez le mélangeur à une source d’alimentation. Plongez la lame dans le mélange de déchets alimentaires et d’eau, puis appuyez sur le bouton Start pour commencer à mélanger. Mélanger pendant au moins 30 minutes jusqu’à ce que le mélange soit complètement homogénéisé (figure 1B). Déplacez la lame de haut en bas pour assurer un mélange complet des déchets alimentaires.
    ATTENTION : Pour éviter la surchauffe, il peut être nécessaire de relâcher le bouton de démarrage du mélangeur pendant 1 minute après chaque 2 minutes de fonctionnement.
  3. Après avoir mélangé, retirez le mixeur et nettoyez-le avec de l’eau chaude et du savon à vaisselle. Couvrez le seau avec un couvercle, étiquetez le seau avec le nom de l’échantillon et la date de préparation, et rangez-le à 4 °C, s’il n’est pas utilisé immédiatement.
    REMARQUE : En raison des variations des propriétés des déchets alimentaires collectés à partir de différentes sources et à différents moments, les paramètres de base de la boue préparée, tels que les solides totaux (TS) et les solides volatils (VS), doivent être mesurés sur la base de l’étape 5.1 après chaque préparation afin de garantir des entrées TS et VS précises pour une utilisation ultérieure. Dans ce protocole, 4 °C sont pour le stockage à court terme (moins de 7 jours), et -20 °C sont utilisés pour le stockage à long terme.

figure-protocol-1
Figure 1 : Comparaison visuelle des déchets alimentaires des restaurants avant et après l’homogénéisation. Les photographies montrent (A) des déchets alimentaires bruts et (B) du lisier de déchets alimentaires homogénéisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Production d’AGV par aAD

  1. Fonctionnement d’un digesteur aAD à l’échelle pilote (100 L) (Graphique 2A) pour la conversion des déchets alimentaires en AGV.
    1. Vérifiez la connexion électrique et l’étanchéité à l’air du digesteur pilote aAD. Réglez la température du digesteur à 35 °C et la vitesse d’agitation à 150 tr/min.
    2. Appuyez sur le bouton Raise pour soulever le couvercle du digesteur. Arrêtez-vous une fois que le couvercle se lève d’environ 40 cm en appuyant sur le bouton Stop .
    3. Ajouter la culture recueillie à partir d’un digesteur de semences aAD dans le digesteur pilote aAD jusqu’à ce qu’elle atteigne un volume de travail de 80 L. Des informations détaillées sur le digesteur de graines peuvent être trouvées dans une étude précédente25.
    4. Appuyez sur le bouton inférieur jusqu’à ce que le couvercle soit complètement fermé, puis fixez-le avec les pinces. Cela garantit que le digesteur maintient des conditions anaérobies.
    5. Dans cette étude, un temps de rétention solide (TRS) de 9 jours a été maintenu dans le digesteur aAD. Alimentez et déchargez 1/3 du volume de travail du digesteur (environ 26,7 L) tous les 3 jours, comme décrit ci-dessous.
      REMARQUE : La digestion anaérobie traditionnelle est opérée avec un SRT de 14 à 30 jours pour une production de méthanede 29,30. Une courte TRS de 9 jours est utilisée ici pour inhiber la méthanogenèse, favorisant l’accumulation d’AGV pour une MAA réussie.
    6. Décharge d’une partie du contenu de l’aAD avant l’alimentation. Pour faciliter le déchargement et éviter le colmatage, augmentez temporairement la vitesse d’agitation du digesteur de 150 tr/min à 200 tr/min et maintenez cette vitesse pendant 20 minutes avant de décharger.
      REMARQUE : L’augmentation de la vitesse d’agitation assure une répartition uniforme des particules solides dans le digestat, ce qui facilite le déchargement et l’échantillonnage homogène.
    7. Ouvrez la soupape de refoulement au bas du digesteur pilote aAD et déchargez 1/3 du volume de travail du digestat. Recueillir le digestat rejeté dans des seaux et les stocker à 4 °C pour l’analyse des AGV et la séparation solide-liquide ultérieure à l’étape 2.2.
    8. Si l’on utilise un taux de charge organique (OLR) de 2,5 g VS/L-jour, et le VS de la boue de déchets alimentaires est en moyenne de ~14,5 % (tableau 1). Pour cela, un poids humide de 4,1 kg de boue de déchets alimentaires est nécessaire sur la base de l’équation 1 pour atteindre le OLR conçu. Prélevez un échantillon de ce lisier de 4,1 kg et placez-le dans un seau séparé pour l’alimentation ultérieure.
      Poids humide du lisier de déchets alimentaires à nourrir = figure-protocol-2 (1)
      où la RLL est de 2,5 g VS/L-jour, l’intervalle d’alimentation est de 3 jours, le volume de travail est de 80 L et le VS est de 14,5 %.
    9. Ajoutez de l’eau dans un seau séparé contenant les 4,1 kg de boue de déchets alimentaires de poids humide susmentionnée jusqu’à ce que vous atteigniez le volume calculé à partir de l’équation 2, soit 26,7 L dans cet exemple.
      figure-protocol-3(2)
      Lorsque l’intervalle d’alimentation est de 3 jours, le volume de travail est de 80 L et le SRT est de 9 jours.
    10. À l’aide d’une pompe péristaltique, injectez ce lisier de déchets alimentaires de 26,7 L dans le digesteur aAD de la figure 2A. Assurez-vous que le tube d’entrée de la pompe péristaltique reste immergé dans le liquide du seau d’alimentation jusqu’à ce que tout le liquide soit transféré.
      REMARQUE : Pendant le processus d’admission, le tube peut vibrer légèrement, ce qui est normal.
    11. Éteignez la pompe et débranchez l’alimentation. Réinitialisez la vitesse d’agitation du digesteur pilote à 150 tr/min pendant 30 min pour homogénéiser la nouvelle alimentation avec le digestat existant.
    12. Décharger 3 L de digestat homogénéisé dans un seau afin d’ajuster le pH. Versez 100 ml de digestat sur les 3 L de digestat homogénéisé dans un bécher et mesurez le pH.
    13. Ajouter graduellement les granules de NaOH dans le digestat de 100 mL jusqu’à ce que son pH atteigne 5,5. Pour calculer le poids des granulés de NaOH ajoutés, calculez la perte de poids du récipient de granulés de NaOH avant et après l’ajustement du pH.
    14. Ajouter des granulés de NaOH proportionnellement au volume de digestat dans le digesteur pilote de la figure 2A pour ajuster le pH à 5,5. Par exemple, s’il faut 0,09 g de granulés de NaOH pour ajuster 100 ml de digestat homogénéisé à un pH de 5,5, 72 g de granulés de NaOH doivent être chargés dans le digesteur pilote aAD car son volume de travail est de 80 L, c’est-à-dire 80 L / 0,1 L × 0,09 g = 72 g.
      REMARQUE : Étant donné que la plage de pH idéale pour l’aAD est de 5-5,531, après chaque repas, le pH doit être ajusté à 5,5. Au cours de l’aAD, le pH baissera toujours en raison de la réaction d’acidification. Par conséquent, il est fortement recommandé de suivre les étapes 2.1.13 à 2.1.16 pour vérifier et ajuster le pH quotidiennement, si nécessaire.
    15. Vérifiez le digesteur pilote pour vous assurer que toutes les vannes sont fermées et ajustez la vitesse d’agitation à 150 tr/min pour fournir un mélange intermittent pour le prochain cycle de fonctionnement aAD.
      REMARQUE : Le digesteur pilote aAD de cette étude fonctionne en mode semi-continu pour imiter les procédés industriels32.
  2. Séparation surnageante pour la récupération des AGV pour la fermentation PHA
    1. Allumez l’interrupteur d’alimentation principal de la centrifugeuse à disque.
    2. Attendez que le texte STANDSTILL s’affiche sur l’écran du système d’interface homme-machine (IHM). Vérifiez que le niveau d’huile de lubrifiant est supérieur au seuil minimum.
    3. Ouvrez la vanne de la conduite d’eau et ajustez la pression à 45 psi. Ouvrez la vanne de la conduite d’air et ajustez la pression à 90 psi.
    4. Appuyez sur le bouton vert sur l’écran du système IHM pour démarrer le processus de production de la centrifugeuse à disque. Attendez que le système ait terminé ses vérifications.
    5. Surveillez jusqu’à ce que le système atteigne la vitesse maximale définie, qui est indiquée par STANDBY sur l’écran du système IHM.
      REMARQUE : La vitesse de la centrifugeuse à disques est réglée à sa capacité maximale pour une séparation à haut rendement.
    6. Assurez-vous que le tuyau d’arrivée est immergé dans le récipient de digestat déchargé. Connectez le tuyau de sortie du surnageant de la centrifugeuse à disque à un seau vide de 5 gallons pour recueillir le surnageant, qui sera utilisé pour la fermentation ultérieure du PHA. Raccorder la sortie des solides à un seau vide séparé pour recueillir les solides résiduels du digestat (figure 2B).
    7. Utilisez la pompe péristaltique pour alimenter le digestat à l’entrée de la centrifugeuse à disques. Pendant ce temps, cliquez sur le bouton PROD sur l’écran du système IHM. PROD est l’abréviation de Production.
    8. Ajustez la vanne d’entrée pour maintenir un débit compris entre 0,2 et 0,5 m3/h et une contre-pression entre 0,5 et 1 bar.
      REMARQUE : Le surnageant circule pour obtenir un taux de séparation plus élevé pendant le processus de production, qui fait référence à l’étape de séparation solide-liquide de la centrifugeuse à disque, tandis que les solides sont accumulés dans la centrifugeuse à disque.
    9. Après 30 minutes du processus de production, appuyez sur le bouton Discharge (Décharge) sur l’écran du système HMI pour décharger les solides et le surnageant dans le godet respectif (Figure 2B).
      REMARQUE : Cette étape est basée sur un contrôle visuel, car l’efficacité de séparation en termes de TS ne peut pas être mesurée instantanément. En règle générale, 30 minutes de fonctionnement sont suffisantes pour obtenir la séparation souhaitée entre le surnageant et le résidu solide.
    10. Conserver le surnageant recueilli à 4 °C pour la fermentation ultérieure du PHA. Éliminez les solides résiduels conformément à la réglementation sur l’élimination des biodéchets ou recirculez dans le digesteur aAD pour une digestion ultérieure.
    11. Démarrez le cycle de nettoyage en place (NEP) en sélectionnant le bouton NEP sur l’écran de l’IHM. Lavez la centrifugeuse à disque en suivant les étapes spécifiées dans le tableau 2.
      REMARQUE : Une pompe péristaltique est utilisée pour alimenter et décharger les fluides de lavage. Cette étape de lavage est importante pour l’entretien de l’équipement.
    12. Une fois le lavage terminé, éteignez et débranchez la pompe péristaltique, puis appuyez sur le bouton PROD pour vous assurer que la centrifugeuse à disque évacue tout du réservoir de séparation. Réduisez progressivement la vitesse de rotation.
    13. Appuyez sur le bouton rouge sur l’écran du système HMI pour arrêter les opérations. Tournez les vannes de la conduite d’eau et d’air en position OFF . Coupez l’alimentation principale.

figure-protocol-4
Figure 2 : Équipement utilisé pour la production d’AGV et la séparation solide-liquide. (A) Digesteur aAD à l’échelle pilote de 100 L. (B) décharge du surnageant et des solides dans les godets respectifs à partir du réservoir de séparation de la centrifugeuse à disques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

ParamètresDéchets alimentaires
TS ( %)~16,5
VS ( %)~14,5
C :N~17:1

Tableau 1 : Caractéristiques de l’exemple de gaspillage alimentaire.

PasMédiaTempératureButPériode (min)Volume de décharge (L)Notes
1EauFroidPour la chasse d’eau primaire51L’eau usée passe généralement dans l’égouttage.
2EauChaud (70 °C)Pour la thermolyse de la levure, le cas échéant51L’eau usée passe normalement soit dans l’égouttage, soit circule.
3Solution de NaOH à 2 %Chaud (70 °C)Pour dissoudre les dépôts de protéines, le cas échéant201La solution circule normalement.
4EauChaud (70 °C)Pour le rinçage51L’eau usée passe normalement soit dans l’égouttage, soit circule.
5Solution d’acide nitrique à 1 %Chaud (70 °C)Pour dissoudre les dépôts inorganiques101Si de l’eau douce est utilisée, un lavage à l’acide n’est nécessaire que quelques fois par an. Dans ce cas le retour peut passer à l’évacuation. Si de l’eau dure est utilisée, un lavage à l’acide peut être nécessaire à chaque NEP. Dans ce cas, un système de circulation doit être utilisé.
6EauChaud (80–95 °C)Pour le rinçage et la stérilisation51Si la turbidité du débit de cette étape est élevée, répétez l’opération à partir de l’étape 2.

Tableau 2 : Instructions de lavage de la centrifugeuse à disques.

3. Fermentation PHA à l’aide d’un surnageant de digestat riche en VFA

  1. Fermentation PHA à l’échelle de banc pour déterminer les conditions optimales pour la mise à l’échelle.
    1. Ajouter de l’eau pour diluer le surnageant de digestat recueilli à l’étape 2.2.9 jusqu’à un gradient de concentrations afin de déterminer le temps de dilution optimal qui minimise les effets inhibiteurs des composés toxiques potentiels présents dans le surnageant de digestat des déchets alimentaires tout en assurant une compromission minimale de la croissance cellulaire23.
      REMARQUE : Une dilution minimale de 2 fois est généralement nécessaire pour atténuer ces effets inhibiteurs25.
    2. Compléter le surnageant de digestat dilué avec du sel et des nutriments, en particulier 156 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure, 13 g/L de MgCl26H2O, 20 g/L de MgSO47H2O, 1 g/L de CaCl22H2O, 4 g/L de KCl, 0,2 g/L de NaHCO3 et 0,5 g/L de NaBr, et NH4Cl selon les besoins33.
    3. Mesurer la salinité du surnageant de digestat à l’aide d’une sonde de conductivité avant d’ajouter du NaCl. Le digestat des déchets alimentaires a généralement une salinité négligeable ; cependant, en cas de salinité élevée, ajuster la posologie de NaCl en fonction de l’équation 3.
      Ajout de NaCl (g) = 156 g/L de NaCl × volume total de milieu préparé - figure-protocol-5 × volume surnageant de digestat ajouté (3)
    4. Maintenir le rapport C :N du milieu fabriqué à partir du surnageant de digestat à 15. Déterminer l’ajout de NH4Cl en fonction du rapport C :N natif du surnageant de digestat, mesuré en termes de carbone organique total (COT) et d’azote total (TN), comme indiqué aux étapes 5.2 et 5.3.
    5. Agitez le milieu à l’aide d’une plaque d’agitation magnétique à 200 tr/min jusqu’à ce que tous les suppléments soient complètement dissous. Ajustez le pH du milieu à 7,0 ± 0,05 en utilisant 1 N NaOH ou 1 N H2SO4.
    6. Répartir le milieu préparé dans des erlenmeyers stériles, en ne remplissant que 1/5 du volume afin de maintenir un grand espace libre pour un transfert d’air adéquat pendant la culture (figure 3A). Couvrez la fiole avec du coton ou tout type de matériau respirant avec une porosité suffisante pour permettre l’échange de gaz pendant la culture.
    7. Décongeler la culture de graines de H. mediterranei (activée à partir de la collection commerciale American Type Culture Collection (ATCC) 33500 qui est entreposée à -80 °C) en l’agitant doucement dans un bain-marie réglé à une température de croissance normale de la souche H . mediterranei (p. ex., 37 °C). La décongélation doit être rapide, c’est-à-dire environ 2 minutes ou jusqu’à ce que tous les cristaux de glace aient fondu.
    8. Inoculer une culture de graines de H. mediterranei à 0,2 % (v/v) avec une DO600 nm de ~0,5 dans le milieu préparé. Préparer une fiole témoin positive avec inoculation et une fiole témoin négative sans inoculation avec le milieu ATCC 117633.
      REMARQUE : La composition nutritionnelle du milieu ATCC est la même que celle décrite à l’étape 3.1.2, sauf que le surnageant de digestat est remplacé par 1 g/L de glucose et qu’aucune source d’azote supplémentaire n’est ajoutée.
    9. Incuber tous les flacons à 37 °C avec agitation à 150 tr/min dans un agitateur orbital. Mesurez quotidiennement la densité optique (OD600nm) jusqu’à ce qu’elle se stabilise en phase stationnaire, puis arrêtez la culture. Prélever le bouillon rosâtre (figure 3B) pour la récupération en aval de l’APH.
  2. Fermentation PHA à l’échelle pilote dans un fermenteur en verre de 50 L.
    1. Connectez le fermenteur pilote PHA (Figure 4) et le réchauffeur à circulation d’eau à l’alimentation électrique.
    2. Allumez l’interrupteur de chauffage du bain-marie. Réglez la température à 37 °C. Allumez l’agitateur et réglez-le à 150 tr/min.
    3. Ajouter le surnageant de digestat des déchets alimentaires, préparé à l’aide du facteur de dilution optimal, ainsi que les suppléments de sel et de nutriments identifiés à l’étape 3.1.2, pour obtenir un volume de travail de 40 L.
    4. Ajustez la valeur du pH à 7. Inoculer 10 % (v/v) de culture de graines de H. mediterranei avec une DO600nm de ~0,5 dans le milieu préparé.
    5. Allumez la pompe à air du fermenteur pilote et réglez le taux d’aération à 110 m3/h. Prélever l’échantillon et mesurer quotidiennement OD600nm . Lorsque OD600nm atteint la phase stationnaire, arrêtez la fermentation et stockez le bouillon de fermentation à 4 °C pour la récupération du PHA en aval.
    6. Lavez le fermenteur avec de l’eau du robinet et de l’éthanol à 70 %.

figure-protocol-6
Figure 3 : Fioles de pré et post-fermentation de la production de PHA par H. mediterranei. (A) Milieu dans des flacons fabriqués à partir de surnageant de digestat de déchets alimentaires avant l’incubation/fermentation. (B) Culture de H. mediterranei riche en PHA rosâtre après fermentation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-7
Figure 4 : Fermenteur PHA pilote de 50 L. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Récupération en aval des PHA

  1. Introduisez le bouillon de fermentation de H. mediterranei dans la centrifugeuse à disque pour séparer le surnageant salé et les cellules de H. mediterranei . Prélever la cellule récoltée (partie Solid Out sur la figure 5) pour la lyse cellulaire ultérieure. Éliminez la fraction Liquid Out conformément à la réglementation sur l’élimination des biodéchets.
    REMARQUE : Le fonctionnement de la centrifugeuse à disques ici est le même que celui des étapes 2.2.
  2. Remettre en suspension les cellules récoltées dans l’eau à 100 mL/g de cellules humides et mélanger à 150 tr/min pendant 2 h à température ambiante pour permettre la lyse cellulaire par choc de pression osmotique.
  3. Remettre en suspension une petite portion (50 ml) des cellules prélevées à l’étape 4.1 dans une solution de NaClO à 4 % (2 ml de solution de NaClO à 4 % par g de cellules humides) et mélanger pendant 5 min.
    REMARQUE : Le traitement au NaClO est utilisé pour fournir une base de référence qui peut vraisemblablement récupérer 100 % des cellules de H. mediterranei . Cette hypothèse est fondée sur le fait que ce traitement au NaClO est la méthode la plus largement adaptée pour le rétablissement des PVVIH34. Ce traitement au NaClO est généralement considéré comme suffisamment agressif pour permettre la lyse cellulaire complète et la récupération du PHA, quelle que soit l’espèce cellulaire.
    ATTENTION : Le NaClO est un agent oxydant puissant. Il peut provoquer de graves brûlures de la peau, des lésions oculaires et une irritation respiratoire. Manipulez toujours le NaClO dans un endroit bien ventilé ou sous une hotte, tout en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des gants, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire. En cas de contact avec la peau, rincez immédiatement la zone touchée avec de grandes quantités d’eau et consultez un médecin si l’irritation persiste. Éliminez les déchets contenant du NaClo conformément à la réglementation locale en matière de déchets dangereux afin d’éviter la contamination de l’environnement.
  4. Centrifuger la suspension lysée à 10 000 x g pendant 30 min pour recueillir les granules de PHA. Éliminez le surnageant conformément aux réglementations sur l’élimination des biodéchets en laboratoire.
  5. Lyophiliser les granules de PHA à -50 °C pendant ~48 h jusqu’à ce que le poids soit constant pour obtenir de la poudre de PHA brute (figure 6A).
  6. Ajouter de l’éthanol à la poudre brute de PHA à raison de 10 mL/g pour éliminer les impuretés résiduelles. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 30 min pour recueillir les granulés de PHA purifiés. Éliminez le surnageant conformément à la réglementation sur l’élimination des déchets chimiques.
  7. Lyophiliser la pastille de PHA à -50 °C pendant ~48 h jusqu’à ce qu’un poids constant soit atteint pour obtenir de la poudre de PHA purifiée (Figure 6B).

figure-protocol-8
Figure 5 : Surnageant salé séparé (à gauche) et cellules (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-9
Figure 6 : Poudre de PHA. (A) Poudre de PHA brute et (B) Poudre de PHA purifiée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Méthodes analytiques

  1. Mesurer TS et VS selon les méthodes standard35. Déterminer TN à l’aide des kits de test Hach en suivant la méthode standard à l’aide d’un spectrophotomètre35.
  2. Mesurer le COT à l’aide d’un analyseur de COT en suivant les méthodes décrites dans une étude précédente25. Mesurez le pH à l’aide d’un pH-mètre de paillasse.
  3. Déterminer la quantification de l’AGV à l’aide d’un kit36. Surveillez OD600nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  4. Estimer la DCW à partir des solides volatils en suspension (VSS) du bouillon de cellules mesurés selon la méthode de mesure standard VSS25,35. Brièvement, centrifugez 50 mL de bouillon cellulaire à 8 000 x g pendant 15 min et transférez la pastille dans un creuset pour l’analyse VSS.
    REMARQUE : Utilisez la VSS pour estimer la DCW, car elle reflète la biomasse organique et évite la surestimation due à la teneur en sel de H. mediterranei23.
  5. Effectuer la quantification de l’ASP par chromatographie en phase gazeuse (CG) selon les méthodes d’une étude précédente25, dans laquelle la biomasse lyophilisée est méthanolylée dans du chloroforme et du méthanol acidifié à 105 °C pendant 2 h, et les monomères résultants sont quantifiés à l’aide de la CG avec du benzoate de méthyle comme étalon interne. Calculez la récupération des PHA à l’aide de l’équation 4 et la pureté des PHA à l’aide de l’équation 5. Déterminez toute la masse de PHA à partir de GC.
    Récupération des PVVIH ( %) = figure-protocol-10 (4)
    Pureté du PHA ( %) = figure-protocol-11 (5)
    ATTENTION : Le chloroforme et l’acide sulfurique utilisés dans la quantification des PHA sont dangereux et doivent être manipulés avec une extrême prudence. Le chloroforme est un solvant organique volatil qui présente des risques de toxicité par inhalation et peut causer des lésions hépatiques et rénales en cas d’exposition prolongée. L’acide sulfurique est un produit chimique corrosif puissant qui peut causer de graves brûlures au contact de la peau ou des yeux. Manipulez toujours ces produits chimiques à l’intérieur d’une hotte pour éviter l’exposition par inhalation. Assurez-vous d’utiliser l’EPI approprié, y compris des gants résistant aux produits chimiques, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire. Éliminez correctement tous les déchets de chloroforme et d’acide sulfurique conformément à la réglementation locale sur les déchets dangereux afin de maintenir des pratiques de laboratoire sûres.

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Résultats

Caractéristiques des déchets alimentaires et production d’AGV à partir de l’aAD
Le tableau 1 donne un exemple de rapport TS, VS et C :N dans les boues de déchets alimentaires préparés. En raison de la variabilité inhérente à la composition des déchets alimentaires selon les différentes sources d’échantillonnage et dans le temps, on s’attend à des fluctuations des valeurs des rapports TS, VS et C :N. Bien que la variabilité soit acceptable, des mesures régulières des rapports TS, VS et...

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Discussion

Production de VFA à partir d’aAD
L’AGV joue un rôle crucial en tant que précurseur clé pour H. mediterranei dans la conversion des déchets alimentaires en PHA. Par conséquent, il est essentiel de maintenir une concentration élevée d’AGV pendant la DAa. Plusieurs stratégies peuvent être employées pour augmenter la production d’AGV dans l’aAD25. Une approche efficace est l’optimisation de la TRR, d’une durée idéale de 8 jours ou moins, q...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par le ministère de l’Énergie-Office de l’efficacité énergétique et des énergies renouvelables (Prime Award No. DEEE0009268) et l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture du ministère de l’Agriculture des États-Unis (numéro de prix 2023-79000-38973).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AirGaz à airAI UZ300Utilisé pour le fonctionnement GC
Machine pneumatiqueCloudrayHailea ACO-009D
Chlorure d’ammoniumAcros OrganicsA0396560
AutoclaveSTERISAMSCO Lab 250Utilisé dans la préparation de milieux ATCC
BalanceMETTLER TOLEDOME204TE/00
MixeurVEVORIB750LV+BLD300+WB-1
SeauLowe’sModèle 50640Seau général en plastique sans BPA de 5 gallons
Chlorure de calcium dihydratéAcros OrganicsA0362932
ChloroformeMillipore SigmaRéf. C2432
DessiccateurTout type pouvant être utilisé dans la mesure TS, VS, VSS
Tubes de digestion, bouchon à vis avec doublure en PTFEMillipore SigmaCLS982613
Bloc de réacteur numériqueEntreprise HachDRB200Utilisé dans les méthodes de quantification des AGV de Hach
Agitateur numériqueSCILOGEXSCI550-Pro
Centrifugeuse à disquesAlfa Laval Inc.Clara 20 ans
ErlenmeyerAmazoneB07V3JPQMM
ÉthanolAmazoneB09DGVL4ML
LyophilisateurLabconco10030133, 1027319 et 0109621Systèmes de lyophilisation FreeZone 2,5 litres
HotteKewaunee Scientific CorporationSuprême Air LV
FourThermo ScientificModèle F30428C
Chromatographie en phase gazeuse (GC)AgilentModèle 8890  ;
Haloferax mediterraneiATCC33500
HydrogèneGaz à airHY UHP300Utilisé pour le fonctionnement GC
CouteauTout type utilisé pour la coupe des déchets alimentaires
Huile lubrifianteSociété Fisher ScientificNC9844626
Chlorure de magnésium hexahydratéSociété Fisher ScientificBP214-500
Sulfate de magnésium heptahydratéMillipore SigmaM1880
MécaniqueMillipore Sigma34860
Benzoate de méthyleMillipore Sigma93583Utilisé comme étalon interne dans la quantification des PHA
Lecteur de microplaques  ;Synergie BioTekSynergie H1
AzoteGaz à airNI UHP300Utilisé pour le fonctionnement GC
FourThermo ScientificOMH750
Pompe péristaltiqueSimply Pumps Inc.PM6000 ACPompe auto-amorçante à haut débit avec une excellente capacité de fonctionnement à sec, capable de traiter des boues à forte teneur en particules et conçue pour des tubes muraux de 1/8 de pouce.
Ph-mètreSociété Fisher ScientificAE150
Norme PHAMillipore Sigma403105
Digesteur pilote aADQuasar energy group, Independence, Ohio, États-UnisFermenteur en acier inoxydable d’un volume total de 100 L et d’un volume de travail de 80 L  ;
Fermenteur pilote PHAManukatreeSF-50l ISO 9001 CERéacteur en verre à double couche
Chlorure de potassiumG-BIOSCIENCES162006
Tube de pompeN’importe quelle marque de tube en silicone avec un diamètre intérieur de 1/8 po et un diamètre extérieur de 3/8 po
Sodium BicarbonateFisher Chemical241787
Bromure de sodiumCaroline21139-45
Chlorure de sodiumAmazon  ;B0787CFHF3
Hydroxyde de sodium, granulésBioréactifs Fisher236088
Hypochlorite de sodiumMillipore Sigma425044
Centrifugeuse Sorvall LYNX 4000 SuperspeedThermo Scientific75006580Utilisé pour la collecte des granulés de PHA dans la récupération des PHA en aval
Spectrophotomètre  ;Entreprise HachDR3900Utilisé dans les méthodes de quantification des AGV de Hach
Acide sulfuriqueMillipore Sigma258105
Filtre à seringueAmazoneB06X6GTKVY
Analyseur de COTShimadzuModèle TOC-LCSN
Test de flacon d’acides volatils TNTplusEntreprise HachTNT 872Capable de mesurer l’AGV dans la gamme de 50 à 2 500 mg/L d’acide acétique.
Chauffe-eauBosch Inc.Tronic 3000 T 7 gallons (ES8)
Extrait de levureSociété Fisher ScientificAAJ6028736

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