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Article de méthode

Détection des acides nucléiques et du gène de résistance aux médicaments de Mycoplasma pneumoniae

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DOI :

10.3791/68500

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19 septembre 2025

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1Department of Clinical Laboratory Medicine, Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital, 2Department of Clinical Laboratory Medicine, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital, 3Department of Clinical Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Southern Medical University, 4Medical laboratory, Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Doctors Station of Guangdong province, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole offre un moyen rapide et fiable de détecter les infections à Mycoplasma pneumoniae et d’identifier la résistance aux antibiotiques. Il aide les praticiens à choisir plus rapidement les bons traitements, améliorant ainsi les soins aux patients atteints de pneumonie et favorisant une meilleure utilisation des antibiotiques

Résumé

Mycoplasma pneumoniae (Mp) représente l’un des agents pathogènes les plus répandus responsables de la pneumonie communautaire (POC) dans les populations pédiatriques. La détection des gènes de résistance à Mycoplasma pneumoniae fournit un support technique solide et une base théorique pour le diagnostic clinique précis et le traitement des infections à MP. Un diagnostic et une évaluation précis de la résistance aux médicaments dans l’infection à Mp sont essentiels pour le traitement clinique. Les méthodes de détection courantes de Mycoplasma pneumoniae comprennent la culture, la détection d’anticorps et les tests basés sur la biologie moléculaire. La culture de mp est l’étalon-or pour le diagnostic, mais nécessite un milieu spécifique, prend du temps et a une faible sensibilité. La détection du Mp par anticorps est largement utilisée ; Cependant, des faux négatifs peuvent survenir au stade précoce de l’infection. La détection basée sur la biologie moléculaire offre un délai d’exécution rapide, un faible risque de contamination, une sensibilité élevée, une spécificité élevée et n’est pas limitée par le moment du prélèvement de l’échantillon ou l’état immunitaire. Il a donc été reconnu comme un nouvel étalon-or pour le diagnostic de l’infection à Mycoplasma pneumoniae . Les agents macrolides sont le traitement de premier choix pour l’infection à Mp chez les enfants. Cependant, avec l’utilisation intensive de macrolides dans les infections des voies respiratoires chez les enfants, l’incidence de l’infection à Mycoplasma pneumoniae résistante aux médicaments a augmenté. Les patients infectés par des souches résistantes présentent une durée de fièvre significativement plus longue, une hospitalisation prolongée et une fièvre prolongée après l’administration par rapport à ceux infectés par des souches sensibles. Les sites de mutation identifiés à ce jour sont les suivants : 2063, 2064, 2067 et 2617. En Chine, les mutations ponctuelles n’ont été documentées qu’aux positions 2063 et 2064, la substitution de A à G à la position 2063 étant la plus courante. Pour ces sites, la réaction en chaîne par polymérase (PCR) combinée à la technologie des sondes fluorescentes a été utilisée pour détecter les acides nucléiques et les mutations de résistance aux médicaments de Mycoplasma pneumoniae dans des échantillons d’expectorations humaines. La détection des gènes de résistance à Mycoplasma pneumoniae offre un soutien technique crucial et une base théorique pour un diagnostic précis et un traitement efficace de l’infection à Mp.

Introduction

Mycoplasma pneumoniae (Mp) est le plus petit micro-organisme pathogène capable de survie indépendante, situé à une position intermédiaire entre les bactéries et les virus. Elle est principalement disséminée par des gouttelettes respiratoires ou des aérosols et constitue le deuxième agent pathogène le plus fréquent associé à la pneumonie communautaire (POC) chez les enfants1, responsable de 20 à 40 % des cas de POC2. Mp présente une résistance inhérente aux antibiotiques β-lactamines, tels que la pénicilline et les céphalosporines, en raison de son absence de paroi cellulaire, que ces antibiotiques ciblent en obstruant la synthèse de la paroi cellulaire. Les principales modalités thérapeutiques des infections à Mp comprennent des agents qui entravent la synthèse des protéines, notamment les macrolides et les tétracyclines, ainsi que des produits pharmaceutiques qui entravent la réplication de l’ADN, tels que les tétracyclines et les fluoroquinolones 3,4,5. Par conséquent, l’identification rapide en laboratoire du Mp est essentielle pour éclairer l’application judicieuse des antibiotiques. Les méthodes contemporaines de détection du Mp en laboratoire englobent l’isolement et la culture, la détection d’antigènes, la détection d’anticorps et les techniques de diagnostic génétique.

En tant que méthode de détection traditionnelle, l’isolement et la culture continuent d’être la norme définitive pour diagnostiquer l’infection à Mycoplasma pneumoniae . Kashyap et al. ont observé que la culture du Mp à partir d’écouvillons de gorge ou d’échantillons d’expectorations est une technique de diagnostic fiable6. Cette approche se heurte à des obstacles considérables, tels que les prérequis culturels rigoureux de Mp, les périodes de culture prolongées et les faibles taux de détection positifs, qui limitent son utilisation clinique régulière. La détection de l’antigène Mp dépend des anticorps spécifiques à Mp. Miyashita et al. ont utilisé des anticorps monoclonaux de diverses souches de Mp comme agents d’enrobage dans un ELISA sandwich à double anticorps et ont évalué leur efficacité à l’aide de la PCR7. Les résultats n’ont révélé aucune différence substantielle entre les deux méthodologies. Cependant, la nécessité de disposer d’anticorps monoclonaux hautement spécifiques et à titre élevé limite la mise en œuvre extensive de cette méthode.

Suite à une infection par Mp, le système immunitaire génère des anticorps IgM et IgG spécifiques. Les anticorps IgM deviennent généralement détectables dans la semaine suivant l’infection et atteignent leur pic à 3 à 4 semaines, ce qui en fait de précieux indicateurs diagnostiques pour une infection précoce. Cependant, des résultats faussement négatifs peuvent survenir dans les premiers stades en raison d’une diminution des niveaux d’anticorps8. À l’inverse, les anticorps IgG se manifestent plus tard et signifient généralement une infection antérieure 9,10. La détection sérologique du Mp est classée en tests d’anticorps non spécifiques et spécifiques. Bien que les tests d’anticorps non spécifiques soient simples à administrer, leur spécificité est limitée, car les infections par d’autres agents pathogènes, notamment les rickettsies et les adénovirus, peuvent également augmenter les niveaux d’agglutinines froides, entraînant des résultats faussement positifs. Les dosages d’anticorps spécifiques englobent le test de fixation du complément, le test d’agglutination de particules, le test d’hémagglutination indirecte, le test d’immunofluorescence indirecte et le test immuno-enzymatique (ELISA). L’ELISA est largement utilisé en Chine en raison de sa technologie établie et de son accessibilité commerciale, offrant une sensibilité élevée et une simplicité opérationnelle, servant ainsi de méthode pratique et fiable pour diagnostiquer les infections à Mp dans la pratique clinique de routine11.

La PCR quantitative fluorescente en temps réel se distingue par son temps de traitement rapide, sa spécificité élevée, sa sensibilité robuste et son absence de réactivité croisée. Cette méthode identifie l’ADN Mp dans des échantillons d’expectorations, d’écouvillon de gorge ou de liquide de lavage bronchique, et nécessite 1 à 100 ng d’ADN par réaction. La détection a été effectuée à l’aide d’un instrument de PCR en temps réel. La matrice d’ADN subit une dénaturation à des températures plus élevées, suivie d’un recuit d’amorce et d’une hybridation par sonde fluorescente. La technologie d’amplification génique permet la réplication de fragments d’acide nucléique à des concentrations extrêmement faibles à des millions de copies en peu de temps, atteignant une sensibilité de détection de ≥10 UFC/mL12. Par rapport à la PCR conventionnelle, la PCR quantitative fluorescente en temps réel réduit les risques de contamination tout en permettant une analyse automatisée à haut débit. Par conséquent, elle est apparue comme la technique privilégiée pour la détection directe de Mp dans la pratique clinique13. En raison de sa sensibilité accrue, des mesures strictes sont nécessaires pour éviter la contamination, ce qui pourrait entraîner des résultats faussement positifs ou faussement négatifs.

En traitement clinique, les macrolides constituent l’intervention thérapeutique principale pour la pneumonie à Mycoplasma pneumoniae (MPP). L’utilisation excessive et l’application inappropriée d’antibiotiques ont imposé une pression sélective, conduisant à l’émergence de Mp résistant aux macrolides. Cette résistance contribue de manière significative à la MPP réfractaire. La résistance aux macrolides chez Mycoplasma pneumoniae est notablement élevée en Asie de l’Est, en particulier en Chine et au Japon, tandis que l’Europe et les États-Unis présentent des taux de résistance relativement plus faibles. Les patients pédiatriques présentent généralement des taux de résistance élevés par rapport aux adultes, ce qui nécessite une surveillance accrue14. Depuis 2000, l’incidence des infections à Mycoplasma pneumoniae (MRMPI) a considérablement augmenté à l’échelle mondiale, en particulier en Asie de l’Est. En Chine, les souches MRMPI représentent 69 % à 95 % des cas15, contribuant de manière substantielle à la forme grave de la maladie, à l’échec du traitement, aux complications et aux séquelles à long terme. La recherche indique que les mutations du gène de l’ARNr 23S inhibent la liaison des macrolides aux sites cibles, diminuant ainsi l’efficacité du médicament. Les loci de mutation fréquents englobent les positions 2063, 2064, 2067 et 2617. En Chine, les mutations ont été identifiées exclusivement aux positions 2063 et 206416,17. Une étude de 2016 a indiqué que les taux de résistance aux macrolides à Pékin, Harbin, Shanghai et Xinjiang variaient entre 66,7 % et 86,7 %, tandis que Nanjing présentait un taux inférieur de 20 %18. Des souches résistantes aux macrolides sont apparues dans diverses régions, avec des taux de résistance signalés comme suit : 8,3 %-9,8 % en France, 3,0 %-3,6 % en Allemagne, 8,2 % aux États-Unis, 0,9 %-2,9 % au Danemark, 12,1 % au Canada, 20 % en Italie, 22 % en Israël, 8 % en Espagne et 9,3 % au Royaume-Uni 19,20,21,22,23,24,25,26, N° 27. Cette tendance met en évidence la prolifération mondiale de la résistance aux macrolides. En 2008, Hindley et al. ont signalé 46 cas de Mycoplasma pneumoniae résistant aux macrolides, dont 40 cas présentant la mutation A2063G, un cas présentant la mutation A2063C et cinq cas présentant la mutation A2064G28. Des mutations de résistance comparables ont été identifiées au Japon et aux États-Unis, les mutations primaires se produisant aux positions 2063 et 206429. La recherche suggère une relation entre les sites de mutation et les phénotypes de résistance aux médicaments : la mutation A2063G confère une résistance aux macrolides à 14 chaînons (ML), la mutation A2064G confère une résistance aux ML à 14 et 16 chaînons, C2617G confère une résistance aux ML à 14 et 15 chaînons, et la mutation A2067G confère une résistance au ML30 à 16 chaînons. La surveillance de la résistance aux Mp est cruciale pour l’identification précoce des infections résistantes aux médicaments et pour éclairer les choix de traitement clinique. Des études ont montré que les tests de sensibilité aux antimicrobiens in vitro peuvent prédire l’efficacité clinique des médicaments31. En 2011, l’American Clinical and Laboratory Standards Institute a promulgué des lignes directrices préconisant la méthode de microdilution pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) afin d’évaluer la résistance aux macrolides32. Cependant, la détermination de la CMI peut prendre plusieurs semaines, limitant ainsi son utilité clinique dans la direction de l’antibiothérapie en temps réel.

Le séquençage de Sanger est une technique directe d’identification des mutations dans le gène de l’ARNr 23S de Mp. Cette méthode utilise des nucléotides marqués par fluorescence et une analyse électrophorétique pour déterminer les séquences d’ADN, facilitant ainsi l’identification des variations génétiques de Mp. Le séquençage de Sanger, bien qu’il soit capable d’identifier simultanément plusieurs mutations et de quantifier les ratios de souches résistantes et sensibles, demande beaucoup de travail et de temps, limitant ainsi son utilité clinique33,34. En revanche, le pyroséquençage fournit une évaluation plus précise des variations de séquences d’ADN en identifiant la libération de pyrophosphate lors de l’incorporation de nucléotides. Cette méthode permet d’identifier les souches MRMPI et de quantifier les rapports entre les souches résistantes et sensibles dans les échantillons cliniques avec une plus grande précision que le séquençage de Sanger. De plus, le pyroséquençage permet un suivi longitudinal de patients individuels, ce qui permet d’évaluer en temps réel le développement de la résistance et d’informer les modifications du traitement33. Cependant, son application clinique est limitée par la nécessité de disposer d’appareils spécialisés, d’un personnel compétent et de durées de traitement prolongées.

Sur la base de l’analyse du polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) du gène P1, Mp est classé en deux types : le type I (divisé en cinq sous-types : 1a-1e) et le type II (divisé en trois sous-types : 2a-2c). Ce test peut détecter 8 sous-types de gènes de Mycoplasma pneumoniae35. Cette méthode facilite l’identification qualitative des mutations de résistance à Mycoplasma pneumoniae et aux macrolides (sites de mutation de l’ARNr 23S 2063 (A :G) et 2064 (A :G)) dans les échantillons d’expectorations pédiatriques, fournissant un instrument de diagnostic supplémentaire rapide et simple pour les infections à Mycoplasma et la surveillance de la résistance aux antibiotiques.

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Protocole

Tous les protocoles d’étude ont été examinés et approuvés par le Comité d’éthique médicale de l’Hôpital populaire de Heyuan (Approbation n°. YXYJLL-LW2025001). Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit avant de participer.

1. Prélèvement d’échantillons

REMARQUE : Faites preuve de prudence en maintenant une technique d’asepsie pendant le prélèvement de l’échantillon.

  1. Prélever des échantillons d’expectorations du patient ou du patient suspect. Obtenir des échantillons dans les 3 jours suivant l’apparition de la maladie du patient.
  2. Demandez au patient de se rincer la bouche avec de l’eau, de respirer profondément, de retenir son souffle pendant 5 secondes et d’expirer progressivement.
  3. Demandez au patient d’expirer profondément une fois de plus, essayez d’expulser les expectorations, déposez-les dans un gobelet en plastique désigné et fermez le couvercle. Les expectorations doivent être rapidement acheminées au laboratoire clinique à température ambiante (RT). Conservez les échantillons à une température de 2 à 8 °C au réfrigérateur.

2. Préparation des réactifs d’amplification

  1. Dans la zone de préparation des réactifs du laboratoire de PCR, décongelez le tampon, la sonde d’amorce et l’eau du kit à 4 °C après les avoir récupérés du congélateur à -20 °C. Retirez l’enzyme, mélangez-la doucement en l’agitant, puis centrifugez-la à 1 006 x g pendant 10 s.
  2. Récupérez un tube à centrifuger stérile sans nucléases, étiquetez-le et préparez le système de réaction pour chaque individu, comme indiqué dans le tableau 1. Le nombre total de réactions PCR doit être égal à la somme des échantillons, d’un contrôle qualité positif faible, d’un produit de contrôle qualité W et d’un contrôle d’extraction négatif.
  3. Déterminez la quantité de chaque réactif, incorporez-le dans un tube à centrifuger de taille appropriée, mélangez soigneusement et centrifugez brièvement à basse vitesse. Versez 20 μL de réactif dans chaque tube de réaction PCR et déplacez-le vers la zone de traitement des échantillons.

3. Traitement de l’échantillon

  1. Traiter 1 mL d’échantillons d’expectorations avec 2 mL de tampon de digestion des expectorations, bien mélanger au vortex et incuber pendant 30 minutes jusqu’à ce que la liquéfaction complète soit obtenue.
  2. En fonction de la quantité d’échantillon, ajouter successivement 5 μL de l’étalon interne aux 1èreet 7èmecolonnes de la plaque d’extraction d’acide nucléique, puis ajouter successivement 200 μL d’échantillons liquéfiés, de solution saline normale et de contrôle de qualité MM faiblement positif.
  3. Récupérez une plaque d’extraction d’acide nucléique à l’aide d’un instrument d’extraction d’acide nucléique automatisé. Ajouter les acides nucléiques extraits après avoir effectué les dosages en aval dans les colonnes 6 et 12 de la plaque d’extraction.
  4. Ajout d’échantillons : Dans la zone de préparation des échantillons du laboratoire PCR, ajoutez l’acide nucléique extrait dans les 6e et 12e colonnes de la plaque d’extraction. Par la suite, transférez 5,0 μL de l’acide nucléique de l’échantillon préparé dans le tube réactionnel de la PCR, qui contient le mélange réactionnel de la PCR (y compris l’échantillon, les contrôles de qualité positifs forts et faibles, le contrôle de la qualité W et le contrôle négatif d’extraction).
  5. Fixez le liquide du tube de réaction PCR et effectuez une centrifugation immédiate pour confirmer que le liquide est correctement scellé et exempt de bulles.

4. Amplification

  1. Insérez le tube à réaction dans le détecteur PCR à fluorescence et configurez les paramètres du cycle comme suit dans le Tableau 2.
  2. Acquérez des signaux de fluorescence dans FAM (mutation A :G 2063 ou 2064), VIC (Mycoplasma pneumoniae) et CY5 (étalon interne), avec une collecte de données réglée à 64 °C.

5. Analyse des données

REMARQUE : Cette étude a utilisé la PCR quantitative en temps réel (qPCR), avec des résultats représentatifs indiquant des mutations associées à la résistance A :G aux positions 2063 ou 2064 de Mycoplasma pneumoniae. Les patients testés positifs doivent éviter les antibiotiques macrolides dans le traitement clinique.

  1. Après la réaction, l’instrument analyse et archive les résultats de manière autonome. Vérifiez que les gènes cibles pour le contrôle négatif présentent la fluorescence FAM Ct ≥ 35.33 et la fluorescence VIC Ct ≥ 35.01, tandis que les gènes cibles pour le contrôle qualité W présentent la fluorescence FAM Ct ≥ 35.33 et la fluorescence VIC Ct ≥ 35.01. Les valeurs Ct pour la fluorescence FAM et VIC dans les produits de contrôle de la qualité faiblement positifs variaient de 29,00 à 34,00.
  2. En règle générale, la valeur Ct de l’étalon interne est ≤ 35,00. Si une courbe d’amplification S caractéristique est observée, mais que l’étalon interne n’est pas amplifié en raison de la concentration élevée du gène cible, signalez-le directement comme un échantillon positif ou réévaluez l’échantillon par une dilution de gradient de 10 fois.
  3. Classer l’échantillon présentant un UNDECT ou une absence de courbe d’amplification typique de type S comme négatif.
  4. Considérer les échantillons négatifs lorsque la fluorescence FAM (mutation A :G 2063 ou 2064) Ct ≥ 35,33, la fluorescence VIC (Mycoplasma pneumoniae) Ct ≥ 35,01, ou lorsqu’il n’y a pas de courbe d’amplification typique de type S. Les échantillons sont réputés positifs lorsque leur valeur Ct correspond au Tableau 3 et présentent une courbe d’amplification caractéristique de type S.
    REMARQUE : Les résultats de la détection des échantillons dépendent de la qualité de la collecte, du traitement, du transport et de la conservation des échantillons. Toute erreur peut entraîner des résultats faussement négatifs. Le fait de ne pas contrôler la contamination croisée pendant le traitement des échantillons peut entraîner des résultats faussement positifs.

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Résultats

Après la liquéfaction, l’extraction des acides nucléiques et l’amplification par PCR par fluorescence d’échantillons d’expectorations, la valeur de départ, la valeur de fin et la valeur seuil de la ligne de base ont été modifiées après l’analyse de la courbe d’amplification. La valeur de début était 3 et la valeur de fin était 20.

Les résultats représentatifs de cette expérience étaient positifs pour l’acide nucléique Mp, et une...

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Discussion

La PCR et ses techniques dérivées présentent une sensibilité et une spécificité supérieures à celles des méthodes sérologiques dans l’identification, le typage et la détection de la résistance aux médicaments chez Mycoplasma pneumoniae (MP). De plus, les techniques basées sur la PCR offrent une facilité d’utilisation et une réduction des coûts, ce qui en fait une alternative viable pour les diagnostics cliniques de routine36. Mp est un agent pathogène not...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les réactifs expérimentaux sont soutenus par le Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Doctors Station de la province du Guangdong.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Instrument automatisé d’extraction d’acides nucléiquesGuangzhou Da 'an Gene Co., Ltd.Intelligent 32
Filtres à emboutsCoring Life Science Co., Ltd.298220010-10 et micro ; L
Filtres à emboutsCoring Life Science Co., Ltd.030230011-50 et micro ; L
Filtres à emboutsCoring Life Science Co., Ltd.056230015-300 et micro ; L
MicrotubesCoring Life Science Co., Ltd.141249341,5 ml
Mycoplasma pneumoniae kit de détection de sites de mutation de résistance aux médicaments (méthode PCR de fluorescence)Jiangsu Mole Biotechnology Co., Ltd.20241111
Réactif d’extraction d’acides nucléaires (méthode des billes magnétiques)Shengxiang Biotechnology Co., Ltd.Référence G24004
Tubes PCRDN Biotech(Hong Kong)  ; Co., Ltd.61210030,2 ml
Instrument de PCR fluorescente en temps réelBIO-RADLe CFX96

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