Quantification de la violacéine dans Chromobacterium violaceum et son inhibition par des composés bioactifs

Résumé

L’objectif de ce protocole est de quantifier la production de violacéine par Chromobacterium violaceum ATCC 12472 comme indicateur pour évaluer l’inhibition de la détection du quorum par des composés bioactifs.

Résumé

Les bactéries communiquent par le biais d’un système connu sous le nom de quorum sensing (QS), qui leur permet de coordonner leur comportement en réponse aux changements de densité cellulaire. Ce processus implique la production, la sécrétion et la détection de petites molécules de signalisation extracellulaires, généralement appelées auto-inducteurs (IA). Le QS régule un large éventail de gènes et de fonctions, notamment la formation et la dispersion du biofilm, la motilité de l’essaimage, la production de facteurs de virulence, la résistance aux antibiotiques et la bioluminescence, entre autres. L’inhibition du QS est devenue une stratégie antivirulence prometteuse contre les bactéries résistantes aux antibiotiques, car elle exerce une pression sélective plus faible que celle des antibiotiques traditionnels. Chez la bactérie Chromobacterium violaceum ATCC 12472, les protéines QS CviI/CviR, qui sont homologues aux protéines QS de type LuxI/LuxR d’Aliivibrio fisheri, contrôlent de nombreux gènes, y compris ceux responsables de la production du pigment violacéine pourpre. C. violaceum a été largement utilisé comme souche de biocapteur dans les études d’inhibition du QS, en particulier l’inhibition de la production de violacéine. De nombreux composés ont le potentiel d’inhiber le QS en se liant aux protéines QS, qu’il s’agisse d’homologues LuxI ou LuxR, perturbant ainsi les circuits du QS. Ce protocole décrit la méthode de quantification de la violacéine produite par la souche ATCC 12472 de C. violaceum et son inhibition par des composés bioactifs à des concentrations qui n’affectent pas la croissance bactérienne. Le dosage décrit ici démontre une réduction significative de la production de violacéine par les composés testés. Cette étude met en évidence le potentiel d’utilisation de ce protocole pour sélectionner des candidats prometteurs dans la recherche sur l’inhibition du QS.

Introduction

Les bactéries peuvent communiquer par le biais d’un système connu sous le nom de QS, qui permet une modulation coordonnée de leur comportement en réponse aux changements de densité cellulaire. Ce processus implique la production, la sécrétion et la détection de petites molécules de signalisation extracellulaires, également appelées auto-inducteurs, qui permettent la communication à la fois entre différentes espèces et au sein d’une même espèce ^1,2.

Cette communication est capable de réguler des gènes et des fonctions tels que l....

Protocole

1. Préparation de la culture (figure 2)

1. Cultiver en éprouvette une culture de 5 mL de C. violaceum ATCC 12472 dans un bouillon Luria Bertani (LB : tryptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L, 5 g/L de NaCl) à 30 °C dans un incubateur à agiter (220 tr/min) pendant 24 h.
2. Ajuster la culture à une DO₅₉₅ de 0,1 dans le bouillon LB, ce qui correspond à environ 1 x 10⁸ UFC/mL.

2. Préparation du composé

1. Dans une plaque à fond plat à 96 puits, ajoutez le bouillon LB et....

Résultats

Pour les résultats présentés ici, trois composés bioactifs précédemment étudiés par notre groupe^{de recherche 8}, le resvératrol, le farnésol et le linalol, ont été utilisés. Chaque composé a été testé pour sa capacité à inhiber la production de violacéine chez C. violaceum ATCC 12472, un phénotype régulé par le système QS sur l’opéron²³ vioABCDE.

Les résultats valident l’efficacité de notre protocole dans la quantification de la .......

Discussion

La première méthode d’extraction et de caractérisation de la violacéine de C. violaceum est apparue dans les années 1990, en se concentrant sur l’identification de sources de carbone appropriées pour la synthèse des pigments. Dans ce processus, la violacéine - ainsi que les cellules et le milieu de culture - a été séchée, remise en suspension dans de l’éthanol, puis séparée par extraction surnageante. La violacéine, maintenant dissoute dans l’éthanol, a ensuite été séchée à nouv.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMSO  ;	Synthé
Farnesol	Sigma-Aldrich	F203	95%
Linalol	Sigma-Aldrich	N° L2602	97%
Luria-Bertani Medium	Difco	244620
Film adhésif optique	Thermo Fisher	4311971	MicroAmp
Resvératrol	Sigma-Aldrich	R5010	&ge ; 99 % (HPLC)
Lecteur multimode Synergy HTX	Biotek
Plaques de culture tissulaire 96 puits	Kasvi	Référence K12-096