Atténuation de la ferroptose neuronale par inhibition de RKIP suite à une hémorragie intracérébrale spontanée via l’activation de la voie NRF2/HO-1

L’hémorragie intracérébrale spontanée (ICH) est une affection cérébrovasculaire caractérisée par des saignements dus à des lésions vasculaires intracrâniennes, une nécrose et une rupture de vaisseau, affectant généralement les ganglions de la base et représentant un sous-type majeur d’accident vasculaire cérébral hémorragique¹. Le taux de mortalité chez les patients diagnostiqués avec l’ICH est d’environ 50 %, et une proportion importante de survivants connaissent une perte d’indépendance sévère². Les options de traitement actuelles de l’ICH spontanée sont limitées, et aucun traitement existant n’a montré de réduction significative de la mortalité ou d’amélioration significative des résultats neurologiques après l’ICH.

La ferroptose, une forme de mort cellulaire programmée dépendante du fer, est définie par la peroxydation lipidique, l’accumulation d’ions ferreux et l’épuisement du glutathion, ce qui la distingue des autres formes de mort cellulaire programmée en termes génétiques, morphologiques et biologiques³. De plus en plus de preuves mettent en évidence le rôle de la ferroptose neuronale dans la pathologie de l’ICH. La protéine inhibitrice de la kinase Raf (RKIP), également connue sous le nom de protéine de liaison à la phosphatidyléthanolamine 1 (PEBP1), est impliquée dans le développement neuronal et forme le complexe 15LOX/PEBP1 par sa liaison avec la 15-lipoxygénase (15LOX), un régulateur clé de la ferroptose⁴. Cependant, le rôle et les mécanismes spécifiques de RKIP dans la ferroptose liée à la progression de l’ICH spontanée restent inexplorés.

Cette étude a examiné les effets anti-ferroptose de l’inhibition de RKIP sur les neurones, démontrant que l’inhibition de l’expression de RKIP pourrait supprimer la ferroptose neuronale après ICH, potentiellement par l’activation de la voie NRF2/HO-1 du facteur nucléaire E2 lié au facteur E2. Ces résultats sont importants pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la pathogenèse de l’ICH.

Culture de cellules PC12
La lignée cellulaire PC12 a été multipliée dans un milieu de croissance du Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine, avec un entretien de routine dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % de CO₂ sous atmosphère humidifiée). Pour les procédures expérimentales, les cellules adhérentes ont été plaquées sur des récipients de culture et laissées proliférer jusqu’à obtenir des monocouches presque confluentes (couverture de surface d’environ 90 %). La dissociation cellulaire a été réalisée par un traitement enzymatique utilisant une solution de trypsine-EDTA à 0,25 %, suivi de trois cycles de sous-culture successifs pour assurer la stabilité de la population. Les cellules traitées ont ensuite été allouées à des applications expérimentales en aval et à des évaluations analytiques.

Tests de viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire a été évaluée afin d’évaluer la cytotoxicité de l’hémine et de la locostatine sur les cellules PC12, en suivant les instructions fournies par le fabricant du kit de test. Les cellules PC12 ont été uniformément ensemencées dans des plaques de 96 puits et cultivées avec de l’hémine ou de la locostatine pendant 24 h. Après le lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), les cellules ont été incubées dans un milieu RPMI-1640 contenant une solution saline de tétrazolium à 10 % pendant 90 min à 37 °C. Les valeurs de densité optique (DO) ont ensuite été mesurées à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Réaction en chaîne quantitative par polymérase par transcription inverse (RT-qPCR)
L’ARN total a été extrait des cellules PC12 à l’aide du réactif d’extraction d’ARN. Tout d’abord, l’échantillon a été homogénéisé dans le réactif d’extraction, assurant une lyse complète. Du chloroforme a été ajouté au mélange, secoué vigoureusement et centrifugé pour séparer les phases (12 000 × g, 15 min, 4 °C). La phase aqueuse contenant l’ARN a été collectée, et l’ARN a été précipité par ajout d’isopropanol (phase aqueuse : iPrOH = 1:1) et incubation à température ambiante. La centrifugation a été effectuée pour granuler l’ARN (12 000 × g, 10 min, 4 °C), 1 mL d’éthanol à 70 % a été ajouté pour éliminer les impuretés, et enfin, la pastille d’ARN a été dissoute dans de l’eau exempte de RNase pour être stockée à -80 °C. Des matrices d’ADN complémentaire (ADNc) ont été générées par transcription inverse avec le RT Master Mix. Les modèles résultants ont ensuite été dilués à un rapport de 1:5 et soumis à une PCR quantitative en temps réel sur un instrument de PCR en temps réel. Chaque échantillon a été amplifié en trois exemplaires, et la quantité relative de produit de PCR a été moyennée. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 1, la β-actine servant de gène d’entretien. La concentration relative d’ARNm a été déterminée à l’aide de la formule E = 2^−ΔΔCt, et la valeur du cycle à seuil critique (CT) a été enregistrée pour chaque réaction.

Essais d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires et d’hydroperoxyde lipidique (LPO)
Les niveaux de ROS et de LPO ont été mesurés par cytométrie en flux. Les cellules PC12 ont été traitées avec de l’hémine (80 μM), de la locostatine (5 μM) et du ML385 (5 μM) pendant 24 h et lavées 3 fois avec du PBS dans de la vaisselle. Les cellules ont ensuite été incubées à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 40 min en présence de diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA), une sonde ROS, et de BODIPY 581/591 C11, une sonde LPO. Après des lavages PBS pour éliminer les sondes en excès, l’intensité de la fluorescence a été mesurée par cytométrie en flux. Une stratégie de contrôle cohérente a été appliquée à tous les échantillons : d’abord, les cellules ont été contrôlées sur FSC-A par rapport à SSC-A pour exclure les débris, puis les cellules individuelles ont été sélectionnées par FSC-A par rapport à FSC-H. Des cellules non colorées et des cellules traitées avec de l’hémine seule ont été utilisées comme témoins négatifs et positifs pour établir la compensation de fluorescence et les portes. Les données ont été analysées à l’aide du logiciel lié.

Extraction de protéines et western blot
Extraction totale des protéines
Le surnageant des cellules PC12 traitées a été mis au rebut, suivi de trois lavages avec du PBS glacé. Les cellules ont été récoltées à l’aide de trypsine et centrifugées à 200 × g pendant 5 min. Après avoir éliminé le surnageant, la pastille cellulaire a été homogénéisée dans un tampon de lyse à froid contenant 10 % d’inhibiteur de protéase et 10 % d’inhibiteur de phosphatase. Après une incubation de 30 minutes sur glace, le lysat a été centrifugé à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Le surnageant clair a été mélangé avec un tampon de charge (4:1) et chauffé à 95 °C pendant 5 min pour dénaturer les protéines. Les échantillons de protéines ont été conservés à -80 °C en vue d’une utilisation ultérieure.

Analyse par transfert Western
Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE à l’aide d’un gel d’empilement et d’un gel de résolution, les échantillons étant chargés dans des puits. L’électrophorèse a été réalisée à 80 V pour le gel d’empilement et à 120 V pour le gel de résolution. Les protéines ont été transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (pré-activée dans du méthanol pendant 1 min) à l’aide d’un système de transfert à courant constant de 300 mA pendant 1 à 2 h. La membrane a été bloquée avec du lait écrémé à 5 % dans du TBST pendant 2 h à température ambiante pour éviter une liaison non spécifique. Après trois lavages avec du TBST (10 min chacun), la membrane a été incubée pendant la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires suivants dilués dans du TBST : anti-ACSL4 de lapin (1:1 000), anti-GPX4 de lapin (1:1 000), anti-HO-1 de lapin (1:2 000), anti-NRF2 de lapin (1:1 000), anti-RKIP de lapin (1:1 500) et anti-β-actine de souris (1:5 000). La membrane a été lavée pendant 3 x 10 min avec du TBST et incubée avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP pendant 2 h à température ambiante : IgG anti-souris de chèvre marquées HRP (1:1 000), IgG anti-lapin de chèvre marquées HRP (1:1 000). Après des lavages TBST supplémentaires pendant 3 x 5 minutes, les signaux protéiques ont été visualisés à l’aide d’un kit ECL Western Blot et quantifiés à l’aide du logiciel ImageJ.

Coloration par immunofluorescence
Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles pré-placées dans des plaques de culture et laissées adhérer. Après des traitements expérimentaux, le surnageant a été éliminé et les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 15 min à température ambiante, suivies de trois lavages PBS. Par la suite, les cellules ont été perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante et lavées 3 fois avec du PBS. La liaison non spécifique a été bloquée par l’incubation avec 3 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 30 min à température ambiante. Les anticorps primaires ont été appliqués pendant la nuit à 4 °C : anti-HO-1 chez le lapin (1:500), anti-NRF2 chez le lapin (1:500). Après trois lavages PBS le lendemain, les cellules ont été incubées avec des anticorps secondaires fluorescents dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante : Alexa Fluor 488-marked Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). Après les lavages finaux, les échantillons ont été montés avec un milieu de montage contenant du 4',6-diamidino-2'-phénylindole (DAPI) pour la contre-coloration nucléaire. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.

Analyse statistique
Les données de mesure ont été exprimées en moyenne ± en écart-type (écart-type). Des données quantitatives représentant les résultats de trois tests répétés indépendants ont été prélevées pour analyse. Pour les comparaisons entre deux groupes, un test t a été appliqué, tandis qu’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été utilisée pour les comparaisons entre plusieurs groupes, suivie du test post hoc de Tukey pour les comparaisons multiples. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

L’hémine peut induire des dommages à la membrane plasmique, c’est pourquoi elle est fréquemment utilisée pour la construction de modèles cellulaires in vitro de l’ICH. Cette étude a examiné les effets du traitement à l’hémine à des concentrations et des durées variables sur la viabilité des cellules PC12, tout en analysant simultanément la dynamique d’expression de la protéine RKIP dans les conditions expérimentales correspondantes par l’analyse par transfert Western (Figure 1A). La viabilité cellulaire a été considérablement réduite à des concentrations d’hémine de 60 μM ou plus (figure 1B), et cette réduction s’est produite de manière dose-dépendante avec des concentrations croissantes. De plus, la cytotoxicité de l’hémine dépendait du temps, atteignant un pic dans les 24 premières heures suivant l’exposition avant de diminuer progressivement (figure 1C). L’analyse par transfert Western a indiqué que l’expression de la protéine RKIP était significativement élevée à 80 μM d’hémine (figures 1D,E) et atteignait son apogée 24 heures après la stimulation (figures 1F,G). Sur la base de ces résultats, nous avons choisi une dose d’hémine de 80 μM et une période de traitement de 24 heures pour les expériences ultérieures afin d’élucider les mécanismes sous-jacents et les voies de signalisation impliquées.

Pour étudier le rôle de RKIP dans la ferroptose neuronale après ICH, nous avons utilisé la locostatine pour inhiber l’expression de RKIP (Figure 2A). La locostatine se lie à RKIP, perturbe les interactions entre RKIP et la kinase Raf-1 et GRK2, atténuant ainsi les effets fonctionnels de RKIP pour atteindre l’objectif inhibiteur. Dans cette étude, nous avons utilisé la locostatine comme inhibiteur de RKIP pour étudier les mécanismes moléculaires associés 5,6. La cytotoxicité de la locostatine a d’abord été évaluée dans une plage de concentration de 0 à 40 μM à l’aide du test de viabilité. Les résultats n’ont montré aucune cytotoxicité significative à ≤5 μM, ce qui permet d’établir une plage de concentration sûre pour les expériences ultérieures (figure 2B). Nous avons également confirmé l’effet inhibiteur de la locostatine 5 μM sur l’expression de RKIP à l’aide d’analyses par western blot et RT-qPCR. Le Western blot a révélé une diminution significative des taux de protéine RKIP (figures 2C, D), tandis que la RT-qPCR a montré une diminution des niveaux d’ARNm RKIP (figure 2E). Ces résultats démontrent l’efficacité de la locostatine 5 μM dans l’inhibition de l’expression de RKIP.

Dans cette étude, un modèle de cellule PC12 de l’hémorragie intracérébrale (ICH) induite par l’hémine a été développé pour délimiter la fonction régulatrice de RKIP dans la ferroptose. Nos résultats ont indiqué que la stimulation de l’hémine augmentait significativement l’expression de RKIP tout en diminuant la viabilité cellulaire. Sur la base d’études existantes, nous avons émis l’hypothèse que la mort cellulaire induite par l’hémine pourrait être étroitement liée à la ferroptose, un processus de peroxydation lipidique catalysé par le fer et marqué par un dépôt pathologique de fer dans les compartiments cellulaires et des niveaux élevés d’espèces réactives de l’oxygène (ROS).

Pour explorer davantage la relation entre RKIP et la ferroptose, nous avons traité des cellules PC12 stimulées par l’hémine avec de la locostatine. L’analyse par transfert Western a révélé que l’expression de l’acyl-CoA synthétase à longue chaîne de la famille 4 (ACSL4), un facteur clé de la ferroptose, était significativement augmentée dans le groupe traité à l’hémine (figures 3A, B). ACSL4 est un gène pro-mort critique dans la ferroptose, favorisant l’estérification des acides gras polyinsaturés (AGPI) et augmentant ainsi la sensibilité cellulaire à la ferroptose. De plus, l’expression de la glutathion peroxydase 4 (GPX4), un inhibiteur de la ferroptose, a été significativement diminuée dans le groupe traité à l’hémine (Figure 3A, C). GPX4 est un régulateur clé de la ferroptose qui inhibe la peroxydation des lipides en piégeant les peroxydes lipidiques, protégeant ainsi les cellules des dommages oxydatifs. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’hémine augmente la ferroptose dans les cellules PC12. Cependant, par rapport au groupe de l’hémine, l’inhibition pharmacologique de RKIP avec la locostatine a inversé ces altérations, indiquant que la suppression de l’expression de RKIP inhibait la ferroptose dans les cellules PC12. Des résultats cohérents ont également été observés au niveau de l’ARNm (Figure 3 F,G).

Nous avons également étudié l’expression de molécules de voies liées à la ferroptose. Il a été démontré que la voie NRF2/HO-1 joue un rôle clé dans la ferroptose. Sur cette base, nous avons émis l’hypothèse que l’inhibition de RKIP pourrait supprimer la ferroptose neuronale en activant la voie NRF2/HO-1. Pour tester cette hypothèse, nous avons d’abord stimulé les cellules PC12 avec de l’hémine et constaté que l’expression de la protéine NRF2 était significativement augmentée (Figure 3A,D), ainsi qu’une augmentation significative de son produit en aval HO-1 (Figure 3A,E). Ces résultats suggèrent que la ferroptose induite par l’hémine active la voie NRF2/HO-1, qui exerce un effet protecteur sur les cellules. En tant que régulateur majeur des réponses antioxydantes cellulaires, NRF2 améliore la capacité antioxydante cellulaire en régulant l’expression de gènes cibles en aval tels que HO-1, inhibant ainsi la ferroptose. Par la suite, le traitement à la locostatine a encore augmenté l’expression de HO-1 et NRF2 par rapport au groupe traité à l’hémine (Figure 3A,D). Des résultats cohérents ont également été observés au niveau de l’ARNm (Figure 3I,J), confirmant que l’inhibition de RKIP supprime la ferroptose dans les cellules PC12 stimulées par l’hémine en modulant NRF2 et sa molécule en aval HO-1.

Notamment, un autre inhibiteur de la ferroptose, la ferritine lourde 1 (FTH1), a montré une expression accrue lors de la stimulation de l’hémine, et son expression était encore plus élevée lorsque RKIP était inhibé (Figure 3H). FTH1 est un composant majeur de la ferritine, responsable du stockage et de l’oxydation du fer. Il convertit les ions fer en une forme plus stable, réduisant ainsi le stress oxydatif induit par le fer libre. La régulation à la hausse de FTH1 lors de la stimulation de l’hémine peut représenter une réponse compensatoire à la surcharge en fer, car les cellules tentent de stocker l’excès de fer pour éviter les dommages oxydatifs. L’augmentation supplémentaire de l’expression de FTH1 lors du traitement à la locostatine suggère une réduction des niveaux de fer libre et une capacité antioxydante accrue, renforçant la conclusion selon laquelle l’inhibition de RKIP supprime la ferroptose induite par l’hémine dans les cellules PC12.

Les niveaux de ROS et d’hydroperoxyde lipidique (LPO) dans les cellules PC12 ont été évalués par cytométrie en flux. Le traitement à l’hémine a entraîné une augmentation significative des taux de ROS et de LPO, qui a été inversée après l’administration de Locostatin. Cette découverte indique que l’inhibition de RKIP peut aider à supprimer la ferroptose dans les neurones (Figure 4A-D).

En résumé, la dose induite par l’héminine et les réductions dépendantes du temps de la viabilité des cellules PC12 ont été concomitantes à une augmentation marquée des niveaux de protéines RKIP . Ce processus a été associé à des niveaux élevés d’ACSL4 et à une suppression de l’expression de GPX4. Parallèlement, une accumulation significative de marqueurs de dommages oxydatifs (ROS et LPO) a été observée, les deux servant de moteurs principaux de la ferroptose en médiant le stress oxydatif et la perturbation de la membrane lipidique. De plus, la régulation à la hausse de la protéine de stockage du fer FTH1 a suggéré une réponse cellulaire compensatoire à la surcharge en fer. De manière critique, l’inhibition pharmacologique de RKIP par la locostatine a inversé ces altérations et abrogé la ferroptose induite par l’hémine (Figure 1, Figure 2, Figure 3 et Figure 4).

Les résultats des tests ont indiqué que l’inhibition de RKIP supprimait efficacement la ferroptose neuronale et régulait l’expression de NRF2/HO-1 . Étant donné que la voie NRF2/HO-1 joue un rôle clé dans la ferroptose, on a émis l’hypothèse que la suppression de la ferroptose neuronale observée avec l’inhibition de RKIP pourrait être médiée par la stimulation de cette voie. Pour tester cette hypothèse, d’autres expériences ont été menées (Figure 5A).

ML385, un inhibiteur sélectif de NRF2, a été utilisé, et les résultats ont confirmé que l’expression de NRF2 était effectivement réduite à la fois aux niveaux de protéines (Figure 5B, C) et d’ARNm (Figure 5E). De plus, l’expression de HO-1, une molécule en aval de NRF2, a été évaluée. Les résultats ont indiqué que si l’inhibition de RKIP augmentait initialement l’expression de HO-1, cet effet était inversé après l’inhibition de NRF2 (Figure 5B, D, F). Ces résultats suggèrent que l’inhibition de RKIP peut atténuer la ferroptose neuronale en activant la voie NRF2/HO-1. La coloration par immunofluorescence a également confirmé ces résultats, car une translocation nucléaire de NRF2 a été observée après l’inhibition de RKIP (Figure 5G-J).

Par la suite, nous avons évalué les niveaux de ROS et de LPO dans les cellules PC12 à l’aide de la cytométrie en flux. Nous avons constaté que l’inhibition de NRF2 avec ML385 inversait la réduction des niveaux de ROS et de LPO induite par la locostatine. Ces résultats suggèrent que la suppression de RKIP peut inhiber la ferroptose neuronale en activant la voie NRF2/HO-1 (Figure 6A-D).

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Les ensembles de données générés au cours de la présente étude sont inclus dans le fichier supplémentaire 1.

Figure 1 : Construction d’un modèle de maladie in vitro par des cellules PC12 stimulées par l’hémine. (A) Illustration schématique de la construction du modèle de cellule PC12 stimulée par l’hémine. (B) Détermination de la concentration optimale d’hémine pour l’établissement d’un modèle d’hémorragie intracérébrale in vitro à l’aide de l’essai de viabilité cellulaire pour évaluer la viabilité cellulaire. (C) Essai de viabilité cellulaire avec des cellules PC12 traitées à l’hémine (80 μM) à différents points temporels. (D, E) Analyse représentative par western blot et évaluation quantitative des niveaux d’expression de RKIP dans les cellules PC12 traitées avec différentes concentrations d’hémine (24 h). (F,G) Analyse représentative par transfert de Western et évaluation quantitative des niveaux d’expression de RKIP dans les cellules PC12 exposées à l’hémine (80 μM) pendant des durées variables. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abréviations : CCK8 = Cell Counting Kit-8 ; WB = western blot ; RKIP = Protéine inhibitrice de la kinase Raf. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Effet de la locostatine sur l’expression de RKIP dans les cellules PC12 stimulées par l’hémine. (A) Illustration schématique de la procédure expérimentale de traitement à la locostatine dans les cellules PC12. (B) La viabilité cellulaire des cellules PC12 traitées avec différentes concentrations de locostatine a été évaluée à l’aide du test de viabilité cellulaire. (C, D) L’expression de RKIP dans les cellules PC12 traitées avec de l’hémine (80 μM,24 h) et/ou de la locostatine (5 μM,24 h) a été analysée par western blot, avec des transferts représentatifs et une analyse statistique. (E) L’expression de l’ARNm RKIP dans les cellules PC12 traitées avec de l’hémine (80 μM,24 h) et/ou de la locostatine (5 μM,24 h) a été mesurée par RT-qPCR. Toutes les données sont présentées en moyenne ± ET (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abréviations : CCK8 = Cell Counting Kit-8 ; WB = western blot ; RT-qPCR = Réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative ; ROS = Espèces réactives de l’oxygène ; LPO = peroxydation lipidique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Effet de l’inhibition de RKIP sur la ferroptose dans les cellules PC12 après stimulation de l’hémine. (A-E) Analyse par transfert Western des changements d’expression protéique dans ACSL4, GPX4, NRF2 et HO-1 dans les cellules PC12 traitées avec de l’hémine (80 μM, 24 h) et/ou de la locostatine (5 μM, 24 h). (F-J) Analyse par RT-qPCR des niveaux d’expression de l’ARNm d’ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 et FTH1 dans des cellules PC12 traitées avec de l’hémine (80 μM,24 h) et/ou de la locostatine (5 μM,24 h). Toutes les données sont présentées en moyenne ± ET (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abréviations : WB = western blot ; RT-qPCR = Réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative ; RKIP = protéine inhibitrice de la kinase Raf ; ACSL4 = Acyl-CoA synthétase à chaîne longue famille 4 ; GPX4 = Glutathion peroxydase 4 ; NRF2 = facteur 2 lié au facteur nucléaire E2 ; HO-1 = hème oxygénase-1 ; FTH1 = Chaîne lourde de ferritine 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Effet de l’inhibition de RKIP sur le stress oxydatif dans les cellules PC12 après stimulation de l’hémine. (A,C) Analyse par cytométrie en flux de la production d’espèces réactives de l’oxygène dans les cellules PC12 traitées avec de l’hémine (80 μM,24 h) et/ou de la locostatine (5 μM, 24 h). (B,D) Analyse par cytométrie en flux de la peroxydation lipidique dans les cellules PC12 traitées à l’hémine (80 μM,24 h) et/ou à la locostatine (5 μM,24 h). Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abréviations : ROS = Espèces réactives de l’oxygène ; LPO = peroxydation lipidique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Le rôle de NRF2 dans les effets anti-ferroptotiques médiés par l’inhibition de RKIP. (A) Illustration schématique de la procédure expérimentale de traitement des cellules PC12 dans différentes conditions. (B-D) Analyse par transfert Western des changements d’expression protéique dans NRF2 et HO-1 dans différentes conditions de traitement dans des cellules PC12 avec de l’hémine (80 μM, 24 h) et/ou de la locostatine (5 μM, 24 h) et/ou ML385 (5 μM, 24 h). (E, F) Analyse par RT-qPCR des niveaux d’expression de l’ARNm de NRF2 et HO-1 dans les cellules PC12 traitées à l’hémine (80 μM, 24 h) et/ou à la locostatine (5 μM, 24 h) et/ou ML385 (5 μM, 24 h). (G-J) Analyse par immunofluorescence de l’expression de NRF2 et HO-1 et quantification de l’intensité moyenne de fluorescence dans les cellules PC12 traitées avec de l’hémine (80 μM, 24 h) et/ou de la locostatine (5 μM, 24 h) et/ou ML385 (5 μM, 24 h). Barres d’échelle = 50 μm. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abréviations : WB = western blot ; RT-qPCR = Réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative ; Coloration IF = Coloration par immunofluorescence ; NRF2 = facteur 2 lié au facteur nucléaire E2 ; HO-1 = Hème oxygénase-1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Le rôle de NRF2 dans la suppression du stress oxydatif médié par l’inhibition de RKIP. (A,C) Analyse par cytométrie en flux de la production d’espèces réactives de l’oxygène dans les cellules PC12 avec de l’hémine (80 μM, 24 h) et/ou de la locostatine (5 μM, 24 h) et/ou ML385 (5 μM, 24 h). (B,D) Analyse par cytométrie en flux de la peroxydation lipidique dans les cellules PC12 traitées à l’hémine (80 μM, 24 h) et/ou à la locostatine (5 μM, 24 h) et/ou ML385 (5 μM, 24 h). Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abréviations : ROS = Espèces réactives de l’oxygène ; LPO = peroxydation lipidique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Représentation schématique de l’inhibition de RKIP atténuant la ferroptose neuronale suite à une ICH spontanée en activant la voie NRF2/HO-1. Nos résultats démontrent que l’inhibition de RKIP favorise efficacement la translocation nucléaire de NRF2, supprime l’accumulation de ROS lipidiques et, par conséquent, protège contre la ferroptose induite par l’hémine et le stress oxydatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Amorces pour la transcription inverse quantitative-PCR.

Fichier supplémentaire 1 : Données quantitatives brutes et traitées à l’appui des six premiers chiffres, y compris les dosages CCK-8, le Western blot, la RT-qPCR et les analyses de cytométrie en flux. Les données sont organisées par sous-panneaux de figure et comprennent toutes les valeurs répétées utilisées pour les analyses statistiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.