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Article de recherche

Atténuation de la ferroptose neuronale par inhibition de RKIP suite à une hémorragie intracérébrale spontanée via l’activation de la voie NRF2/HO-1

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DOI :

10.3791/68511

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31 octobre 2025

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1Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital 2 of Nantong University

Dans cet article

Résumé

En menant des études basées sur des organismes et des cultures cellulaires, il a été démontré que l’inhibition de la protéine inhibitrice de la kinase Raf (RKIP) peut atténuer la ferroptose neuronale après une hémorragie intracérébrale spontanée, réduisant ainsi les lésions cérébrales. La cytoprotection observée résulte de la modulation de l’axe de signalisation NRF2/HO-1 .

Résumé

La protéine inhibitrice de la kinase Raf (RKIP), un membre principal de la famille des protéines de liaison à la phosphatidyléthanolamine, est reconnue pour son implication dans divers processus physiologiques, notamment la différenciation cellulaire, la migration, le cycle cellulaire et l’apoptose. Cette étude a exploré sa fonction dans la ferroptose neuronale suite à une hémorragie intracérébrale spontanée (ICH) et les mécanismes associés. Un modèle cellulaire d’ICH spontanée a été développé à l’aide de cellules de phéochromocytome de rat (PC12) cultivées stimulées par de l’hémine. La viabilité cellulaire, l’expression de l’ARN, les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et l’hydroperoxyde lipidique (LPO) ont été évalués. De plus, les niveaux d’expression des protéines ont été mesurés. Cette étude a confirmé que l’inhibition de RKIP est neuroprotectrice in vitro après ICH. Cet effet a été associé à une augmentation de l’expression de la glutathion peroxydase 4 (GPX4) et à une diminution de l’expression de l’acyl-CoA synthétase de la famille 4 à longue chaîne (ACSL4), ainsi qu’à des niveaux de ROS et de LPO dans les neurones. L’inhibition de RKIP a démontré un rôle protecteur contre la ferroptose neuronale in vitro après ICH, potentiellement via l’activation de la voie NRF2/HO-1 (facteur 2/hème oxygénase-1) liée au facteur nucléaire E2. Ce mécanisme pourrait offrir des informations sur les stratégies thérapeutiques ciblant la ferroptose neuronale dans l’ICH.

Introduction

L’hémorragie intracérébrale spontanée (ICH) est une affection cérébrovasculaire caractérisée par des saignements dus à des lésions vasculaires intracrâniennes, une nécrose et une rupture de vaisseau, affectant généralement les ganglions de la base et représentant un sous-type majeur d’accident vasculaire cérébral hémorragique1. Le taux de mortalité chez les patients diagnostiqués avec l’ICH est d’environ 50 %, et une proportion importante de survivants connaissent une perte d’indépendance sévère2. Les options de traitement actuelles de l’ICH spontanée sont limitées, et aucun traitement existant n’a montré de réduction significative de la mortalité ou d’amélioration significative des résultats neurologiques après l’ICH.

La ferroptose, une forme de mort cellulaire programmée dépendante du fer, est définie par la peroxydation lipidique, l’accumulation d’ions ferreux et l’épuisement du glutathion, ce qui la distingue des autres formes de mort cellulaire programmée en termes génétiques, morphologiques et biologiques3. De plus en plus de preuves mettent en évidence le rôle de la ferroptose neuronale dans la pathologie de l’ICH. La protéine inhibitrice de la kinase Raf (RKIP), également connue sous le nom de protéine de liaison à la phosphatidyléthanolamine 1 (PEBP1), est impliquée dans le développement neuronal et forme le complexe 15LOX/PEBP1 par sa liaison avec la 15-lipoxygénase (15LOX), un régulateur clé de la ferroptose4. Cependant, le rôle et les mécanismes spécifiques de RKIP dans la ferroptose liée à la progression de l’ICH spontanée restent inexplorés.

Cette étude a examiné les effets anti-ferroptose de l’inhibition de RKIP sur les neurones, démontrant que l’inhibition de l’expression de RKIP pourrait supprimer la ferroptose neuronale après ICH, potentiellement par l’activation de la voie NRF2/HO-1 du facteur nucléaire E2 lié au facteur E2. Ces résultats sont importants pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la pathogenèse de l’ICH.

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Protocole

Culture de cellules PC12
La lignée cellulaire PC12 a été multipliée dans un milieu de croissance du Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine, avec un entretien de routine dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % de CO2 sous atmosphère humidifiée). Pour les procédures expérimentales, les cellules adhérentes ont été plaquées sur des récipients de culture et laissées proliférer jusqu’à obtenir des monocouches presque confluentes (couverture de surface d’environ 90 %). La dissociation cellulaire a été réalisée par un traitement enzymatique utilisant une solution de trypsine-EDTA à 0,25 %, suivi de trois cycles de sous-culture successifs pour assurer la stabilité de la population. Les cellules traitées ont ensuite été allouées à des applications expérimentales en aval et à des évaluations analytiques.

Tests de viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire a été évaluée afin d’évaluer la cytotoxicité de l’hémine et de la locostatine sur les cellules PC12, en suivant les instructions fournies par le fabricant du kit de test. Les cellules PC12 ont été uniformément ensemencées dans des plaques de 96 puits et cultivées avec de l’hémine ou de la locostatine pendant 24 h. Après le lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), les cellules ont été incubées dans un milieu RPMI-1640 contenant une solution saline de tétrazolium à 10 % pendant 90 min à 37 °C. Les valeurs de densité optique (DO) ont ensuite été mesurées à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Réaction en chaîne quantitative par polymérase par transcription inverse (RT-qPCR)
L’ARN total a été extrait des cellules PC12 à l’aide du réactif d’extraction d’ARN. Tout d’abord, l’échantillon a été homogénéisé dans le réactif d’extraction, assurant une lyse complète. Du chloroforme a été ajouté au mélange, secoué vigoureusement et centrifugé pour séparer les phases (12 000 × g, 15 min, 4 °C). La phase aqueuse contenant l’ARN a été collectée, et l’ARN a été précipité par ajout d’isopropanol (phase aqueuse : iPrOH = 1:1) et incubation à température ambiante. La centrifugation a été effectuée pour granuler l’ARN (12 000 × g, 10 min, 4 °C), 1 mL d’éthanol à 70 % a été ajouté pour éliminer les impuretés, et enfin, la pastille d’ARN a été dissoute dans de l’eau exempte de RNase pour être stockée à -80 °C. Des matrices d’ADN complémentaire (ADNc) ont été générées par transcription inverse avec le RT Master Mix. Les modèles résultants ont ensuite été dilués à un rapport de 1:5 et soumis à une PCR quantitative en temps réel sur un instrument de PCR en temps réel. Chaque échantillon a été amplifié en trois exemplaires, et la quantité relative de produit de PCR a été moyennée. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 1, la β-actine servant de gène d’entretien. La concentration relative d’ARNm a été déterminée à l’aide de la formule E = 2−ΔΔCt, et la valeur du cycle à seuil critique (CT) a été enregistrée pour chaque réaction.

Essais d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires et d’hydroperoxyde lipidique (LPO)
Les niveaux de ROS et de LPO ont été mesurés par cytométrie en flux. Les cellules PC12 ont été traitées avec de l’hémine (80 μM), de la locostatine (5 μM) et du ML385 (5 μM) pendant 24 h et lavées 3 fois avec du PBS dans de la vaisselle. Les cellules ont ensuite été incubées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 40 min en présence de diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA), une sonde ROS, et de BODIPY 581/591 C11, une sonde LPO. Après des lavages PBS pour éliminer les sondes en excès, l’intensité de la fluorescence a été mesurée par cytométrie en flux. Une stratégie de contrôle cohérente a été appliquée à tous les échantillons : d’abord, les cellules ont été contrôlées sur FSC-A par rapport à SSC-A pour exclure les débris, puis les cellules individuelles ont été sélectionnées par FSC-A par rapport à FSC-H. Des cellules non colorées et des cellules traitées avec de l’hémine seule ont été utilisées comme témoins négatifs et positifs pour établir la compensation de fluorescence et les portes. Les données ont été analysées à l’aide du logiciel lié.

Extraction de protéines et western blot
Extraction totale des protéines
Le surnageant des cellules PC12 traitées a été mis au rebut, suivi de trois lavages avec du PBS glacé. Les cellules ont été récoltées à l’aide de trypsine et centrifugées à 200 × g pendant 5 min. Après avoir éliminé le surnageant, la pastille cellulaire a été homogénéisée dans un tampon de lyse à froid contenant 10 % d’inhibiteur de protéase et 10 % d’inhibiteur de phosphatase. Après une incubation de 30 minutes sur glace, le lysat a été centrifugé à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Le surnageant clair a été mélangé avec un tampon de charge (4:1) et chauffé à 95 °C pendant 5 min pour dénaturer les protéines. Les échantillons de protéines ont été conservés à -80 °C en vue d’une utilisation ultérieure.

Analyse par transfert Western
Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE à l’aide d’un gel d’empilement et d’un gel de résolution, les échantillons étant chargés dans des puits. L’électrophorèse a été réalisée à 80 V pour le gel d’empilement et à 120 V pour le gel de résolution. Les protéines ont été transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (pré-activée dans du méthanol pendant 1 min) à l’aide d’un système de transfert à courant constant de 300 mA pendant 1 à 2 h. La membrane a été bloquée avec du lait écrémé à 5 % dans du TBST pendant 2 h à température ambiante pour éviter une liaison non spécifique. Après trois lavages avec du TBST (10 min chacun), la membrane a été incubée pendant la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires suivants dilués dans du TBST : anti-ACSL4 de lapin (1:1 000), anti-GPX4 de lapin (1:1 000), anti-HO-1 de lapin (1:2 000), anti-NRF2 de lapin (1:1 000), anti-RKIP de lapin (1:1 500) et anti-β-actine de souris (1:5 000). La membrane a été lavée pendant 3 x 10 min avec du TBST et incubée avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP pendant 2 h à température ambiante : IgG anti-souris de chèvre marquées HRP (1:1 000), IgG anti-lapin de chèvre marquées HRP (1:1 000). Après des lavages TBST supplémentaires pendant 3 x 5 minutes, les signaux protéiques ont été visualisés à l’aide d’un kit ECL Western Blot et quantifiés à l’aide du logiciel ImageJ.

Coloration par immunofluorescence
Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles pré-placées dans des plaques de culture et laissées adhérer. Après des traitements expérimentaux, le surnageant a été éliminé et les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 15 min à température ambiante, suivies de trois lavages PBS. Par la suite, les cellules ont été perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante et lavées 3 fois avec du PBS. La liaison non spécifique a été bloquée par l’incubation avec 3 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 30 min à température ambiante. Les anticorps primaires ont été appliqués pendant la nuit à 4 °C : anti-HO-1 chez le lapin (1:500), anti-NRF2 chez le lapin (1:500). Après trois lavages PBS le lendemain, les cellules ont été incubées avec des anticorps secondaires fluorescents dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante : Alexa Fluor 488-marked Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). Après les lavages finaux, les échantillons ont été montés avec un milieu de montage contenant du 4',6-diamidino-2'-phénylindole (DAPI) pour la contre-coloration nucléaire. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.

Analyse statistique
Les données de mesure ont été exprimées en moyenne ± en écart-type (écart-type). Des données quantitatives représentant les résultats de trois tests répétés indépendants ont été prélevées pour analyse. Pour les comparaisons entre deux groupes, un test t a été appliqué, tandis qu’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été utilisée pour les comparaisons entre plusieurs groupes, suivie du test post hoc de Tukey pour les comparaisons multiples. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

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Résultats

L’hémine peut induire des dommages à la membrane plasmique, c’est pourquoi elle est fréquemment utilisée pour la construction de modèles cellulaires in vitro de l’ICH. Cette étude a examiné les effets du traitement à l’hémine à des concentrations et des durées variables sur la viabilité des cellules PC12, tout en analysant simultanément la dynamique d’expression de la protéine RKIP dans les conditions expérimentales correspondantes par l’analyse par transfert Western (Figure 1A). La...

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Discussion

Cette étude a examiné les effets et les mécanismes sous-jacents de l’inactivation de RKIP sur la ferroptose induite par l’ICH dans un cadre in vitro . La stimulation des cellules avec de l’hémine déclenche un stress oxydatif, accompagné d’une génération excessive de ROS et de LPO, favorisant ainsi la ferroptose. L’inhibition de l’expression endogène de RKIP accélère la translocation de NRF2 libérée dans le noyau et sa liaison à l’élément de réponse ant...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.

Remerciements

Cette étude a été financée par des subventions du projet de la Commission municipale de la santé de Nantong (MS2022015) et du projet du Bureau des sciences et de la technologie de Nantong (JCZ2023022).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IgG anti-lapin marqué Alexa Fluor 488Beyotime BiotechA0423
Anticorps anti-ACSL4Signalisation cellulaire38493T
Anticorps anti-GPX4Signalisation cellulaire59735S
Anticorps anti-HO-1MedChemExpressHY-P80499
Anticorps anti-NRF2Signalisation cellulaire12721T
Anticorps anti-RKIPAbcamab76582
Anticorps anti-&bêta-actineAbcamab179467
BeyoECL PlusBeyotime BiotechP0018M
BSANCM BiotechWB6504-100g
Kit de comptage cellulaire-8Beyotime BiotechC0037
SAUVETAGE DE CELLULESNCM BiotechC40050
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
DMSOBeyotime BiotechST038
Sérum fœtal bovinGibcoA5670801
GraphPad Prism
HeminMedChemExpressHY-19424
HiScript Q RT SuperMix pour qPCR (+essuie-glace gDNA)VazymeR123-01
IgG anti-souris marqué HRPThermoC31430100
IgG anti-lapin marqué par HRPThermoC31460100
Kit de test de contenu en peroxyde lipidique (LPO)SolarbioBC5245
LocostatineMedChemExpressHY-W013411A
ML385MedChemExpressHY-100523
Montage moyen ? anti-décoloration (avec DAPI)SolarbioS2110
Lait en poudre SANS GRASSolarbioD8340
PBS (poudre ? pH7.2-7.4)SolarbioP1010
PC-12AdhBiotechnologie BioChannel de NankinBC-C-RA-005
Liquide de pénicilline-streptomycineSolarbioP1400
PRMI-1640GibcoA1049101
Cocktail inhibiteur de protéase et de phosphatase pour usage général, 50xBeyotime BiotechP1045
Marqueur protéiqueThermo26617
PVDF  ;MilliporeRIKB43638
Kit de test des espèces réactives d’oxygèneSolarbioCA1410
Tampon RIPA (élevé)SolarbioR0010
Kit de préparation rapide en gel SDS-PAGEÉpizymePG110
Tampon de chargement d’échantillon SDS-PAGE, 5xBeyotime BiotechP0015
TritonX-100SolarbioIT9100
TrizolThermo15596018CN
Solution de trypsine-EDTA ? 0,25 % (sans rouge de phénol)SolarbioT1300

Références

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