Application du plan ascendant et descendant de Dixon pour estimer la concentration alvéolaire minimale de sévoflurane chez les rats avec une classification de mouvement affinée

Résumé

Le protocole présenté ici vise à évaluer la profondeur de l’anesthésie à l’aide de la conception Up-and-Down de Dixon chez des rats sous sédation soumis à un stimulus de douleur standardisé. De plus, il établit une classification des différents modèles de mouvement observés.

Résumé

Lors de l’utilisation d’agents anesthésiques volatils, la mesure standard de la puissance est la concentration alvéolaire minimale (CMA), définie comme la concentration alvéolaire à laquelle 50 % des sujets ne montrent pas de réponse motrice à un stimulus douloureux. Dans les études cliniques et expérimentales, le consensus actuel indique que seuls les « mouvements intentionnels grossiers » comptent comme une réponse motrice positive et peuvent donc indiquer une sédation trop légère. Cependant, le niveau d’anesthésie approprié, tant chez l’homme que chez l’animal, varie individuellement en fonction de divers facteurs d’influence, tels que d’autres médicaments administrés. Deux études animales chez le rat ont été menées pour examiner les effets du tétrahydrocannabinol et de l’éthanol sur le sévoflurane, l’un des anesthésiques volatils les plus couramment utilisés. Pour estimer le MAC, on a utilisé le modèle Up-and-Down de Dixon. Pour le premier animal, une dose prédéterminée de sévoflurane a été choisie. Après une période d’équilibre de 15 minutes, un stimulus de douleur standardisé a été appliqué sur le tiers distal de la queue du rat à l’aide d’une pince chirurgicale. La réponse de l’animal au stimulus a été documentée comme positive ou négative. Si une réaction motrice positive se produisait, la dose pour l’animal suivant était augmentée. À l’inverse, si le rat n’a pas présenté de réponse motrice, la dose pour l’animal suivant a été diminuée. La régression isotonique et la méthode bootstrap ont été utilisées pour estimer la CMA et les intervalles de confiance à 95 %. Cet article décrit un protocole détaillé pour évaluer la profondeur de l’anesthésique chez le rat à l’aide de la conception haut et bas. Il fournit également une description et une catégorisation nouvelles et détaillées des modèles de mouvement chez les rats sous sédation lorsqu’un stimulus douloureux standardisé est appliqué afin d’améliorer la reproductibilité pour les études futures.

Introduction

Le sévoflurane est l’un des anesthésiques volatils inhalés les plus fréquemment utilisés¹. Sa puissance est évaluée à l’aide de la concentration alvéolaire minimale (CMA), qui est définie comme la concentration alvéolaire à laquelle 50 % des patients ne présentent pas de réponse motrice à un stimulus douloureux ^2,3,4. Pour établir la CMA, les rats peuvent être utilisés comme modèles animaux en raison de leur plus grande homogénéité par rapport aux humains. Le stimulus de la douleur est généralement appliqué à l’aide d’une pince chirurgicale sur le tiers distal de la queue du rat². L’utilisation d’autres méthodes pour tester la douleur ne garantirait pas la comparabilité avec des études antérieures et pourrait donc générer des résultats divergents. En raison de la grande variété de mouvements en réponse au stimulus, le consensus actuel stipule que seuls les « mouvements intentionnels grossiers » doivent être considérés comme des réactions motrices positives³. Cependant, cette définition n’est pas précisée davantage en ce qui concerne les catégories spécifiques qui seraient qualifiées de « dérives grossières » et la mesure dans laquelle un mouvement devrait répondre à ce critère. Ceci est de la plus haute importance, car une réponse motrice à un stimulus peut indiquer, dans un cadre clinique, une profondeur de sédation insuffisante.

Divers facteurs influencent l’état anesthésique, notamment l’âge^{de 5} ans, les comorbidités⁶, l’altération de la fonction hépatique⁷ ou l’hypothermie⁸. De plus, les médicaments administrés avec les anesthésiques affectent considérablement la profondeur de l’anesthésie. Par exemple, le fentanyl et le propofol, souvent utilisés pendant la phase d’induction, réduisent la quantité requise de sévoflurane ^9,10. De plus, il a été démontré que la lidocaïne ou la prégabaline peuvent abaisser la CMA du sévoflurane^11,12. De plus, la consommation récente d’alcool ou de substances telles que le tétrahydrocannabinol (THC) peut également réduire la MAC, augmentant ainsi la profondeur de l’anesthésie^13,14. À l’inverse, il a été suggéré que les agents sympathomimétiques peuvent alléger la sédation en stimulant le système nerveux central¹⁵.

Afin d’améliorer la reproductibilité pour les études futures, un protocole détaillé et des descriptions vidéo pour l’évaluation de la CMA chez le rat à l’aide de la conception haut-bas¹⁶ de Dixon sont fournis. Contrairement aux études CMA précédentes, ce protocole décrit des étapes procédurales détaillées pour soutenir la reproductibilité entre les laboratoires. De plus, des séquences vidéo de deux études publiées précédemment ont été réanalysées, et les réponses motrices ont été classées en fonction de leur étendue et de leur modèle (mouvements coordonnés - roulement, étirement, saltatoire et mouvement non coordonné d’enroulement). Par conséquent, cette étude offre également une description et une classification innovantes et approfondies des schémas de mouvement chez les rats sous sédation en réponse à un stimulus douloureux standardisé, dans le but d’améliorer la reproductibilité pour les recherches futures.

Protocole

Toutes les études expérimentales sur les animaux ont été approuvées par le Comité intra-muros pour l’expérimentation animale de l’Université de médecine de Vienne et l’autorité de réglementation compétente (ministère fédéral autrichien de la Femme, de la Science et de la Recherche). Les expériences ont été menées sous anesthésie constamment maintenue. Les animaux ne perçoivent pas consciemment la douleur, même si un mouvement se produit¹⁷. Des rats Wistar adultes âgés de 81 à 95 jours ont été utilisés.

1. Étudiez les animaux et le logement

1. Hébergez les animaux en fonction de leur poids et de leur sexe. Séparez les mâles et les femelles et hébergez-les pendant au moins 14 jours avant de commencer l’expérience pour permettre l’acclimatation. Placez au maximum trois rats de plus de 400 g ou quatre rats de moins de 400 g par cage.
2. Maintenez les conditions environnementales avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures, une température ambiante de 22 °C et des niveaux d’humidité entre 45 % et 65 %.
3. Pesez régulièrement chaque animal et notez le poids corporel avant chaque procédure.
4. Transporter les animaux individuellement de la zone d’hébergement à l’installation d’essai. Couvrez chaque cage avec un chiffon pour réduire le stress visuel et logez les animaux non testés dans une pièce séparée pour éviter l’exposition à des procédures expérimentales.

2. Configuration de l’équipement

1. Vérifiez que tout l’équipement requis est fonctionnel et disponible avant de commencer l’expérience. Effectuer des vérifications de l’équipement conformément aux directives institutionnelles ou aux procédures d’exploitation normalisées, y compris les tests d’étanchéité, l’étalonnage et les tests de fonction d’alimentation, le cas contraire.
2. Utilisez une chambre étanche à l’air et transparente (15 cm × 20 cm × 9 cm) pour placer le rat. Assurez-vous que la chambre est équipée d’une ouverture de 15 mm pour guider la queue vers l’extérieur tout en minimisant les fuites de gaz.
3. Connectez la conduite d’entrée à un vaporisateur de sévoflurane et à une source d’oxygène.
4. Connectez la conduite d’écoulement du côté opposé de la chambre à un système d’extraction de gaz et à un moniteur d’anesthésie pour enregistrer les concentrations de sévoflurane.
5. Vérifiez que le thermomètre rectal, la couverture chauffante et la lampe chauffante infrarouge fonctionnent Testez le thermomètre par rapport à un appareil de référence, vérifiez que la couverture chauffante atteint les plages de température cibles et vérifiez que la lampe infrarouge s’allume et maintient une sortie stable. Placez la lampe directement au-dessus de la chambre d’essai à une distance de sécurité conformément aux procédures de sécurité locales.
6. Préparez une pince artérielle de 25 cm à utiliser pour le stimulus de douleur standardisé.

3. Préparation du médicament

1. Préparation au THC (facultatif)
   1. Utilisez une formulation de THC avec une concentration de 25 mg/mL. Calculer le volume requis pour chaque animal en multipliant le poids corporel en kilogrammes par (10 mg/kg/25 mg/mL), ce qui donne 0,4 mL par kg de poids corporel.
   2. À l’aide d’une pipette à déplacement positif, vous calculez le volume exact calculé pour chaque animal. Ne pas administrer à ce stade. Préparez la pipette et mettez-la de côté pour une administration ultérieure lors de l’étape d’administration du médicament (voir étape 4.6).
   3. Utilisez une pointe de pipette adaptée au gavage, telle qu’une pointe qui peut contenir en toute sécurité jusqu’à 0,3 ml de liquide. Effectuez le gavage oral directement à l’aide de la pipette chargée. Jetez l’embout de la pipette après chaque utilisation pour éviter la contamination croisée.
2. Préparation à l’éthanol (facultatif) :
   1. Préparez l’éthanol à la dose requise de 1 g/kg ou 2 g/kg. Utilisez une formulation hautement concentrée d’éthanol (p. ex., 96-100 %) comme base et dissolvez-la dans une solution saline à 0,9 % jusqu’à un volume total de 10 ml/kg de poids corporel pour chaque animal. Utilisez le même volume de solution saline seule que le placebo correspondant. Respectez toutes les directives de sécurité de l’établissement, en particulier celles relatives à la manipulation et à l’entreposage de substances inflammables.
   2. À l’aide d’une seringue adéquate (5 ml ou 10 ml, selon le poids de l’animal), prélevez le volume exact calculé pour chaque animal. N’administrez pas la substance à ce stade. Préparez la seringue et mettez-la de côté pour l’injection intrapéritonéale lors de l’étape d’administration du médicament (voir étape 4.6). Fixez une aiguille de 23 G pour l’administration et couvrez-la d’un capuchon correspondant pour éviter de vous blesser jusqu’à l’utilisation.

4. Application d’un médicament

1. Induisez l’anesthésie pour l’administration du médicament en plaçant le rat dans la chambre et en l’inondant de sévoflurane à 3,5 % en volume dans de l’oxygène à 100 % à 3 L/min.
2. Attendez environ 3 à 5 minutes jusqu’à ce que l’animal soit visuellement inconscient.
3. Effectuez le test du réflexe de redressement en inclinant doucement la chambre pour faire rouler l’animal sur le dos. S’il ne tente pas de se redresser dans les 10 s, supposez une profondeur d’anesthésie adéquate.
4. Réduire temporairement la concentration de sévoflurane à 0 et rincer la chambre avec de l’oxygène à 100 % pendant 15 s pour minimiser l’exposition au gaz anesthésique pour l’expérimentateur.
5. Retirez l’animal de la chambre et placez-le devant un tube d’administration de gaz délivrant la même concentration de sévoflurane pour maintenir l’anesthésie pendant l’administration. Sautez cette étape si l’administration de la substance d’essai est suffisamment brève pour éviter la récupération de l’anesthésie.
6. Administrer des substances selon le plan d’expérience : Administrer 10 mg/kg de THC par gavage gastrique ou administrer 1 g/kg ou 2 g/kg d’éthanol par voie intrapéritonéale. Reportez-vous à la section 3 pour les détails de préparation et suivez les directives de l’établissement pour effectuer les procédures d’administration par gavage et par voie intrapéritonéale.
7. Remettez l’animal dans sa cage pour qu’il se rétablisse.
8. Attendez 1 h pour l’éthanol et 2 h pour le THC avant de poursuivre la procédure.

5. Induction de l’anesthésie pour les tests MAC

1. Après la période d’attente, remettez le rat dans la chambre d’essai hermétique et inondez-le avec le mélange déterminé de sévoflurane et d’oxygène. Assurer un débit d’oxygène constant de 3 L/min. Déterminer la concentration individuelle de sévoflurane (étape 9.1) pour chaque animal, en commençant par 2,6 % en volume (ou un autre point de départ prédéterminé basé sur la planification statistique) pour le premier animal de chaque groupe. Une description détaillée de la conception Up-and-Down-Down est donnée ci-dessous.
2. Allumez la lampe chauffante infrarouge.
3. Attendez environ 3 à 5 minutes jusqu’à ce que l’animal soit visuellement inconscient.
4. Effectuez le test du réflexe de redressement en inclinant doucement la chambre pour faire rouler l’animal sur le dos. S’il ne tente pas de se redresser dans les 10 s, supposez une profondeur d’anesthésie adéquate.
5. Réduire temporairement la concentration de sévoflurane à 0 et rincer la chambre avec de l’oxygène à 100 % pendant 15 s pour minimiser l’exposition au gaz anesthésique pour l’expérimentateur.
6. Ouvrez rapidement la chambre et insérez le thermomètre rectal. Surveillez la température corporelle tout au long de la procédure et ajustez l’intensité de la lampe chauffante infrarouge et de la couverture chauffante en conséquence.
7. Faites sortir la queue par la petite ouverture dans la chambre.
8. Fermez rapidement la chambre.
9. Rétablissez immédiatement la concentration souhaitée de sévoflurane avant de continuer.

6. Temps d’équilibrage

1. Prévoyez une période de 15 min pour l’équilibre.
2. Surveillez en permanence la température centrale de l’animal (37,2 °C ± 0,3 °C) et ajustez les appareils de chauffage en conséquence pour maintenir la normothermie.

7. Stimulus de la douleur

1. Identifiez le tiers distal de la queue.
2. Appliquez le stimulus de douleur en verrouillant la pince dans sa troisième position (environ 50 N de force).
3. Laissez la pince verrouillée dans sa troisième position jusqu’à ce que le rat montre une réponse de mouvement positive, mais pendant un maximum de 1 min.
4. Consigner dans le protocole la présence ou l’absence d’une réaction motrice. Fournissez une brève description du mouvement observé en termes de modèle et d’étendue. Se référer au point 11 pour la classification des schémas de mouvement.

8. Récupération

1. Éteignez le vaporisateur et la lampe chauffante et remettez le rat dans la cage.

9. Conception vers le haut et vers le bas

1. Déterminez la concentration de sévoflurane pour l’expérience suivante à l’aide du plan haut et bas de Dixon. Si l’animal précédent a montré une réponse motrice au stimulus, augmentez la concentration de l’animal suivant de 0,2 % pt. À l’inverse, si l’animal précédent n’a montré aucune réponse motrice, diminuez la concentration de 0,2 % pt.

10. Euthanasie (le cas échéant)

REMARQUE : L’euthanasie n’est pas intrinsèquement une partie nécessaire des expériences. La commission intra-muros compétente pour l’expérimentation animale doit être consultée. Pour les deux études référencées, il a été décidé d’effectuer des prises de sang intracardiaques et d’euthanasier les animaux par la suite. Les animaux n’ont pas été renvoyés dans la cage comme décrit à l’étape 8.1, mais la procédure s’est poursuivie directement à l’étape 9.1.

1. Préparez la solution d’euthanasie en dissolvant 300 mg de pentobarbital dans 1 mL de solution saline. Aspirez la solution dans une seringue et gardez-la prête à être utilisée immédiatement après la prise de sang.
2. Sortez le rat de la boîte et placez-le devant un tube respiratoire délivrant 3,5 % vol. de sévoflurane dans 100 % d’oxygène pour maintenir une anesthésie constante. Positionnez l’animal sur le dos pour permettre un accès libre à la région thoracique.
3. Effectuez la prise de sang intracardiaque à l’aide d’une aiguille de 23 G et d’une seringue de 5 ml. Palpez doucement le rythme cardiaque avec un doigt pour localiser le cœur. Insérez l’aiguille juste caudale dans l’apophyse xiphoïde, légèrement à gauche de la ligne médiane et à un angle peu profond.
4. Aspirez doucement tout en ajustant la position de l’aiguille jusqu’à ce que le flux sanguin soit observé. Collectez le volume requis.
5. Une fois la prise de sang terminée, retirez soigneusement la seringue de l’aiguille et fixez la seringue préremplie contenant la solution de pentobarbital. Administrer la totalité de 1 mL de la solution par voie intracardique pour assurer l’euthanasie conformément aux directives éthiques de l’établissement.

11. Poursuivre les expériences

1. Répétez l’expérience à partir de l’étape 3 pour chaque animal d’étude individuellement.

12. Classification des schémas de mouvement (facultatif)

1. Classez les réponses comportementales dans les catégories suivantes :
   1. Roulement : Classer comme roulement lorsque la réponse comportementale implique une rotation axiale du corps, généralement le long de l’axe longitudinal.
   2. Étirement : Classer comme étirement lorsque la réponse comportementale est caractérisée par une extension bilatérale et symétrique vers l’extérieur des membres et du corps.
   3. Mouvement saltatoire : Classer comme mouvement saltatoire lorsque la réponse comportementale consiste en des coups de pied ou des secousses soudains, axés sur les membres postérieurs, ressemblant à de courtes rafales sautillantes de tout le corps.
   4. Curling : Classer comme curling lorsque la réponse comportementale implique un mouvement non coordonné, dirigé vers l’intérieur et d’intensité variable, provoquant la flexion du corps vers son centre.

Résultats

Dans l’étude sur le THC, l’estimation bootstrap de la CMA était de 2,8 % en volume dans le groupe témoin (IC à 95 % : 2,7-2,9 % en volume) et de 2,1 % en volume dans le groupe à 10 mg/kg de THC (IC à 95 % : 1,8 à 2,4 % en volume)¹³.

Dans l’étude sur l’éthanol, la CMA estimée était de 2,24 % en volume dans le groupe témoin (IC à 95 % : 1,97-2,94 % en volume). Dans le groupe contenant 1 g/kg d’éthanol, elle était de 1,65 % en volume (IC à 95 % : 1,40 à 1,98 % en volume) e...

Discussion

Cette étude affine le protocole de détermination de la CMA du sévoflurane chez le rat en détaillant les étapes méthodologiques critiques et en abordant les défis communs afin de contribuer à une approche plus normalisée et reproductible pour l’évaluation de la profondeur de l’anesthésique.

Une détermination précise de la CMA est essentielle pour les pratiques d’anesthésie expérimentales et cliniques. Ce travail contribue à la littérature existante en fournissa...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chambre transparente étanche à l’air	N/A	N/A	Générique
Pince artérielle	KLS Martin	13-410-22-07	25 cm
Drä ; ger Primus	Drä ; ger Austria GmbH	Primus
Drä ; ger Vapor 2000	Drä ; ger Austria GmbH	Vapor 2000
Unité de commande de couverture homéothermique	Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, États-Unis	50-7137	230 V
Réchauffeur mobile manuel pour bébé	Fisher/Paykle, Auckland, Nouvelle-Zélande	IW9210/920