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In vitro Reconstitution de réseaux cytosquelettiques à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes (GUV) en phase séparée

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DOI :

10.3791/68530

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20 juin 2025

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une reconstitution simple en un seul pot de réseaux cytosquelettiques à l’intérieur de vésicules géantes séparées en phase. La méthode peut être généralisée et appliquée à l’encapsulation ou au confinement d’une large gamme de biomolécules.

Résumé

Les membranes lipidiques biomimétiques sous la forme de vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont couramment utilisées pour imiter le comportement des membranes cellulaires en raison de la facilité de reconstitution des protéines à l’intérieur des GUV, de la visualisation, ainsi que de la compréhension de la dynamique membrane-protéine cellulaire. Cependant, les membranes cellulaires comprennent des radeaux lipidiques (ou domaines) résultant de la présence de différents lipides dans la membrane cellulaire. Une telle complexité accrue dans les systèmes modèles peut être incorporée pour aboutir à des GUV séparés en phase, où la composition lipidique peut être finement ajustée. Alors que les méthodes d’encapsulation pour la génération de GUV homogènes sont largement connues, les méthodes d’encapsulation de protéines dans des GUV séparées en phase sont limitées. Ici, ce protocole présente une production simplifiée en un seul pot de GUVs séparés en phase, composés de domaines désordonnés en liquide (Ld) et ordonnés en liquide (Lo), encapsulant efficacement différentes protéines du cytosquelette, c’est-à-dire FtsZ et l’actine, faisant de la méthode un outil polyvalent pour une production cellulaire minimale. Plus précisément, cette approche utilise un protocole de transfert d’émulsion pour produire des GUV avec une efficacité d’encapsulation élevée. Dans cette méthode, une monocouche lipidique est d’abord générée en émulsifiant une solution protéique dans un mélange lipide/huile, où des lipides de différentes températures de transition de phase sont choisis pour produire une séparation de phase dans les GUV résultants. Cette émulsion est transférée doucement sur une solution lipidique dans l’huile dans un autre tube, ce qui entraîne la formation d’une interface eau-huile. La solution est ensuite centrifugée à des températures élevées (idéalement à 37 °C pour conserver l’activité protéique), après quoi les GUV sont collectés pour l’imagerie. Cette méthode simplifie la reconstitution in vitro des protéines du cytosquelette dans des GUV séparées en phase sans utiliser une configuration de laboratoire encombrante, et constitue donc une méthode pratique pour étudier la mécanique des interactions cytosquelettique-membrane en confinement.

Introduction

Les vésicules géantes servent de systèmes modèles pour comprendre les fonctions cellulaires 1,2. Leur facilité de production, de visualisation, d’accordabilité et de reconstitution in vitro des biomolécules font de ces modèles biomimétiques le système de choix pour de nombreuses études de recherche 3,4,5. Il existe plusieurs méthodes connues pour fabriquer des GUV, telles que l’électroformation6, le cDICE 7,8, le transfert d’émulsion et d’autres méthodes microfluidiques 9,10. La production de GUV avec de telles méthodes est rapportée dans la littérature 3,11. De plus, in vitro, la reconstitution des réseaux cytosquelettiques à l’intérieur des GUVs a déjà été décrite à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion en raison de la facilité de cette méthode de formation en un seul pot, qui ne nécessite aucune configuration complexe12. Cependant, une telle reconstitution est très fréquemment rapportée dans les GUV homogènes, un système qui n’imite pas complètement la complexité des membranes cellulaires.

Ce protocole décrit la reconstitution in vitro de réseaux cytosquelettiques à l’intérieur de GUVs séparés en phase, présentant la complexité de la membrane lipidique. Bien qu’il ait déjà été rapporté que de tels réseaux se lient à la surface de la membrane (à l’extérieur) mais ne sont pas confinés à l’intérieur des vésicules géantes13,14, la technique actuelle de transfert d’émulsion se concentre sur le protocole permettant de produire la séparation de phase, ainsi que de conserver l’activité de la formation du réseau du cytosquelette. L’un des principaux défis de cette technique est la température. Les méthodes de production standard pour générer des GUV à séparation de phase nécessitent l’utilisation de températures élevées, qui varient en fonction de la température de transition de phase des lipides constitutifs. Cependant, les protéines du cytosquelette sont incapables de polymériser en structures d’ordre supérieur à des températures aussi élevées 15,16,17. Ainsi, ce protocole utilise non seulement une composition lipidique pour produire une séparation de phase dans les GUV à température ambiante, mais optimise également les conditions pour produire un bon rendement de GUV à des températures physiologiques.

Un autre aspect à prendre en compte lors de la production de systèmes GUV reconstitués est le volume des biomolécules encapsulées nécessaires. Pour la plupart des protéines, la production de volumes plus élevés peut être coûteuse et prendre du temps, impliquant plusieurs cycles de purification. De plus, les expériences de reconstitution in vitro nécessitent généralement une phase exploratoire initiale au cours de laquelle les concentrations de biomolécules, les compositions tampons, etc., sont d’abord testées pour obtenir un contenu optimisé en solution interne. Ainsi, ce protocole optimise le protocole de production GUV pour deux dosages différents, qui s’adaptent aux prémisses susmentionnées. D’une part, ce protocole décrit un test qui optimise le protocole standard d’émulsion inversée, qui implique des volumes relativement plus élevés de protéines et génère une production de GUV à haut rendement dans des tubes, qui sont ensuite transférés à l’imagerie de plaques à 96 puits. D’autre part, l’approche décrite ici optimise également le protocole de production de GUV à séparation de phase directement dans des plaques de puits d’imagerie, ce qui utilise des volumes plus faibles de biomolécules (~1/4 des quantités requises pour la production dans les tubes) et permet la génération de GUV en série, réalisant de nombreuses conditions encapsulées en une seule étape de centrifugation. Ainsi, le protocole présenté ici montre une méthode d’encapsulation mais permet à l’utilisateur de choisir l’une ou l’autre configuration en fonction de ses besoins.

De plus, ce protocole décrit une méthode optimisée d’encapsulation pour deux réseaux cytosquelettiques différents : FtsZ et actine. Étant donné que ces deux protéines nécessitent des conditions de tampon et d’encombrement différentes, le protocole aborde les modifications ultérieures nécessaires pour obtenir une reconstitution optimale du réseau. Par conséquent, l’approche présentée ici peut être utilisée et généralisée pour encapsuler toutes les biomolécules requises dans des GUV séparées en phase.

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation du mélange de lipides

  1. Prendre 0,5 mL de chloroforme dans un flacon en verre de 5 mL. Ajouter 17,5 μL de DOPC, 7,4 μL de DOPG, 29,6 μL de DPPC (tous à partir de stocks lipidiques de 25 g/L préparés dans du chloroforme), 32,2 μL de 10 g/L de DPPG et 20,6 μL de 18 g/L de cholestérol. Ajouter 1,2 μL de colorant Atto655-DOPE de 1 g/L. Vortex doucement le mélange lipidique et, évaporez le chloroforme sous l’écoulement d’azote et remettez en suspension le film mince dans un total de 400 μL de chloroforme.
  2. Pour l’encapsulation de FtsZ, le mélange lipidique final préparé est dans le rapport DOPC : DOPG : DPPC : DPPG : Chol (17,499 : 7,5 : 31,5 : 13,5 : 30 mol) marqué avec 0,001 % molaire Atto655-DOPE. Pour la production de GUV avec de l’actine encapsulée, le mélange lipidique contient des lipides biotinylés, et il est préparé dans le rapport DOPC : DOPG : DPPC : DPPG : DPPG : Chol : Biotinyl CAP PE (17.499 : 7.5 : 30.5 : 13.5 : 30 : 1) marqué avec 0,001 % molaire Atto655-DOPE.
  3. Dissoudre le mélange lipidique (32 mM, 50 μL) dans du chloroforme et sécher dans un flacon en verre sous un flux de gaz N2 pendant ~15 min.
  4. Le flacon en verre est ensuite stocké sous vide dans un dessiccateur pendant ~30 min pour éliminer toute trace de chloroforme résiduel.
  5. Dispersez le film séché dans un mélange de décane (20 μL) et d’huile minérale (500 μL) dans le flacon en verre pour obtenir la concentration finale de 3,2 mM et le sonicate à des températures élevées (~50 °C) pendant ~30 min à l’aide d’un sonicateur à bain.
  6. Transférez le mélange lipides dans l’huile dans un tube et incubez le tube à 37 °C pendant ~10 min avant de passer aux étapes suivantes.
  7. Préparez le mélange d’encapsulation interne pour les protéines.

2. Préparation des solutions internes pour l’encapsulation

  1. Mélange de filaments FtsZ
    1. Préparez le mélange de protéines FtsZ dans un volume total de 10 μL dans un microtube. Pour le réseau filamenteux FtsZ, ajoutez 0,87 μL de 23 μM FtsZ-YFP-mts, 1,31 μL de 381 g/L de Ficoll70, 1,11 μL de 271 g/L de BSA et 1 μL de 25 mM GTP à 5,71 μL de tampon de réaction FtsZ (RB). Le volume total de la solution est de 10 μL contenant 2 μM FtsZ-YFP-mts, 50 g/L de Ficoll70, 30 g/L de BSA et 2,5 mM de GTP dans la solution finale. Gardez-le sur la glace avant de l’utiliser pour l’encapsulation dans les GUV.
      REMARQUE : Le tampon de réaction FtsZ (RB) contient 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de GluK, 5 mM de GluMg.
  2. Mélange d’actine et de faisceaux
    1. Pour l’encapsulation des faisceaux d’actine, préparez d’abord un mélange maître d’actine de 10 μL (A-Mix) contenant 86 % d’actine G, 10 % d’actine Atto488 et 4 % d’actine biotinylée dans l’eau. Pour cette étape, préparez des solutions mères de protéines selon les instructions du fabricant. Ensuite, pour une concentration finale de 35,42 μM A-Mix, ajoutez 6,39 μ L de 2 g/L de G-actine, 1,48 μL de 1 g/L d’Atto488-actine, 1,19 μL d’actine biotinylée de 0,5 g/L et 0,9 μL de H2O. Garder sur de la glace et se cacher de la lumière.
    2. Pour éviter la prépolymérisation et le regroupement de l’actine à l’extérieur des GUV, préparez la solution finale d’actine quelques minutes avant l’encapsulation. La solution finale se compose de 7 % d’iodixanol, de 0,01 g/L de neutravidin, de 2,4 μM d’A-Mix, de 0,6 μM de fascin, de 10 g/L de BSA, de 20 g/L de Ficoll70 et de 5 mM d’ATP dans un tampon de polymérisation d’actine.
      1. Pour préparer cette solution finale, qui doit être conservée sur de la glace en tout temps, ajoutez dans l’ordre suivant : 2,92 μL d’iodixanol à 60 %, 10,25 μL de H2O, 2,5 μL de neutravidine de 0,1 g/L, 0,92 l de BSA de 271 g/L, 1,31 l de Ficoll70 de 381 g/L, 2,5 l de tampon de polymérisation de l’actine 10x, 1,69 μL de 35,42 μM A-Mix, 1,65 μL de 9 μM Fascine et 1,25 μL de 100 mM d’ATP. Bien mélanger et prélever rapidement les 5 μL nécessaires à l’encapsulation.
        REMARQUE : mesurer l’osmolarité de cette solution interne à l’aide d’un osmomètre (~430 mOsm/Kg). Un mélange de solution extérieure correspondant avec la même osmolarité doit être préparé en diluant le glucose dans de l’eau jusqu’à ce qu’il atteigne la même valeur d’osmolarité (voir étape 3.2). Le tampon de polymérisation d’actine 10x contient 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de KCl et 50 mM de MgCl2.

3. Production de GUV et encapsulation in vitro

  1. Production GUV en tubes : encapsulation de FtsZ
    1. Pour l’encapsulation FtsZ, ajoutez 500 μL de tampon réactionnel FtsZ (RB) dans un tube en plastique de 1,5 mL et ajoutez doucement 200 μL de mélange lipidique dans l’huile (préparé à l’étape 1.6 ci-dessus) pour permettre la formation d’une interface huile-eau et le dépôt d’une monocouche lipidique à cette interface.
    2. Pour former l’émulsion, prenez d’abord un autre tube de 1,5 ml et ajoutez 200 μL de lipides dans l’huile. Incuber ce tube à 37 °C pendant ~10 min avant de former l’émulsion.
    3. Une fois incubé, ajoutez 5 μL du mélange de protéines FtsZ (préparé en 2.1.1) dans ce tube. La protéine de 5 μL dans le milieu aqueux coule au fond du tube sous forme de gouttelettes.
    4. Faites une émulsion en tapotant doucement sur le fond du tube 5 à 6 fois jusqu’à ce que la solution devienne visiblement trouble.
    5. Pipetez doucement cette émulsion et placez-la au-dessus de l’interface huile-eau (préparée à l’étape 3.1.1 ci-dessus).
    6. Centrifugez-le à 6000 x g pendant 30 min à une température préchauffée de 37 °C et maintenez cette température jusqu’à la fin de la production de vésicules.
    7. Laissez l’échantillon refroidir à température ambiante pendant près de 30 minutes avant l’imagerie.
    8. Retirez la couche supérieure d’huile en pipetant doucement à partir du haut du tube, laissant près de 100 à 200 μL de solution pour l’imagerie.
    9. Coupez une pointe de pipette à un angle incliné avec des ciseaux et prélevez doucement 50 à 100 μL de la solution GUV au fond du tube. Cette solution sera utilisée pour l’imagerie.
  2. Production de GUV directement dans des plaques à 96 puits : encapsulation de l’actine
    1. Pour l’encapsulation de l’actine, préparez d’abord un mélange de solution externe (glucose dans l’eau) avec la même osmolarité que le mélange d’actine interne. Pour correspondre aux ~430 mOsm/Kg du mélange interne, préparez un mélange de solution externe en ajoutant 198 μL de glucose 2 M dans 802 μL H2O.
    2. Pour faire les vésicules directement sur une plaque à puits, passez d’abord un puits d’une plaque à 96 puits. Ajouter 100 μL de BSA de 10 g/L dans le puits et incuber pendant 10-15 min. Ensuite, lavez cinq fois le puits avec une solution extérieure de 100 μL en prenant soin de ne pas toucher le fond en verre passivé avec la pointe de la pipette. Laissez 100 μL du mélange de solution externe dans le puits après avoir terminé le lavage.
    3. Ajoutez doucement 50 μL de mélange lipidique dans l’huile dans le puits pour préparer la monocouche lipidique au-dessus de la solution externe. Pour assurer un dépôt correct de l’huile sur la phase aqueuse, posez la pointe de la pipette sur un côté du puits et laissez l’huile glisser de la paroi du puits.
    4. Pour former l’émulsion, prenez d’abord un tube de 1,5 ml et ajoutez 100 μL de lipides dans l’huile. Incuber ce tube à 37 °C pendant ~10 min avant de former l’émulsion.
    5. Ajouter 2,5 μL de la solution finale d’actine (de l’étape 2.2.2) dans le tube contenant 100 μL de mélange lipidique dans l’huile (étape 1.6 ci-dessus). La protéine de 2,5 μL dans le milieu aqueux coule au fond du tube sous forme de gouttelettes.
    6. Faites une émulsion en tapotant doucement sur le fond du tube 10 à 20 fois jusqu’à ce que la solution devienne visiblement trouble.
    7. Pipetez doucement cette émulsion et placez-la au-dessus de l’interface huile-eau (préparée à l’étape 3.2.3 ci-dessus). Immergez soigneusement l’extrémité de la pipette au milieu de la monocouche d’huile et déposez l’émulsion. L’émulsion forme un nuage trouble confiné dans la phase monocouche d’huile.
    8. Centrifuger la plaque à 96 puits à 200 x g pendant 20 min à une température préchauffée de 37 °C et maintenir cette température jusqu’à la fin de la production de la vésicule.
      REMARQUE : Centrifuger à 400 x g pendant 10 min pour raccourcir le temps de production de la vésicule. Cependant, respectez ces paramètres de centrifugation pour de meilleurs résultats. Une centrifugation supérieure à 400 x g permet d’obtenir des vésicules compactées avec des agrégats lipidiques s’accumulant au fond de la plaque d’imagerie.
    9. Laissez l’échantillon refroidir à température ambiante pendant près de 30 minutes avant l’imagerie.
      REMARQUE : L’imagerie directe peut être effectuée sur un puits sans qu’il soit nécessaire de retirer la couche supérieure d’huile ou de transférer les vésicules dans une autre chambre/puits.

4. Imagerie et reconstruction d’images 3D

  1. Prenez une plaque à puits d’imagerie 96 et passivez-la avec du BSA pendant ~10 min avant de transférer l’échantillon sur la plaque à puits d’imagerie (voir étape 3.2.2).
  2. Transférez la solution GUV sur la plaque à puits passivée.
  3. Installez la plaque du puits sur la platine d’un microscope confocal inversé sur un objectif à eau 40x.
  4. Concentrez-vous sur n’importe quelle région d’intérêt (ROI) et prenez une séquence d’images z-stack à partir du ROI choisi avec des intervalles z-step fixes. Le protocole permet d’obtenir des GUV de 5 à 30 μm, de sorte que l’intervalle peut être fixé à 0,5 à 1 μm, selon les besoins.
  5. Enregistrez chaque séquence d’images z-stack au format .tiff.
  6. Ouvrez une séquence d’images d’intérêt dans un logiciel de traitement d’images (ImageJ/Fiji). Identifiez l’image avec l’intensité la plus élevée. Maintenez les touches ctrl+shift+c pour ouvrir la fenêtre Luminosité et contraste et cliquez sur Auto.
  7. Dans le menu ImageJ/Fiji, allez dans Analyser > Définir l’échelle et entrez la distance physique connue et son unité pour chaque pixel de l’image.
  8. Dans le menu ImageJ/Fiji, accédez à Image > Stacks > projet Z pour reconstruire une image 3D à partir de la pile z. Définissez le type de projection sur Écart type. Les options par défaut peuvent être utilisées pour le reste des paramètres (Tranche de début et Tranche d’arrêt).
    REMARQUE : méfiez-vous des artefacts de projection d’écart-type résultant du chevauchement des piles z dans la reconstruction 3D. Pour vous assurer qu’il n’y a pas d’artefacts, supprimez les piles z dans l’hémisphère inférieur de la sphère pour n’observer que la projection de la moitié supérieure.

5. Analyse statistique de la fréquence GUV en fonction de la taille

  1. Acquérez des images de la pile Z des GUV d’intérêt, comme expliqué aux étapes 4.4 et 4.5. Pour obtenir des images d’un maximum de GUV dans un large champ de vision, acquérez des piles confocales avec un zoom 1x ou 2x.
  2. Ouvrez les séquences Z-stack dans un logiciel de traitement d’images (dans ce cas, ImageJ/Fiji), comme expliqué en 4.6.
  3. Sélectionnez le canal d’affichage où le signal de fluorescence de la membrane a été acquis en cliquant sur la barre étiquetée c sous l’image. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image comme expliqué en 4.6.
  4. Naviguez à travers les différents plans acquis en cliquant sur la barre z sous l’image ouverte. Sélectionnez le plan où le diamètre de la vésicule à analyser est le plus grand.
  5. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement dans ImageJ/Fiji en cliquant sur Analyser les outils > > Gestionnaire de retour sur investissement.
  6. À partir des outils disponibles dans le panneau principal d’ImageJ/Fiji, cliquez sur la sélection ovale.
  7. Dessinez un cercle qui s’adapte au GUV en suivant l’intensité de fluorescence de la membrane GUV. Pour dessiner une sélection de cercle, appuyez sur la touche Maj et faites glisser la souris pour agrandir le cercle jusqu’à la taille de la vésicule. La sélection du cercle peut être déplacée en cliquant simultanément sur le bouton gauche de la souris au centre de la vésicule et en faisant glisser la souris à l’endroit souhaité.
  8. Enregistrez la sélection de cercles dessinée dans le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Ajouter [t], situé dans le panneau d’options du gestionnaire de retour sur investissement.
  9. Pour obtenir la taille de la vésicule en microns, cliquez sur Mesurer situé sur le panneau du ROI Manager. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Prenez la valeur affichée dans la colonne Majeur ou Mineur (les deux colonnes doivent avoir la même valeur car elles se réfèrent aux axes d’ellipse) comme mesure du diamètre de la vésicule.
  10. Utilisez un logiciel de traçage (Excel, Origin, Prism) pour créer un graphique à barres dans lequel la fraction de GUV pour différentes plages de tailles est spécifiée.

Résultats

Dans un premier temps, des GUV avec séparation de phase membranaire ont été produits selon une approche d’émulsion inversée modifiée (Figure 1A). Il en résulte un rendement élevé de GUVs, qui présentent une membrane démélangée en domaines Ld et Lo , comme représenté par l’étiquette Atto 655-DOPE sur le domaine Ld et les régions sombres correspondant aux domaines Lo non marqués (Figure 1B). Cette méthode permet d’obtenir des GUV séparés en phase de tailles allant de 5 à 30 μm (figure 1C) à des températures élevées (toutes les étapes sont effectuées à 37 °C et imagées à RT). De plus, les vitesses de centrifugation ont été ajustées pour assurer l’incorporation des lipides des composants d’origine dans les GUV ainsi que pour éviter une surpopulation excessive.

De plus, pour démontrer l’encapsulation réussie des biomolécules à l’aide de la méthode d’émulsion décrite dans le protocole actuel, les réseaux FtsZ et d’actine ont été reconstitués dans des expériences individuelles. Les réseaux FtsZ sont récapitulés à l’intérieur des GUV, qui émergent sous forme de filaments se liant préférentiellement aux domaines Ld via leur séquence de ciblage membranaire (MTS) en présence de 2,5 mM GTP et 50 g/L de Ficoll70 (comme illustré à la figure 2). Les réseaux ont été observés environ 1 h après l’étape d’encapsulation. Cependant, les réseaux d’actomyosine émergent sous forme de faisceaux minces (contrairement aux réseaux épais de FtsZ) après reconstitution au sein des GUV (Figure 3). Il convient de noter que les lipides biotinylés jouent un rôle crucial dans la liaison des réseaux d’actomyosine à la membrane des GUV. Sans lipides biotinylés, les faisceaux d’actomyosine ne peuvent pas adopter une configuration incurvée et restent sous forme de faisceaux droits, courts et rigides à la lumière au lieu d’adhérer à la membrane comme un maillage enchevêtré de longs faisceaux (Figure 4).

Dans le protocole d’émulsion modifié, la vitesse de centrifugation est ajustée pour obtenir des GUV à séparation de phase, comme mentionné précédemment. En effet, des vitesses de centrifugation plus élevées avec des échantillons contenant des réseaux d’actomyosine (600 x g pendant 15 min) entraînent l’agrégation des vésicules dans une configuration semblable à celle d’un tissu à l’intérieur du puits de production. Ainsi, dans toutes les expériences standard de reconstitution de réseaux d’actomyosine, la vitesse optimale de centrifugation a été fixée à 200 x g pour obtenir des GUVs non agrégés (Figure 5).

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Figure 1 : Génération en un seul pot de GUV à séparation de phase en utilisant la méthode de transfert à double émulsion. (A) Schéma expérimental des étapes clés de la production en un seul pot de vésicules à séparation de phase par transfert à double émulsion. (B) Image de projection Z confocale des GUV résultantes générées selon la méthode décrite en A. La barre d’échelle est de 50 μm. (C) Graphique à barres avec la fraction des GUV séparés en phase générée en fonction de leur diamètre. Expériences réalisées n = 3, le nombre total de GUV analysés par expérience = 100. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes, les points de données individuels sont les trois expériences indépendantes. Les barres d’erreur représentent l’écart-type des trois expériences. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Vésicules à séparation de phase avec réseaux FtsZ encapsulés. (A) Images de projection 3D confocales réalisées sur une pile z entièrement acquise d’un GUV à séparation de phase contenant un réseau FtsZ. (B) Images de projection Z confocales réalisées uniquement sur la moitié supérieure de la vésicule. En raison de la formation hétérogène de domaines à la surface de la GUV, la reconstruction 3D des coupes confocales acquises montre le chevauchement des domaines lipidiques des zones supérieure et inférieure de la vésicule. Pour éviter les chevauchements et faciliter l’inspection visuelle des domaines, la moitié inférieure des piles z acquises est supprimée du fichier. La moitié supérieure résultante est ensuite utilisée pour sa projection 3D via l’écart-type. Les barres d’échelle mesurent toutes deux 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3 : Vésicules à séparation de phase avec réseaux d’actomyosine encapsulés. (A) Images confocales par projection Z d’une pile entière acquise avec une vue zoom arrière du puits après la production de la vésicule. Le rendement élevé des vésicules obtenues permet l’étude des différentes structures d’actomyosine à l’intérieur des vésicules. La barre d’échelle est de 50 μm. (B) Images de projection Z confocales réalisées sur la moitié supérieure d’une vésicule. Pour faciliter l’analyse visuelle des domaines lipidiques, seule la moitié supérieure des tranches d’image est utilisée pour effectuer une projection 3D. La barre d’échelle est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4 : Importance des lipides biotinylés pour la génération de réseaux d’actomyosine liés à la membrane à l’intérieur des vésicules séparées en phase. Projections 3D confocales représentant des vésicules séparées en phase avec des réseaux d’actomyosine non attachés. Si des lipides biotinylés ne sont pas incorporés dans le mélange, des structures d’actomyosine se forment à la lumière et n’acquièrent pas une configuration incurvée sur le feuillet interne des vésicules (panneau de droite, actine marquée par Atto488). La barre d’échelle est de 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5 : Effet de la vitesse de centrifugation sur la production de vésicules séparées en phase par transfert d’émulsion. Images 2D confocales montrant un échantillon GUV généré en utilisant une force de centrifugation de 600 x g pendant 15 min. La vitesse de centrifugation utilisée, supérieure à la vitesse optimisée de 200 x g, entraîne l’agrégation des vésicules dans une configuration semblable à celle d’un tissu à l’intérieur du puits. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’un des principaux défis de la reconstitution in vitro de systèmes modèles membranaires est l’encapsulation des protéines à l’intérieur de GUV séparés en phase en raison de leur préparation à haute température. En effet, la génération de ce type de vésicules séparées en phase via la synthèse en un seul pot peut entraîner des difficultés découlant de la dégradation des protéines à des températures élevées. Ainsi, ce protocole décrit les conditions optimisées pour observer la séparation de phase membranaire suivant la méthode de double émulsion pour la production de GUV à des températures physiologiques, tout en maintenant simultanément l’activité des protéines encapsulées. Cette approche introduit une charge négative dans les deux domaines pour faciliter la liaison de toutes les protéines souhaitées lorsque les interactions électrostatiques sont une condition préalable. Dans le cas de l’encapsulation de FtsZ, malgré la présence d’une charge négative dans les deux domaines, les réseaux cytosquelettiques se développent et se lient préférentiellement aux domaines Ld , indiquant qu’avec la charge négative, la fluidité de la membrane est une condition essentielle pour la liaison aux protéines18. De plus, dans le cas de l’encapsulation d’actine, les réseaux se développent sur des régions membranaires où les lipides biotinylés sont incorporés19.

Bien que le test de transfert d’émulsion soit largement utilisé dans la littérature, il n’a été appliqué qu’à la production de GUV homogènes. Ce protocole se compose donc de plusieurs aspects modifiés du test, qui permettent d’observer la formation de domaines dans la membrane. L’un des aspects majeurs à cet égard est la température. Pour observer les domaines, ainsi que pour maintenir la fonctionnalité des protéines (en particulier la formation du réseau cytosquelettique), ce protocole utilise 37 °C pour produire des GUV. D’une part, lorsque les GUV sont produits à une température plus élevée, les protéines encapsulées perdent leur fonctionnalité, résidant dans la lumière et ne polymérisant pas en structures d’ordre supérieur. En revanche, si les GUV sont produits à une température plus basse, la séparation de phase n’est pas observée dans la membrane. Ainsi, 37 °C devient la température optimale pour la production de GUV dans les expériences.

Il est important de noter que ce protocole offre deux systèmes d’essai possibles pour produire des GUV suivant le même principe de transfert d’émulsion : à l’intérieur des tubes et des plaques de puits. Les deux présentent des avantages et des inconvénients, que l’utilisateur peut être amené à prendre en compte lors de la phase de planification expérimentale pour déterminer quel système correspond le mieux à ses besoins. En effet, les tubes en plastique ne nécessitent pas de centrifugeuse équipée d’un rotor pour les plaques de puits, ils sont plus faciles à manipuler, et permettent de contrôler le facteur de dilution des vésicules après la production et avant l’imagerie. Cependant, ils nécessitent des volumes plus élevés (pour les phases huileuse et aqueuse) et l’élimination de la couche d’huile après la production pour l’extraction GUV, ce qui peut laisser des restes d’huile dans le puits d’imagerie si cette étape n’est pas effectuée avec soin. Alternativement, les plaques de puits nécessitent l’utilisation d’un volume d’échantillon inférieur, permettent l’encapsulation de différentes conditions internes en série et en une seule fois, et ne nécessitent pas d’extraction GUV, car les vésicules peuvent être imagées juste après la production dans le même puits de production. Le principal inconvénient des plaques à puits est l’agrégation des vésicules et la nécessité d’ajuster les paramètres de centrifugation pour obtenir un rendement de production de vésicules similaire à celui observé dans les tubes.

Indépendamment du système d’encapsulation utilisé (tubes ou plaques à puits), cette approche montre que des conditions d’encombrement optimales sont nécessaires pour produire les GUV, ainsi que pour faciliter la polymérisation des protéines encapsulées. En particulier, suite à ce protocole, les meilleures conditions pour les GUVs avec FtsZ encapsulé ont été observées avec 30 g/L de BSA et 50 g/L de Ficoll7018 ; tandis que pour l’actine, un mélange de 10 g/L de BSA, 7 % d’iodixanol et 20 g/L de Ficoll70 était nécessaire19.

Un autre aspect important de la production GUV est la vitesse et le temps de centrifugation. Pour la formation de réseaux FtsZ sous les concentrations d’encombrement mentionnées ci-dessus, la centrifugation à 6000 x g pendant 30 min permet d’obtenir une population de GUVs bien répartie et séparée sur la plaque du puits d’imagerie. A l’inverse, pour l’actine, 200 x g pendant 20 min permet de générer un rendement de production GUV élevé. Si la vitesse ou le temps de centrifugation est diminué, le rendement des GUVs est affecté, tandis que l’augmentation de celui-ci au-dessus de ces valeurs conduit à l’agrégation des GUVs. Dans ces conditions, ce protocole génère des GUV avec une efficacité d’encapsulation maximale ainsi que des GUV individuels qui ne collent pas ensemble.

Bien que ce protocole puisse être généralisé à n’importe quel lipide et biomolécule encapsulée, la composition membranaire souhaitée et le contenu des vésicules dictent les paramètres de centrifugation, qui permettent la génération de vésicules séparées en phase. Par conséquent, ce protocole sert de ligne directrice pour permettre la production de diverses vésicules avec des domaines membranaires.

De telles méthodologies de reconstitution in vitro dans des GUV séparées en phase sont cruciales pour comprendre la dynamique complexe protéine-membrane médiée par les domaines lipidiques, tout en considérant la complexité des membranes cellulaires14. La petite taille et la nature très dynamique de ces domaines lipidiques rendent difficile la caractérisation des interactions interfaciales in vivo. Par conséquent, les GUV constituent un outil essentiel en raison de leur relative facilité de préparation et de modulation physico-chimique, ainsi que de leur aptitude à l’analyse par microscopie optique20.

De plus, l’encapsulation de molécules fonctionnelles au sein de biointerfaces hétérogènes présente des applications prometteuses dans le domaine de la nanomédecine. En particulier, le développement de systèmes fonctionnalisés d’administration de médicaments avec des propriétés différentes résultant de la distribution asymétrique et du partitionnement des biomolécules en zones confinées à leur surface21. Les interactions médicament-lipide jouent un rôle important dans les propriétés pharmacocinétiques des médicaments, telles que leur transport, leur distribution et leur accumulation, qui influencent finalement l’efficacité des médicaments utilisés22. Par conséquent, il est essentiel de comprendre le rôle de ces interactions sur les propriétés pharmacocinétiques des médicaments pour développer des médicaments efficaces. Des membranes lipidiques modèles peuvent être explorées pour comprendre leurs mécanismes d’interactions avec les peptides, les polymères et les nanotransporteurs23. Ainsi, les changements dans la composition lipidique des cellules et des tissus dans certaines conditions pathologiques peuvent modifier les interactions biophysiques, qui pourraient être explorées pour développer des médicaments et des systèmes d’administration de médicaments spécifiques à la cible24.

En conclusion, le protocole décrit ici fournit une stratégie facile pour générer des GUV séparés en phase avec des protéines encapsulées ancrées à leur feuillet lipidique interne. La génération de ces systèmes vésiculaires est prometteuse dans des domaines tels que la biotechnologie et la biologie synthétique, où des assemblages à plusieurs composants avec des fonctionnalités complexes pour imiter des fonctions similaires à celles des cellules pourraient apporter des solutions innovantes et de nouvelles applications.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier la plateforme du MPIB pour son aide à la purification des protéines, Michaela Schaper pour le clonage des plasmides, Kerstin Röhrl pour la purification des protéines et Sandra Ortmeier pour les préparations lipidiques. Les auteurs tiennent également à remercier Adrián Merino-Salomón et Shunshi Kohyama pour leurs discussions utiles sur les conditions de crowder et l’encapsulation des protéines. M.R.-L. fait partie de l’IMPRS-ML et du projet ONE MUNICH soutenu par le ministère fédéral de l’Éducation et de la Recherche (BMBF) ainsi que par l’État libre de Bavière dans le cadre de la stratégie d’excellence du gouvernement fédéral et des Länder. Les auteurs tiennent également à remercier le Center for Nanoscience (CeNS) de Munich pour son soutien.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (sel de sodium) (DOPG)Avanti Lipides polaires840475Dans le chloroforme
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Lipides polaires850375Dans le chloroforme
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sel de sodium) (18:1 Biotinyl Cap PE)Avanti Polar lipids870273In chloroforme
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (sel de sodium) (DPPG)Avanti Lipides polaires840455Dans le chloroforme
1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Lipides polaires850355Dans le chloroforme
Microplaque à fond plat à 96 puits (SensoPlate)
Actine (alpha-actine muscle squelettique, lapin)HYPERMOL8101-01
Atto488-Actin (muscle squelettique alpha-actin, lapin)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16
Sonicateur à bainBranson  ;1510R-MTHNettoyeur à ultrasons Bransonic
Biotine-actine (alpha-actine muscle squelettique, lapin)HYPERMOL8109-01
BSASigma AldrichA6003
CentrifugeuseEppendorf5424R
CentrifugeuseEppendorf5804 R
ChloroformeSigma Aldrich67-66-3
Cholestérol (ovin)Avanti Polar lipids700000In chloroform
DecaneTCI Deutschland GmbHD0011
Fascin (humain, recombinant)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Iodixanol (OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 laser confocal microscope à balayageCarl ZeissC-Apochromat 40&thinsp ; & fois ; Objectif à immersion dans l’eau &thinsp ;/1.2. Lasers à semi-conducteurs pompés par diode : 488&thinsp ; NM et 640&thinsp ; Nm.
Huile minéraleSigma Aldrich8042-47-5
Myosine II (muscle squelettique du lapin)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinThermo Fisher Scientific Inc.31000
OsmomètreFiske AssociatesMicro-osmomètre Fiske modèle 120
Greiner Bio-One  ; Sàrl07-000-109
de poudre

Références

  1. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  2. Imai, M., Walde, P. Giant unilamellar vesicles: From protocell models to the construction of minimal cells. The Giant Vesicle Book. , (2019).
  3. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Res Lett. 8 (1), 102(2013).
  4. Litschel, T., Schwille, P. Protein Reconstitution Inside Giant Unilamellar Vesicles. Annu Rev Biophys. 50 (1), 100620-114132 (2021).
  5. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  6. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss Chem Soc. 81 (0), 303-311 (1986).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  8. Dürre, K., Bausch, A. R. Formation of phase separated vesicles by double layer cDICE. Soft Matter. 15 (47), 9676-9681 (2019).
  9. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  10. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nat Commun. 7 (1), 10447(2016).
  11. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  12. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the Inverted Emulsion Method for High-Yield Production of Biomimetic Giant Unilamellar Vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  13. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys J. 91 (11), 4064-4070 (2006).
  14. Lopes dos Santos, R., Malo, M., Campillo, C. Spatial Control of Arp2/3-Induced Actin Polymerization on Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. ACS Synth Biol. 12 (11), 3267-3274 (2023).
  15. Sun, Q., Fu, Y., Wang, W. Temperature effects on hydrophobic interactions: Implications for protein unfolding. Chem. Phys. 559, 111550(2022).
  16. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of temperature on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 25 (21), 6432-6438 (1986).
  17. Concha-Marambio, L., Maldonado, P., Lagos, R., Monasterio, O., Montecinos-Franjola, F. Thermal adaptation of mesophilic and thermophilic FtsZ assembly by modulation of the critical concentration. PLoS One. 12 (10), e0185707(2017).
  18. Kanwa, N., Kohyama, S., Fröhlich, L., Desai, A., Schwille, P. Mutual dependence between membrane phase separation and bacterial division protein dynamics in synthetic cell models. Angew Chem Int Ed Engl. 64 (6), e202417800(2025).
  19. Reverte-López, M., et al. Self-organized spatial targeting of contractile actomyosin rings for synthetic cell division. Nat Commun. 15 (1), 10415(2024).
  20. dos Santos, R. L., Campillo, C. Studying actin-induced cell shape changes using Giant Unilamellar Vesicles and reconstituted actin networks. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1527(2022).
  21. Staufer, O., et al. Microfluidic production and characterization of biofunctionalized giant unilamellar vesicles for targeted intracellular cargo delivery. Biomaterials. 264, 120203(2021).
  22. Lopes, D., Jakobtorweihen, S., Nunes, C., Sarmento, B., Reis, S. Shedding light on the puzzle of drug-membrane interactions: Experimental techniques and molecular dynamics simulations. Prog Lipid Res. 65, 24-44 (2017).
  23. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: applications in drug discovery and drug delivery. Mol Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  24. Schulz, M., Werner, S., Bacia, K., Binder, W. H. Controlling Molecular Recognition with Lipid/Polymer Domains in Vesicle Membranes. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (6), 1829-1833 (2013).

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Mots-clés

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