In vivo Microscopie confocale : une procédure opératoire standard pour la détection des acariens Demodex au bord de la paupière

Résumé

La microscopie confocale in vivo est une technique d’imagerie prometteuse à haute résolution. Nous présentons la procédure suivante pour que les cliniciens détectent Demodex au bord de la paupière in vivo.

Résumé

L’infestation par les acariens Demodex peut provoquer une inflammation du bord de la paupière, et la blépharite Demodex peut donner lieu à une série d’affections oculaires dans les cas cliniques. De nombreux médecins diagnostiquent l’infestation oculaire des acariens Demodex par l’épilation des cils et l’observation des cils sous microscopie optique in vitro. Cependant, la présence d’acariens résiduels après l’extraction des cils et la douleur associée à la procédure sont des limites des soins cliniques standard.

La microscopie confocale in vivo (IVCM) est une technique d’imagerie non invasive qui permet aux cliniciens d’observer en détail les acariens Demodex au bord de la paupière sans épilation. Cette technique permet une analyse indolore qui peut être réalisée en <30 min. Malgré l’attention croissante portée à cet examen, il peut être inaccessible à de nombreux ophtalmologistes sans expérience approfondie. Cet article présente une procédure opératoire standard pour la visualisation des acariens Demodex au bord de la paupière avec IVCM afin de promouvoir une adoption accrue de cette méthode dans le travail clinique.

Introduction

La blépharite est l’un des diagnostics ophtalmiques les plus fréquemment rencontrés dans la pratique clinique. Les preuves suggèrent une association significative entre la présence d’acariens Demodex et la blépharite¹. L’infestation d’acariens implique à la fois les dommages directs causés par Demodex² et les réponses immunitaires déclenchées par ses sécrétions, qui peuvent agir comme un vecteur pour les bactéries et potentiellement contribuer au développement de la blépharite³. La blépharite Demodex (DB) provoque un éventail d’événements insatisfaisants, y compris des dommages à la cornée et à la surface oculaire¹, qui ont un impact négatif sur la qualité de vie d’un patient ^4,5.

Demodex est un acarien parasite qui habite les follicules pileux et les glandes sébacées, ainsi que les zones proches⁶. La détection de Demodex dans ou autour des follicules des cils peut aider au diagnostic de DB⁷. Le diagnostic clinique de la DB implique l’épilation des cils et l’observation de Demodex sous microscopie optique. Cependant, il est reconnu que de nombreux acariens résidant profondément dans le follicule peuvent rester dans l’orifice après l’ablation des cils ^8,9,10, ce qui peut conduire à une sous-estimation du nombre d’acariens. La microscopie confocale in vivo (IVCM), un outil d’imagerie non invasif en ophtalmologie, offre une approche alternative pour visualiser Demodex dans ou autour des follicules des cils in vivo¹¹. Cette technique donne un aperçu des microstructures de la surface oculaire et des paupières avec une résolution histologique^{de 11}. Les acariens peuvent être identifiés visuellement en fonction de leur morphologie et de leur motilité caractéristiques. Cependant, l’IVCM peut présenter des défis techniques pour les ophtalmologistes manquant d’expérience approfondie avec cette modalité d’imagerie¹².

Pour faciliter l’adoption de l’IVCM dans les applications cliniques de routine, y compris le diagnostic différentiel et le suivi des paupières saines ainsi que de la DB, nous proposons une procédure opératoire standard (SOP) pour l’observation des acariens Demodex au bord de la paupière. Ce protocole fournit aux cliniciens une approche systématique pour la détection des acariens in vivo.

Protocole

Ce protocole se concentre sur la POS utilisée pour l’observation de Demodex au bord de la paupière avec IVCM (Figure 1). Cette étude a été approuvée par l’Institutional Review Board (IRB) de l’Hôpital ophtalmologique de l’Université médicale de Wenzhou (approbation IRB n° H2023-022-K-20), et l’exigence d’un consentement individuel pour cette analyse rétrospective a été supprimée en raison de la nature rétrospective. Les procédures décrites ici font référence aux descriptions qui ont été rapportées précédemment 11,13,14,15,16.

Figure 1 : L’appareil de tomographie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparez l’appareil et le programme

1. Allumez l’ordinateur.
   1. Une fois que le bureau apparaît, basculez l’interrupteur à bascule à l’arrière de l’appareil de O à I. Recherchez la lueur verte de l’interrupteur à bascule indiquant que l’appareil est sous tension avant de commencer les examens.
      REMARQUE : La mise sous tension de l’appareil avant de démarrer l’ordinateur peut entraîner un échec de la connectivité.
   2. Démarrez le logiciel et définissez les paramètres du programme avant l’examen. Dans le menu Configuration , sélectionnez Options (Fichier supplémentaire 1 : Figure supplémentaire S1) ; Ensuite, cochez la case Afficher les numéros d’image pour afficher le numéro d’image de chaque image. De plus, cochez la case Afficher les informations à la sortie pour éviter l’arrêt involontaire du logiciel.
      REMARQUE : L’affichage des vignettes d’image sous forme de grandes icônes facilite l’observation directe des résultats. Ne modifiez pas les paramètres fréquemment.
2. Préparatifs avant l’examen
   1. Nettoyez l’objectif avec des lingettes nettoyantes pour lentilles. Désinfectez l’appui-tête et la mentonnière avec des boules de coton imbibées d’alcool pour éviter les infections résultant de germes pathogènes transmis par des pièces sales de l’appareil.
   2. Ajustez la mentonnière. Assurez-vous que la position horizontale de la mentonnière est correcte : appuyez ensemble sur les deux leviers noirs pour tirer la mentonnière vers l’avant jusqu’à ce qu’elle s’accroche.
   3. Déplacez l’appareil photo vers l’arrière. Tournez la vis de réglage pour vous assurer qu’elle s’éloigne du patient avant l’examen.
   4. Appliquez une goutte (environ 0,02 ml) de gel ophtalmique à base de carbomère comme gel de contact sur la surface avant de la lentille du microscope de l’appareil.
      REMARQUE : Assurez-vous que le gel de contact est exempt de bulles d’air et que seule une petite quantité est utilisée. Une trop grande quantité de gel de contact appliquée sur la surface avant de la lentille du microscope de l’appareil peut s’écouler dans l’objectif et adhérer aux composants mécaniques, ce qui endommage l’appareil.
   5. Retirez un capuchon stérile et jetable en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) de son couvercle de protection et appuyez fermement sur les côtés du capuchon sur l’objectif du microscope de l’appareil sans toucher la surface antérieure du capuchon (Figure 2).
      REMARQUE : Pour installer correctement le capuchon en PMMA, assurez-vous que le gel de contact est en contact avec la surface postérieure du capuchon sans aucune bulle d’air. Les bouchons sont stockés dans le récipient dédié pour éviter d’endommager l’emballage stérile. N’utilisez pas de bouchons dont l’emballage est endommagé, ce qui pourrait présenter un risque d’infection pendant l’examen.
   6. Appliquez une seule goutte de substitut de gel lacrymal sur la surface avant du capuchon comme un pont de gel entre le capuchon et la paupière (Figure 2).
      REMARQUE : Pour éviter toute confusion entre les gels, nous utilisons le même gel ophtalmique à base de Carbomer pour les deux applications : le substitut de larme de gel et le gel utilisé comme agent entre la lentille du microscope et le capuchon.
   7. Créez un nouveau dossier patient ou sélectionnez un dossier patient existant.

Figure 2 : L’ajustement correct du capuchon PMMA et l’application du gel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Préparer le patient

REMARQUE : N’effectuez pas cet examen si l’intégrité de la cornée est douteuse.

1. Pour obtenir la collaboration du patient et minimiser les risques potentiels, expliquez-lui ce qui suit :
   1. Assurez au patient que l’examen avec l’appareil est sûr même s’il touche la paupière. Informez le patient que son œil sera anesthésié par une goutte d’un anesthésique topique au bord de la paupière.
   2. Au début de l’examen, demandez au patient de placer son menton sur la mentonnière et d’appuyer son front contre l’appui-tête tout au long de la procédure d’examen pour une qualité d’image optimale.
   3. Informez le patient que l’appareil sera déplacé près de sa paupière jusqu’à ce que le capuchon en PMMA le touche. Assurez-leur qu’ils ne ressentiront aucune douleur lorsque l’appareil touchera leur paupière, bien qu’ils sentiront le contact du capuchon en PMMA. Demandez-leur d’informer immédiatement le clinicien s’ils ressentent une douleur pendant l’examen.
   4. Informez le patient qu’il doit maintenir son regard fixe pendant que le clinicien acquiert des images du bord de la paupière pour l’observation du Demodex. Demandez au patient d’informer le clinicien s’il ressent de la fatigue ; Ils seront autorisés à s’asseoir et à se reposer pendant un certain temps avant que l’examen ne se poursuive. Ils seront informés une fois l’examen terminé.
2. Suivez les instructions sur l’emballage de l’anesthésique topique et/ou du gel pour les yeux afin d’éviter les contre-indications médicamenteuses. Demandez au patient s’il a des allergies pour confirmer que les allergies du patient ne sont pas des contre-indications de l’anesthésique topique et/ou du gel oculaire.
   REMARQUE : Des réactions allergiques à l’anesthésique topique et/ou au gel oculaire peuvent survenir à la suite d’allergies non identifiées.
3. Appliquez une goutte de chlorhydrate de proparacaïne, un anesthésique topique, sur le bord de la paupière à examiner.
   REMARQUE : En cas de réaction allergique, rincer immédiatement avec une solution saline.

3. Effectuez un examen

1. Observez d’abord l’œil droit. Déplacez la caméra de balayage vers la gauche du point de vue de l’opérateur. OD sera sélectionné automatiquement dans la section Paramètres par la reconnaissance droite-gauche de l’appareil photo.
2. Déplacez la caméra CCD vers la gauche. Tournez l’objectif de l’objectif de la caméra CCD pour ajuster l’image de la caméra CCD (l’image de contrôle) perpendiculairement à l’axe optique de la caméra laser du scanner.
3. Commencez un nouvel examen.
   1. Observez la boîte de dialogue Données d’examen et, dans l’onglet Données d’examen , sélectionnez Tomographe rétinien-Cornée Heidelberg dans la liste déroulante Dispositif (Fichier supplémentaire 1 : Figure supplémentaire S2), puis observez la boîte de dialogue Paramètres du module de cornée qui s’affiche.
   2. Sélectionnez FOV 400 dans la liste déroulante Field Lens et cliquez sur OK pour confirmer (Fichier supplémentaire 1 : Figure supplémentaire S3).
   3. Attendez que la fenêtre d’acquisition s’ouvre ; L’image en direct de la caméra laser à balayage et l’image de contrôle s’affichent. Si l’image de contrôle ne s’affiche pas, assurez-vous que le câble de la caméra CCD est correctement connecté à la caméra CCD, puis redémarrez la fenêtre d’acquisition.
4. Réglez les facteurs dans la fenêtre d’acquisition (Fichier supplémentaire 1 : Figure supplémentaire S4) : sélectionnez 1x dans la liste déroulante Facteur de zoom CCD pour définir la taille de l’image de contrôle. Cochez les cases Luminosité automatique et Auto pour contrôler automatiquement la luminosité des images en direct et de contrôle. Cependant, si le contrôle automatique de la luminosité est désactivé, utilisez le curseur pour contrôler la luminosité de la commande et des images en direct. Vérifiez que le type de section de balayage a été sélectionné afin qu’une seule image soit acquise et stockée chaque fois que la pédale est enfoncée.
5. Acquérir une image de référence.
   1. Avant de commencer une acquisition, désactivez le contrôle automatique de la luminosité et déplacez le curseur vers la gauche pour régler la luminosité de l’image. Ajustez le plan focal à l’aide de la goupille de réglage de sorte que la réflexion lumineuse initiale s’affiche dans l’image en direct de la caméra laser à balayage après l’obscurité, indiquant la surface antérieure du capuchon en PMMA.
      REMARQUE : Le microscope permet des réglages focaux de 10 μm.
   2. Cliquez sur Réinitialiser dans la section Position de mise au point [μm] et attendez que la valeur de la position de mise au point [μm] passe à 0 ; L’image actuelle est indiquée comme l’image de référence. Désactivez la réinitialisation automatique et cochez la case Luminosité automatique ; La luminosité de l’image en direct sera automatiquement contrôlée.
   3. Si des lignes pointillées s’affichent à la place des valeurs dans la section Position de mise au point [μm], ou si les valeurs affichées ne changent pas malgré les réglages du plan focal, assurez-vous que le câble de l’objectif du microscope est correctement connecté.
      REMARQUE : La position de mise au point [μm] pour la pachymétrie affiche la position du plan focal de l’image actuellement affichée en microns. Si le plan focal est déplacé par la suite, l’emplacement réel du plan focal est calculé par rapport à la position de l’image de référence.
6. Élevez ou abaissez la hauteur de la table d’examen pour le patient. Placez le menton du patient sur la mentonnière et le front contre l’appuie-front (Figure 3A,B). Ajustez l’élévation de la mentonnière à l’aide de la vis de réglage noire désignée de l’appareil afin que les paupières supérieures du patient s’alignent avec les marques rouges sur la colonne de l’appui-tête.
7. Dites au patient de regarder vers le bas devant la source lumineuse fixe de l’aiguille et de maintenir son regard fixe (Figure 3A,B).
   REMARQUE : Le mouvement des yeux pendant la collecte d’images peut entraîner une mauvaise qualité d’image et endommager la surface oculaire.
8. Utilisez un coton-tige pour retourner la paupière supérieure, en exposant complètement la racine des cils et la marge palpébrale. Positionnez la réflexion du faisceau laser au niveau de la paupière supérieure du patient en tournant la vis de réglage de l’appareil. Déplacez lentement la caméra laser à balayage vers le bord supérieur de la paupière du patient jusqu’à ce qu’elle touche doucement le centre du capuchon en PMMA verticalement (Figure 3C). Si le patient signale une gêne, faites une pause et vérifiez l’alignement du capuchon en PMMA.
   REMARQUE : N’appliquez pas trop de pression sur la paupière du patient. Le contact entre le capuchon en PMMA et la paupière du patient en raison d’un pont de gel insuffisant, d’un mouvement des yeux et de la tête du patient et/ou d’un mouvement de caméra trop fort de l’opérateur peut endommager la surface oculaire et la paupière.
9. Scannez soigneusement la racine du cil du côté temporal vers le côté nasal du bord de la paupière avec de minuscules mouvements horizontaux du bord palpébral, permettant l’évaluation des cils et de leurs follicules. Numérisez et acquérez des images en tournant l’objectif du microscope de l’appareil dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, modifiez progressivement le plan de mise au point pour observer l’ensemble du follicule et de la racine des cils, et notez les différentes profondeurs affichées dans l’image en direct de la caméra laser à balayage. Acquérez des images en scannant six à dix follicules pileux de cils par œil, avec un échantillonnage réparti sur les régions temporale, moyenne et nasale du bord de la paupière.
   REMARQUE : Si un petit reflex s’affiche dans l’image en direct de la caméra laser à balayage et persiste lors du changement de position du plan focal, cela peut indiquer la présence de bulles d’air dans le gel de contact. Pour résoudre ce problème, renouvelez le gel de contact.
10. Enregistrez les images manuellement et enregistrez toutes les images suspectes d’acariens Demodex en appuyant sur la pédale. Activez le retour audio de la pédale pour vérifier la réussite de l’acquisition de l’image. Si aucune structure de paupière n’est affichée et que seules des couches limites hautement réfléchissantes sont visibles dans l’image en direct de la caméra laser à balayage, cela peut indiquer que le contact entre le capuchon en PMMA et le bord de la paupière du patient est interrompu. Pour résoudre ce problème, réalignez la caméra jusqu’à ce que le capuchon en PMMA touche correctement le bord de la paupière du patient.
11. Si l’image en direct apparaît floue, déformée ou n’affiche pas la structure du follicule pileux, ces problèmes peuvent indiquer que le patient bouge la tête ou cligne des yeux. Rappelez au patient de se concentrer sur la lumière de fixation pour minimiser les mouvements. Si possible, ajustez la luminosité, le plan focal et la position de numérisation pour améliorer la qualité de l’image.
12. Si la caméra laser à balayage doit être ajustée ou si le patient ressent de la fatigue ou des douleurs, demandez au patient de s’asseoir, de déplacer la caméra laser à balayage vers l’arrière et de réajuster la caméra. Si le patient continue de ressentir de l’inconfort pendant l’examen et ne montre aucun signe de soulagement des symptômes après le repos, interrompez et reprogrammez la procédure pour assurer la sécurité du patient.
13. Si un patient est examiné plusieurs fois au cours de la journée, stockez toutes les images dans le même onglet d’examen de la fenêtre de visualisation des images.
14. Examinez l’œil gauche, déplacez la caméra vers la droite du point de vue de l’opérateur et attendez que le système d’exploitation soit automatiquement sélectionné. Retirez le capuchon en PMMA de l’appareil, installez un nouveau capuchon en PMMA sur l’objectif du microscope de l’appareil et répétez les étapes précédentes.

Figure 3 : Positionnement du patient. (A,B) Le patient est positionné. (C) Le capuchon est ajusté pour toucher la paupière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Après l’examen

1. Quitter l’examen ; Assurez-vous que les images des follicules des cils sont stockées et que les images acquises sont affichées dans la fenêtre de visualisation des images. Si ce n’est pas le cas, il se peut que l’acquisition de l’image ait échoué ou que les données n’aient pas été enregistrées. Tout d’abord, éliminez les dysfonctionnements potentiels de l’équipement, tels que les problèmes de connexion au logiciel ou les pannes de pédale. Après le dépannage, expliquez la situation au patient et répétez l’examen.
2. Demandez au patient de ne pas se frotter les yeux après l’examen jusqu’à ce que l’effet de l’anesthésie locale ait diminué.
3. Retirez le capuchon en PMMA de l’appareil.
4. Nettoyez l’objectif du microscope avec des lingettes de nettoyage d’objectif.
5. Sélectionnez Trier par temps d’acquisition (rapide) dans la boîte de dialogue Options et observez les images acquises des follicules des cils affichées dans l’ordre du côté temporal au nez (Fichier supplémentaire 1 : Figure supplémentaire S5) -- l’ordre de balayage de la racine du cil le long du bord de la paupière. Examinez toutes les images, sélectionnez les images de haute qualité pour l’analyse (Figure 4) et supprimez les images de faible qualité. Demandez à un observateur d’évaluer les images pour détecter la présence d’acariens et d’enregistrer le nombre total de follicules de cils avec des acariens Demodex pour chaque œil.
   REMARQUE : Les images de haute qualité montrent une morphologie claire des acariens, et la partie imagée de l’acarien doit être aussi grande que possible, idéalement supérieure à 100 μm. Si des images de haute qualité ne sont pas disponibles, une évaluation indépendante par un deuxième observateur est requise. Si les résultats des deux observateurs sont incohérents, un troisième observateur doit rendre une décision pour résoudre l’écart et établir le résultat final à inclure dans le rapport.
6. Créez des rapports en plaçant l’image de haute qualité du côté temporel vers le côté nasal dans la visionneuse du rapport. À partir des modèles de rapport et des modèles de comptage des acariens (voir le fichier supplémentaire 2), choisissez un modèle de rapport approprié pour décrire les résultats en fonction des résultats de l’examen.

Figure 4 : Demodex à l’intérieur du follicule des cils. (Images : 400 μm x 400 μm). (A)Trois acariens Demodex sont observés dans le follicule (flèche jaune) et un seul cil est marqué (flèche blanche). (B) Cinq acariens Demodex sont observés dans le follicule (flèche jaune) et un seul cil est marqué (flèche blanche). Comme les acariens peuvent migrer à différentes profondeurs, l’imagerie à un seul plan focal peut capturer des parties fragmentées d’acariens individuels, entraînant ainsi une représentation morphologique incomplète. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Éteignez l’appareil après le travail tous les jours

1. Après avoir fermé toutes les boîtes de dialogue et fenêtres, fermez le logiciel.
2. Mettez l’ordinateur hors tension.
3. Éteignez l’appareil en basculant l’interrupteur à bascule à l’arrière de l’appareil de I à O. Pour optimiser les performances du système et la sécurité des données, arrêtez d’abord le logiciel, puis éteignez l’appareil.
   REMARQUE : L’appareil ne doit pas être maintenu allumé en continu trop longtemps, en particulier pendant plus d’une journée complète.
4. Entretenez régulièrement l’onduleur (UPS) connecté à l’équipement et assurez-vous de son bon fonctionnement pour éviter la perte de données ou le dysfonctionnement de l’appareil causé par des pannes de courant soudaines.
5. Effectuez des sauvegardes régulières, par exemple en utilisant le stockage NAS (Network-Attached Storage).

Résultats

Conformément à la POS décrite ci-dessus, nous avons examiné des patients suspectés d’être infestés par Demodex en 2024. De plus, nous avons comparé les données de 2023 lorsque cette POS n’avait pas été appliquée. Comme le montre la figure 5, le nombre de patients ayant subi l’IVCM pour la détection de Demodex en 2024 est nettement plus élevé que l’année précédente. Cette POS permet l’examen de patients d’âges différents, de 4 ans à 92 ans.

Discussion

L’ectoparasite Demodex est l’un des parasites les plus courants chez l’homme. Ces acariens vivent dans les follicules des cils, les glandes de Meibomius (MG) et les glandes sébacées et sont transparents, de forme allongée et mesurent 0,15 à 0,4 mm de longueur¹⁷. L’IVCM réalisée à l’aide de l’appareil fournit des images en temps réel de 400 μm x 400 μm avec une résolution latérale de 1 μm/pixel et un grossissement de 800x. Grâce à l’IVCM, des images détail...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Gel ophtalmique à base de carbomères, Vidisic	; Bausch and Lomb, Berlin, Allemagne	8187195
Logiciel Heidelberg Eye Explorer	; Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Allemagne	Édition 1.3.3.0
Tomographe de la rétine Heidelberg III	; Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Allemagne	Réf. HRT3-08398
Chlorhydrate de proparacaïne	Alcon Laboratories, Fort Worth, Texas, États-Unis	8387271
TomoCap	; Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Allemagne	18829	Capuchon en PMMA