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Synthèse de l’acétate de 13-C-2-rétinyle et préparation de dose pour des essais de dilution d’isotopes de rétinol

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DOI :

10.3791/68535

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22 août 2025

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

Dans cet article

Résumé

L’acétate de rétinyle est généralement marqué avec deux 13C lorsque la spectrométrie de masse du rapport gazeux-combustion-isotope est utilisée pour l’analyse du sérum et du lait maternel. Cet article décrit la synthèse de l’acétate de 13-C-2-rétinyle et la préparation de doses pour les tests de dilution isotopique du rétinol à administrer par une pipette à déplacement positif ou une seringue à tuberculine.

Résumé

Le test de dilution isotopique du rétinol (RID) est la méthode la plus sensible pour évaluer le statut en vitamine A en estimant les réserves hépatiques totales, considérée comme la norme de référence. Pour la détection par spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse-combustion-rapport isotopique, 13°C sont ajoutés à l’entité rétinol. La procédure de synthèse de l’acétate de 13-rétinyle commence par la β-ionone naturelle. En bref, la cétone C18-tétraène est synthétisée à partir de β-ionone et purifiée. Si l’on souhaite un acétate de 13-C-4-rétinyle, le carbanion du triéthylphosphonoacétate marqué au 13-C2 peut être utilisé pour ajouter deux 13C à la fraction β-ionone avant d’ajouter les trois carbones de l’acétone pour synthétiser la cétone en C18-tétraène. Si l’on souhaite un acétate de 3-rétinyle 13C, les trois carbones de l’acétone pourraient être marqués avec du 13C.

Pour l’acétate de 2-rétinyle 13-Cle plus couramment utilisé pour une analyse future par spectrométrie de masse du rapport isotopique de chromatographie en phase gazeuse-combustion, une procédure Wittig-Horner modifiée est utilisée, et la cétone de tétraène C18 non marquée réagit avec le carbanion du triéthylphosphonoacétate marqué en 13C2 pour ajouter deux-13 C aux positions 14 et 15 de la molécule de rétinol. L’ester éthylique résultant est réduit en alcool et estérifié en 13C 2-acétate derétinyle avec de l’anhydride acétique. L’isomère tout-trans est purifié sur de l’alumine désactivée à 8 % dans l’eau à l’aide de solvants relativement inoffensifs et très volatils - hexanes et éther diéthylique - qui sont éliminés par évaporation rotative et sonification des doses d’huile. Le produit est caractérisé par la spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis), la chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) par rapport aux normes analytiques. La dose concentrée est stockée dissoute dans l’huile de soja à -80 °C. Les doses finales sont diluées dans de l’huile de soja (~200 μL/dose) et quantifiées par spectroscopie UV-Vis contre l’huile de soja véhicule. Les doses sont mesurées pour l’administration à l’homme à l’aide d’une pipette à déplacement positif ou de seringues à la tuberculine pour le test RID. À l’aide d’hypothèses appropriées, les réserves totales du corps sont calculées et les réserves totales de foie sont estimées.

Introduction

La dilution isotopique du rétinol (RID) est le seul biomarqueur du statut en vitamine A qui mesure quantitativement les réserves totales de vitamine A de l’organisme et, avec des hypothèses appropriées, peut estimer les réserves hépatiques totales (TLR). C’est le moyen le plus sensible de mesurer le statut en vitamine A et l’impact des interventions contenant du rétinol préformé ou des caroténoïdes de provitamine A. Bien qu’il soit techniquement difficile, le RID est précis et peu invasif car il ne nécessite que des échantillons de sang par opposition aux biopsies du foie1. Le test RID implique l’administration d’acétate de rétinyle deutéré ou marqué au 13C, selon la plate-forme de spectromètre de masse. Avant l’administration de la dose, un échantillon de sang de base est prélevé, ce qui est essentiel lors de l’utilisation de 13marqueurs C, mais peut être effectué sur un sous-groupe sélectionné au hasard. Un deuxième échantillon est prélevé après que l’acétate de rétinyle marqué 13C a été mélangé avec du TBS1.

Les interventions en vitamine A pour prévenir les carences comprennent l’enrichissement des aliments, la biofortification, la diversification alimentaire et la supplémentation. Cependant, dans certains pays, il y a eu des interventions qui se chevauchent ciblant les mêmes personnes, ce qui a conduit à l’hypervitaminose A2, ce qui a nécessité un cadre de suivi pour évaluer les résultats du programme. En tant que tel, des méthodes qui mesurent quantitativement le statut en vitamine A sont nécessaires. En collaboration avec les États membres, l’Agence internationale de l’énergie atomique (AIEA) promeut l’utilisation pacifique des isotopes dans la recherche et les évaluations, ce qui soutient l’application de l’essai RID. Le test RID prend de l’ampleur et pourrait bientôt être utilisé dans de grandes enquêtes auprès de la population pour évaluer le statut en vitamine A, de la carence à l’excès dans les pays mettant en œuvre des interventions de vitamine A3.

Auparavant, l’acétate de 4-rétinyle 10,11,14,15-13 C a été synthétisé à l’aide de modifications de Bergen et al. pour l’acétate de rétinyle deutéré 4,5. Ce composé a été utilisé dans des expériences chez le rat6 et chez l’homme avec la chromatographie en phase gazeuse-combustion-spectrométrie de masse du rapport isotopique (GCCIRMS) adaptée à l’analyse7. À partir de ces précieuses expériences, nous avons déterminé que le GCCIRMS était si sensible que quatre 13C n’étaient pas nécessaires pour le test RID utilisant le GCCIRMS. Par conséquent, la dépense du traceur est réduite en utilisant seulement deux 13C dans les positions 14 et 15 de la molécule de rétinol (Figure 1). Cette modification diminue les coûts associés à la synthèse et conduit à une augmentation des rendements grâce à la voie de synthèse. Ici, un protocole à grande échelle pour sa synthèse est décrit.

Le GCCIRMS est plus sensible que les autres types de spectrométrie de masse pour la mesure des isotopes stables8 et peut réagir aux changements de régime alimentaire et aux changements naturels d’enrichissement en carbone 13du rétinol sérique. Cela a été décrit chez les gerbilles9 et les humains10consommant du maïs, et chez les humains inscrits à une intervention sur les légumes11. En effet, l’abondance naturelle du 13C varie d’une population à l’autre et doit être déterminée chez les sujets inscrits aux évaluations du RID12. Cependant, de petits sous-groupes ont été utilisés pour la mesure de l’enrichissement naturel avec le RID chez les enfants ghanéens et thaïlandais13,14 et les femmes thaïlandaises15. L’enrichissement individuel en carbone 13de référence doit être déterminé pour la détermination la plus précise possible du TBS au niveau individuel12.

Protocole

REMARQUE : Lors du recrutement de sujets humains pour des recherches, des interventions ou des études évaluatives, l’approbation du comité d’examen institutionnel (IRB) doit être recherchée avec des procédures de consentement éclairé appropriées.

1. Synthèse de l’acétate de 13-C-2-rétinyle (Figure 2)

REMARQUE : Toutes les procédures de synthèse et de quantification sont effectuées sous un éclairage fluorescent doré pour prévenir la dégradation et l’isomérisation du composé.

  1. Synthétisez de l’acétate de β-ionyle en un grand lot à partir de β-ionone disponible dans le commerce. Par exemple, couvrez l’hydrure de sodium (NaH) (4 g, 0,16 mole) avec 100 ml d’éther. Ajouter du triéthylphosphonoacétate non marqué (36 g, 0,16 mole) dans 100 mL d’éther goutte à goutte et agiter pendant 2 h.H2 est libéré et la suspension initiale devient claire et ambrée.
    ATTENTION : L’hydrure de sodium (NaH) est un agent réducteur puissant qui est utile dans un large éventail de réactions chimiques. Cependant, des incendies de laboratoire peuvent se produire en raison de sa réaction hautement exothermique avec l’eau dans l’atmosphère16,17. Il est recommandé d’accéder à une fiche de données de sécurité ; des directives supplémentaires pour la manipulation de solides modérément pyrophoriques tels que le NaH ont été publiées18. Maintenez-le en suspension dans de l’huile ou un solvant non réactif lors de la manipulation, du rinçage des récipients de réaction et des récipients de stockage avec un gaz inerte (tel que l’azote ou l’argon), du refroidissement de la cuve de réaction et du stockage dans des récipients scellés conservés dans un environnement sec. Dans notre laboratoire, le NaH est transféré en petites quantités (~1 g) dans un environnement azoté dans des flacons, puis stocké dans un dessiccateur scellé jusqu’à son utilisation.
  2. Ajouter de l’β-ionone (21 g, 0,12 mole) dans 40 mL d’éther et réagir pendant la nuit (~15 h à 20 °C). Le jour 2, éteignez la réaction avec de l’eau et extraylisez l’acétate d’éthyl-β-ionylidène en hexanes et lavez-le à plusieurs reprises avec de l’eau dans une série d’entonnoirs séparateurs pour maximiser la récupération. Sécher la couche organique (MgSO4 anhydre), filtrer et concentrer
    REMARQUE : La chromatographie sur couche mince (CCM) ne détecte généralement que des impuretés mineures à ce stade de la synthèse. Celui-ci peut être stocké pendant une période prolongée à -80 °C avant de passer aux étapes suivantes.
  3. Faire réagir l’acétate d’éthyle-β-ionylidène (28 g, 0,11 mole) avec 120 mL d’hydrure d’aluminium et de lithium 1 molaire (LiAlH4) dans de l’éther diéthylique. Immergez le récipient de réaction dans un bain d’acétone de glace sèche et remuez continuellement la solution pour obtenir de l’éthanol β-ionylidène.
    ATTENTION : L’hydrure de lithium et d’aluminium (LiAlH4) est un agent réducteur puissant. Accédez à une fiche de données de sécurité et reportez-vous à des directives supplémentaires pour la manipulation de solides modérément pyrophoriques tels que LiAlH418,19. L’objectif principal de la plupart des précautions de sécurité est de minimiser le risque d’exposition du LiAlH4 à l’atmosphère et de prévenir les réactions d’emballement. Cela implique généralement de maintenir ces composés en suspension dans de l’huile ou un solvant non réactif lors de la manipulation, de rincer les récipients de réaction et les récipients de stockage avec un gaz inerte (tel que l’azote ou l’argon), de refroidir le récipient de réaction et de stocker le LiAlH4 dans des récipients scellés conservés dans un environnement sec. Dans notre laboratoire, l’hydrure d’aluminium et de lithium est acheté dans des flacons scellés de 1 molaire au lieu de la forme en poudre, les volumes requis étant retirés à l’aide d’une seringue et l’atmosphère de la bouteille remplacée par de l’azote.
  4. Dissoudre 28 g (0,12 mole) d’éthanol β-ionylidène dans 300 mL d’hexanes. Ajouter environ 50 g par jour de MnO2 à 90 % pendant 3 jours (51 g, 52 g et 54 g) et remuer le mélange réactionnel pendant plus de temps (souvent 2 jours à 20 °C). Enfin, ajoutez 35 g de MnO2 et laissez reposer une nuit pendant environ 15 h ; La réaction est complète à environ 90 %. Filtrez et lavez le β-ionylidène acétaldéhyde du MnO2 avec du dichlorométhane.
  5. Dissoudre l’acétaldéhyde brut de β-ionylidène (22 g, 0,10 mole) dans 150 mL d’acétone en agitant constamment, et ajouter 10 mL d’hydroxyde de sodium 1 N goutte à goutte. Laissez la réaction pendant 6 h.
  6. Extrayez la cétone tétraène C18 avec des hexanes et lavez-la à plusieurs reprises à l’eau à l’aide d’une série d’entonnoirs séparateurs pour maximiser la récupération. Séchez la solution résultante à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir de la cétone brute cis-trans C18 tétraène. Parce que l’isomère trans est le plus souhaitable pour les études humaines, purifier le mélange sur du gel de silice désactivé à 4 % d’eau (300 g) en utilisant un gradient lent de 0 à 10 % d’acétate d’éthyle dans l’hexane.
  7. Mélanger le NaH (1,2 g, 0,05 mole) avec 50 ml d’éther. Ajouter 13Cde 2-triéthylphosphonoacétate (11 g, 0,049 mole) dissous dans 50 mL d’éther goutte à goutte et agiter pendant 2 h. Dissoudre le tétraène cétone en C18 (12 g, 0,044 mole) dans 50 mL d’éther et réagir pendant une nuit pendant environ 15 h à 20 °C.
  8. Tremper la réaction avec de l’eau et extraire l’ester éthylique de l’acide 14,15-13 C 2-rétinoïque avec des hexanes et laver à l’eau dans un entonnoir séparateur. Sécher la couche organique avec du MgSO4 anhydre et du concentré ; Purifier avec de l’alumine neutre désactivée à 8 % d’eau (400 g) avec un gradient lent de 0 à 3 % d’éther diéthylique dans un gradient d’hexane pour obtenir des isomères cis/trans.
    REMARQUE : Souvent, la première purification contient des contaminants, comme le juge par TLC. Les contaminants sont visualisés en faisant réagir la plaque CCM avec de la vapeur d’iode. Lorsque des contaminants sont présents, il est crucial de repurifier sur 400 g d’alumine neutre désactivée à 8 % d’eau avec 100 % d’hexanes pour obtenir un ester éthylique pur de 14,15-13 C 2-rétinoïque.
  9. Réduire l’ester éthylique de l’acide 2-rétinoïque 14,15-13 (3,7 g) avec 15 ml d’hydrure d’aluminium et de lithium 1 molaire dans un bain d’acétone de glace sèche tout en agitant pour obtenir du2-rétinol 14,15-13 C (figure 1).
  10. Dissoudre 14,15-13 C 2-rétinol (3,5 g) dans 20 mL de triéthylamine. Tout en remuant la solution, mélanger 3,5 mL d’anhydride acétique avec 7 mL de triéthylamine et l’ajouter goutte à goutte dans la fiole. Laisser le ballon passer la nuit au réfrigérateur pour la formation de l’acétate de 2-rétinyle 14,15-13 C (environ 15 h).
  11. Extraire 3,9 g d’acétate brut de 2-rétinyle 14,15-13 C en hexanes, sécher, concentrer et purifier sur 500 g d’alumine neutre activée à 8 % d’eau avec un éther diéthylique lent de 0 à 3 % dans un gradient d’hexane. Surveillez les fractions à l’aide d’un spectrophotomètre ultraviolet visible (UV-Vis) à 325 nm. Retirez tous les solvants restants à l’aide d’un roto-évaporateur. Évaluez le produit final à l’aide de la détection HPLC et des photodiodes pour déterminer le rapport cis/trans. Un exemple de système de gradient avancé permettant de séparer le profil cis/trans à l’aide de la chromatographie liquide à ultra-pression est disponible dans la figure supplémentaire S1.
    REMARQUE : Le rapport cis/trans est généralement de >95 % de tout trans à ce stade.
  12. Pour le stockage, dissoudre l’acétate de2-rétinyle 14,15-13 C dans de l’huile de soja de qualité alimentaire sans aucun autre additif et le conserver dans du verre ambré rincé à l’azote à -80 °C et étiqueter comme stock concentré.

2. Préparation de doses de solutions huileuses d’acétate de rétinyle marqué à des isotopes stables

REMARQUE : L’acétate de rétinyle marqué isotopiquement a été administré dans des capsules20 ou dans des solutions d’huile administrées à l’aide d’une pipette à déplacement positif de 250 μL21 ou d’une seringue médicale22 (figure 3). Nous avons testé la stabilité des gélules (Figure 4), décrite ci-dessous.

  1. Directement après la synthèse, dissoudre l’acétate de rétinyle étiqueté dans ~15 mL d’huile végétale non enrichie (par exemple, de l’huile de soja de qualité alimentaire) avant qu’il ne commence à cristalliser et le conserver dans un flacon ambré de 24 mL à -30 à -80 °C jusqu’au moment de préparer les doses finales.
    1. Si l’acétate de rétinyle étiqueté a été acheté, cassez soigneusement le haut de l’ampoule scellée sous vide en entaillant avec une lime ou brisez le sceau d’une bouteille à vis. Selon la masse nécessaire, mettez une quantité pesée dans une bouteille ambrée brune de 24 ml et ajoutez une petite quantité d’huile végétale (10 ml seront probablement suffisants). Sonicez le mélange jusqu’à ce qu’il devienne une solution claire.
  2. Estimez la quantité d’huile finale nécessaire en multipliant le nombre de sujets par 200 μL. Par exemple, si 60 sujets doivent être recrutés, préparez environ 70 doses pour en avoir assez pour le gaspillage (environ 10 à 20 %). Ainsi, 70 × 200 μL équivaut à 14 mL.
    REMARQUE : Ne vous fiez pas à la masse de l’huile synthétique ou des cristaux. Vous devez utiliser un spectrophotomètre pour quantifier les doses. Toute la vitamine A synthétique contient des solvants résiduels. Ceux-ci peuvent être dissipés par sonification ou sous un léger courant d’azote, mais sont la principale raison pour laquelle la masse seule ne peut pas être utilisée pour déterminer les doses isotopiques.
    Si les solutions d’acétate de rétinyle étiquetées sont conservées très longtemps au congélateur sans être utilisées, elles doivent être réanalysées pour déterminer s’il y a eu dégradation importante.
  3. Pour quantifier l’acétate de rétinyle :
    1. Allumez le spectrophotomètre UV-Vis (spectrophotomètre à double faisceau à balayage de préférence) et l’ordinateur connecté, le cas échéant. Démarrez le spectrophotomètre UV-Vis en suivant les instructions du fabricant. Laissez le spectrophotomètre se réchauffer pendant au moins 30 minutes avant de lire la lecture.
    2. Installez deux fioles jaugées de 25 mL et des bouchons et remplissez chacune d’elles avec 25 mL d’hexanes presque jusqu’à la ligne. Étiqueter une fiole « Huile » ou « Blanc » et l’autre « Vitamine A » ou « Dose » ; ensuite, mettez de côté la fiole de vitamine A jusqu’à ce que les blancs soient passés.
    3. Versez un peu d’huile de soja pure dans un gobelet en plastique jetable et ajoutez 20 à 40 μL dans le flacon d’huile pour vider le système.
      REMARQUE : Nous utilisons souvent 20 μL, mais tant que le volume de dose à blanc et isotopique est le même, on peut en utiliser plus.
    4. Retournez 4-5x pour mélanger l’huile et les hexanes, puis rincez les deux cuvettes de quartz du spectrophotomètre avec cette solution, et remplissez les deux ~75 %.
    5. Insérez les deux cuvettes dans le spectrophotomètre, en faisant attention de ne pas toucher l’avant et l’arrière transparents (poignée par les côtés givrés uniquement). Pour une meilleure précision, orientez la face numérotée de chaque cuvette assortie vers l’utilisateur.
    6. Fermez la porte bloquant la lumière au-dessus des échantillons.
    7. Cliquez sur la fonction Vide ou Ligne de base et laissez le système mesurer l’absorbance de base de l’huile et des hexanes. Cela corrige l’absorption de la solution d’hexanes Oil Blank. Balayage de 260 à 400 nm ; Confirmez que la lecture est « zéro » à 400 nm une fois ce processus terminé. Si ce n’est pas le cas, appuyez sur le bouton zéro et relancez l’analyse. Une fois terminé, le système est prêt à mesurer l’absorbance de la dose d’acétate de rétinyle.
    8. Jetez le contenu de la cuvette d’échantillon et remplissez-la avec la solution Dose d’hexanes. Placez l’échantillon à l’endroit approprié et balayez les spectres. Sélectionnez le pic et lisez l’absorbance. L’acétate de rétinyle pur n’a qu’un seul lambda maximum à 325 nm.
      REMARQUE : Si vous avez plus d’un pic ou si vous en avez un à 280 nm, l’acétate de rétinyle s’est dégradé et ne doit pas être utilisé pour le dosage.
  4. Calculs pour l’étape 2.3
    REMARQUE : Le E 1 %, 1 cm pour le rétinol est de 1 810 à 325 nm dans les hexanes. Vous allez quantifier l’acétate de rétinyle en équivalents de rétinol.
    1. Divisez l’absorbance par 0,181 pour obtenir le μg/mL de solution.
    2. Multipliez par 25 mL pour obtenir le μg dans 20 microlitres de solution d’huile.
      REMARQUE : Exemple : L’absorbance de 20 μL d’huile dans 25 mL d’hexanes est de 0,295.
      0,295/0,181 = 1,630 μg/mL × 25 mL = 40,75 μg dans 20 μL d’huile
      Si vous avez besoin de 286 μg pour la dose, cela fait 140,4 μL. Il s’agit de 1 μmole, mais 288 μg de 13C 2-rétinol seront fabriqués dans l’intestin à cause de l’étiquette. Vous voudrez peut-être faire une dilution pour vous rapprocher de la dose de 200 μL et refaire la quantification ci-dessus.
  5. Préparation des gélules pour tester la stabilité
    1. Séparez les capsules dans les plus grands bulbes blancs et les petits bouchons bleus.
    2. Placez le fond des capsules blanches dans des boîtes à pointes de pipette (96 capsules par boîte) et fermez-les pour empêcher la poussière de pénétrer dans les capsules et mettez les capsules bleues dans un sac en plastique à fermeture éclair pendant la nuit. Jetez les capsules fissurées.
    3. Laissez la solution d’huile d’acétate de rétinyle revenir à température ambiante. Versez une petite quantité (~5 ml) dans un petit gobelet en plastique inutilisé.
    4. Préparez une pipette à répétition en chargeant la seringue de 5 ml (où 1 = 100 μL) et en la réglant sur « 2 » pour distribuer 200 μL par pression sur la gâchette.
    5. Chargez l’huile d’acétate de rétinyle dans la pipette à répétition en tirant le bras de chargement. Versez au moins 4 aliquotes de 200 μL dans la tasse pour éliminer les bulles d’air de la pointe.
    6. Distribuez 1 x 200 μL d’aliquote par fond de capsule blanche en touchant légèrement l’extrémité de la pipette à la paroi intérieure de la capsule et en appuyant sur la gâchette.
    7. Une fois que la pipette à répétition est presque vide, prélevez plus d’huile.
    8. Après avoir terminé un ensemble complet de 96 capsules, versez l’huile dans la tasse, puis commencez à glisser légèrement les bouchons bleus sur chaque fond blanc, en faisant attention de ne pas casser les bouchons.
    9. Une fois que tous les bouchons sont sur les capsules, soulevez chaque capsule, assurez-vous légèrement que le capuchon est bien en place, puis replacez-le dans la boîte à embouts.
    10. Conservez les gélules à la température et dans les conditions choisies. L’obscurité peut être obtenue en stockant les capsules dans des racks sous du papier d’aluminium. En voici des exemples :
      un.  au congélateur : -20 °C dans l’obscurité
      b.  au réfrigérateur : 4 °C dans l’obscurité
      c. sur le banc : 20 °C (température ambiante) dans l’obscurité
      d. sur le banc mais laissé à l’extérieur : 20 °C (température ambiante) exposé à un éclairage fluorescent standard
      e.  dans un four, reproduisant des températures ambiantes plus élevées dans d’autres endroits : 37 °C dans l’obscurité

3. Administration de la dose

REMARQUE : La pipette à déplacement positif a été comparée directement à des seringues à tuberculine afin de déterminer l’exactitude et la précision chez les techniciens (Figure 5).

Les doses sont administrées à l’aide de pipettes à déplacement positif Rainin de 250 μL ou de seringues à tuberculine de 1 mL.

  1. Décongelez les doses congelées ou placez-les dans une glacière avec des blocs réfrigérants si vous vous rendez sur le terrain. Pendant le transport, les doses dégèlent généralement.
  2. Retirez le flacon en verre ambré de la glacière et ouvrez-le. Conservez le flacon dans une « tasse » ou un bécher pour éviter qu’il ne se renverse.
  3. Insérez l’embout de la pipette ou la seringue à tuberculine dans l’huile et prélevez une petite quantité. Appuyez rapidement sur le piston pour déplacer les bulles qui auraient pu se former. Aspirez lentement la quantité de volume nécessaire dans la pipette ou la seringue. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles.
  4. Essuyez l’extérieur de l’embout avec un mouchoir en papier. Ne touchez pas l’extrémité de l’embout de la pipette ou de la seringue car cela entraînerait l’extraction du liquide.
  5. Mettez l’embout dans la bouche du participant, libérez l’huile dans sa bouche et demandez à la personne de fermer la bouche et d’avaler.
    REMARQUE : Il est utile que les participants puissent incliner légèrement la tête en arrière pour le dosage.
  6. Après la dose, administrez un « chasseur » ou une collation grasse apportant au moins 10 g de matières grasses. Pour les jeunes enfants, administrer 1 mL d’huile non enrichie délivrée sur une cuillère en plastique en guise de chasseur. Pour les enfants plus âgés et les adultes, un demi-sandwich au beurre de cacahuète, une pomme de terre blanche frite ou une baguette avec de la pâte à tartiner au chocolat sont de bonnes collations de suivi.
    REMARQUE : Des recherches informatives doivent être menées pour déterminer quelle collation est acceptable localement.

Résultats

À partir de la β-ionone disponible dans le commerce, 28 g d’acétate d’éthyle-β-ionylidène ont été synthétisés. Après réduction, 22 g d’acétaldéhyde β-ionylidène ont réagi avec de l’acétone dans des conditions basiques pour produire une cétone en C18-tétraène ; 12 g de C18-tétraène cétone purifié ont été obtenus, soit ~90 % de tout-trans. Celle-ci a ensuite été mise en réaction avec le carbanion du 13-C2-triéthylphosphonoacétate en utilisant une procédure de Wittig-Horner modifiée pour ajouter deux 13C aux positions 14 et 15 de la molécule de rétinol. L’ester éthylique résultant (rendement de 3,7 g) a été réduit en alcool et estérifié en 13C 2-acétate de rétinyle avec de l’anhydride acétique dissous dans de la triéthylamine. La vitamine synthétique a été purifiée sur de l’alumine désactivée à 8 % d’eau à l’aide de solvants organiques hautement volatils, l’hexanes et l’éther diéthylique. La préparation résultante a été caractérisée à l’aide de la spectroscopie UV-Vis, de la CCM et de la HPLC. Pour un stockage à long terme, l’acétate de rétinyle étiqueté est stocké dissous dans de l’huile de soja à -80 °C.

Le schéma synthétique réussi pour l’acétate de 2-rétinyle 14,15-13 C décrit ci-dessus est illustré à la figure 2. Le parcours total commençant par β-ionone est composé de sept étapes. Le premier rendement était de 0,9 g d’acétate de 2-rétinyle tout-trans 14,15-13-C. Des fractions d’isomères cis/trans (1,2 g) ont été combinées et repurifiées sur 300 g d’alumine neutre désactivée à 8 % d’eau pour obtenir 0,3 g supplémentaire d’acétate de2-rétinyle 14,15-13 C tout trans.

Pour déterminer la stabilité de l’acétate de rétinyle dans les gélules, l’acétate de rétinyle (1 g) a été dissous dans des hexanes et purifié par chromatographie en colonne ouverte à l’aide de 300 g d’alumine désactivée à 8 % d’eau avec des hexanes comme solvant. L’acétate de rétinyle a été surveillé par CCM et spectroscopie UV-Vis, et seules les fractions pures ont été utilisées. Ce procédé est identique à celui utilisé dans la synthèse et la purification de l’acétate de 13C 2-rétinyle dans le laboratoire de Tanumihardjo pour le test RID, comme décrit ci-dessus. L’acétate de rétinyle purifié a été dissous dans de l’huile de soja, le solvant organique a été éliminé par un évaporateur rotatif et une dose supplémentaire d’huile a été ajoutée jusqu’à une concentration finale de 7,5 μM (pour obtenir 1,5 μmole par 200 μL, soit le point médian entre la dose pour un adulte et un enfant pour l’essai RID lorsque le GCCIRMS est utilisé pour l’analyse). La concentration a été déterminée par spectroscopie UV-Vis comme décrit ci-dessus.

Une aliquote de 200 μL de l’huile a été distribuée dans des capsules de cellulose de taille 3 (volume maximal de 300 μL) pour l’étude de stabilité. Les gélules de chaque dose ont été stockées dans cinq conditions. L’obscurité a été obtenue en stockant les capsules dans des racks sous du papier d’aluminium. Des capsules (150) ont été préparées pour chaque condition, pour un total de 750 capsules : i) au congélateur : -20 °C dans l’obscurité ; ii) au réfrigérateur : 4 °C dans l’obscurité ; iii) sur le banc : 20 °C (température ambiante) dans l’obscurité ; iv) sur le banc mais laissé à l’extérieur : 20 °C (température ambiante) exposé à un éclairage fluorescent standard ; v) dans un four, reproduisant des températures ambiantes plus élevées dans d’autres endroits : 37 °C dans l’obscurité.

Dans l’étude de stabilité des capsules, trois capsules de chaque condition ont été mesurées à chaque point temporel (-20 °C, 4 °C, température ambiante sombre, température ambiante claire, 37 °C). Toutes les capsules ont été laissées à température ambiante (les capsules à température ambiante ont été analysées en premier) ; La variation de température provoque une variation de l’absorbance. Les gélules ont été mesurées à 480 jours. Les gélules sont restées stables pendant neuf mois à -20 °C et 4 °C (figure 4).

Une comparaison des méthodes a été effectuée pour comparer les seringues à tuberculine à usage unique aux pipettes à déplacement positif Rainin comme étalon de référence. La pipette à déplacement positif Rainin a été calibrée avec de l’eau, en tenant compte de la température et de la pression locales, puis testée avec trois pointes en trois exemplaires pour déterminer le volume d’huile cible distribué à la position de 200 μL sur un bateau de pesée taré. Le protocole de distribution a été mené par 10 techniciens de différents niveaux d’expérience. Pour chaque technicien, huit seringues ont été testées en trois exemplaires et comparées à la référence de la pipette. Les côtés de la pipette ont été essuyés avec un mouchoir en papier et l’huile a été distribuée dans le bateau de pesée en biais, ce qui a permis de libérer un maximum d’huile. Les techniciens n’ont pas été informés des résultats de la masse distribuée tout au long du protocole. La masse d’huile a été enregistrée par un technicien distinct. Le processus a été répété avec 200 μL d’huile de soja à l’aide de huit seringues à la tuberculine (p. ex., Norm-Ject).

Un logiciel statistique R a été utilisé pour ajuster un modèle de composantes de variance (FitVCA)22 (figure 5). Les facteurs de variabilité mesurés comprenaient le technicien, la seringue dans le technicien et l’erreur de réplication. La valeur moyenne normalisée (IC à 95 %) de l’administration de la seringue par rapport au volume d’administration de la pipette était de 0,996 (0,912, 1,08). La variance due à l’erreur de répétition représentait 64,8 % de la variance totale, ce qui indique que la plus grande source de variabilité provenait de mesures répétées dans la même seringue. Le pourcentage de variance entre le technicien et la seringue au sein du technicien était beaucoup plus faible, contribuant respectivement à 22,9 % et 12,3 %.

L’analyse des sous-groupes a été effectuée en divisant les techniciens en deux groupes (n = 5/groupe) en fonction de l’expérience. L’administration moyenne normalisée de la seringue était similaire dans les deux groupes, mais l’IC à 95 % était plus étroit pour les techniciens plus expérimentés ; 1,001 (0,939, 1,063) et 0,998 (0,900, 1,100), respectivement. Chez les techniciens plus expérimentés, la plupart des écarts provenaient de l’erreur de seringue (57,0 %) et de l’erreur de réplication (42,9 %), tandis que chez les techniciens moins expérimentés, la plupart des écarts provenaient du technicien (32,7 %) et de l’erreur de réplication (67,2 %).

figure-results-1
Figure 1 : La structure du rétinol avec les carbones numérotés. Les 13C sont généralement ajoutés dans les positions 14 et 15 pour une utilisation avec la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse à combustion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Le schéma synthétique de l’acétate de 2-rétinyle 14,15-13C utilisé dans les essais de dilution isotopique du rétinol lorsque la spectrométrie de masse du rapport chrome en phase gazeuse-combustion-isotope est utilisée pour l’analyse du sérum ou du lait maternel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Une seringue à tuberculine de 1 mL sans volume mort à l’extrémité et la pipette à déplacement positif de 250 μL utilisée pour le dosage dans les études de traçage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Courbes de dégradation de l’acétate de rétinyle stocké dans des gélules dans cinq conditions différentes. Les conditions sont -20 °C, 4 °C, 20 °C (température ambiante) dans l’obscurité, 20 °C (température ambiante) sous une lumière fluorescente standard et 37 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Analyse en composantes de variance de la quantité de dose administrée comparant des seringues de tuberculine de 1 mL à une pipette à déplacement positif de 250 μL parmi 10 techniciens aveugles aux résultats lors de l’évaluation. Les valeurs sont la masse d’huile distribuée (200 μL) à partir de seringues normalisées à la pipette à déplacement positif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Exemple de contrôle final de la pureté de l’acétate de 14,15-13C-rétinyle par chromatographie liquide à ultra-pression. Les spectres correspondants sont caractéristiques des formes cis/trans de la vitamine. Les conditions UPLC étaient le solvant A 70:25:5 (acétonitrile :eau :isopropanol) avec 10 mM d’acétate d’ammonium et le solvant B était composé de 75 % d’acétonitrile et de 25 % d’isopropanol. La colonne utilisée était une colonne Acquity UPLC, BEH C18 1,7 μM, 2,1 x 100 mm. La colonne était réglée à 29 °C et le débit était de 0,4 mL/min. Le gradient a commencé avec 100 % de solvant A et a été maintenu pendant 5,0 min, suivi d’une transition à 98 % de solvant B pendant 7 minutes et maintenu pendant 8 minutes avant de revenir à 100 % de solvant A pendant 1 minute et maintenu pendant 4 minutes d’équilibre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Bien qu’il existe des sources commerciales d’acétate de rétinyle deutéré et marqué au 13C, il existe de multiples voies de synthèse pour le rétinol dans la littérature destinée aux chimistes organiques qualifiés. Nous avons choisi une voie synthétique pour l’acétate de rétinyle deutéré à suivre et avons fait les ajustements appropriés pour ajouter 13C à l’épine dorsale du groupe rétinol, qui sont décrits ci-dessus. La synthèse de l’acétate de 14,15-13-C-2-rétinyle a été réalisée à l’aide d’une procédure en sept étapes commençant par la β-ionone disponible dans le commerce. β-ionone est un composant végétal naturel et contribue aux parfums, comme ceux des roses. L’étape la plus cruciale de la voie de synthèse est la formation de la cétone tétraène C18. Ce composé intermédiaire doit être pur à au moins 90 % pour que les étapes suivantes produisent de bons rendements.

Le marquage a été effectué à l’aide d’une procédure Wittig-Homer modifiée avec du 13C 2-triéthylphosphonoacétate disponible dans le commerce. Les composés marqués sont utilisés dans le test RID pour déterminer le TBS et estimer le TLR. La méthode utilise le GCCIRMS pour l’analyse du rétinol purifié à partir du sérum ou du lait maternel d’individus qui ont reçu des doses avec des niveaux physiologiques des composés marqués. Les doses les plus courantes sont de 1 million pour les enfants et de 2 millions pour les adultes. Bien que l’analyse GCCIRMS soit sensible pour l’enrichissement isotopique, l’analyse sérique nécessite un minimum de 400 μL de sérum pour obtenir une masse de rétinol suffisante pour l’introduction dans le GC.

Le test 13C-RID a été utilisé dans des études cliniques23,24 et dans des groupes d’enfants africains25 et il est prévu de le rendre accessible pour le travail dans la population. Nous avons effectué les expériences avec des capsules et des seringues pour déterminer si ces modifications sont adaptées au travail sur la population. Les capsules devaient être en position verticale ou elles fuyaient ; Nous avons rapidement abandonné l’idée qu’ils pouvaient être stockés dans des flacons de pilules ambrées ordinaires pour une utilisation sur le terrain. Les capsules n’étaient stables que pendant ~9 mois à des températures de réfrigérateur et de congélateur. La production de capsules scellées peut améliorer la stabilité en réduisant l’exposition mineure à l’atmosphère pendant le stockage. L’utilisation des capsules doit être testée et validée par des groupes d’utilisateurs avant d’être mise en œuvre.

Les solutions d’huile finales sont stables à température ambiante pendant ~2 mois, mais une fois qu’elles commencent à se dégrader, la dégradation se poursuit rapidement. Il n’y a pas d’activité partielle acceptable pour les essais RID, car la quantité dosée est utilisée dans le calcul de la TBS. Il est préférable de conserver les solutions sur des blocs réfrigérants sur le terrain pendant l’utilisation et de les recongeler dès que possible une fois le dosage terminé. Il est préférable de n’apporter que quelques doses de plus que nécessaire pour la journée et de garder le reste congelé. La congélation et la décongélation n’affectent pas ces solutions car l’huile elle-même contient des antioxydants. Les solutions d’huile sont plus robustes que les échantillons de sang, mais doivent toujours être conservées dans l’obscurité à tout moment et congelées lorsqu’elles ne sont pas utilisées.

Les doses sont administrées à l’aide de pipettes à déplacement positif Rainin de 250 μL ou de seringues à tuberculine de 1 mL. Les pipettes à déplacement d’air ne conviennent pas aux doses dissoutes dans l’huile. Notre laboratoire a comparé expérimentalement ces deux méthodes (voir Résultats représentatifs). L’administration à la pipette ou à la seringue est similaire avec quelques écarts. Les pipettes à déplacement positif Rainin sont recommandées pour la recherche ou les études cliniques, mais les seringues peuvent être utilisées pour le travail en population. Il est recommandé d’utiliser des seringues avec un faible volume mort dans l’embout pour maximiser la précision de la dose (p. ex., Norm-Ject).

Les calculs pour le test RID comprennent la quantité de dose administrée, et l’erreur dans la quantité de dose administrée est proportionnelle à l’erreur dans l’estimation résultante de la TBS. Pour l’utilisation de seringues à tuberculine par rapport aux pipettes à déplacement positif, l’administration moyenne normalisée de la seringue était proche de 1, ce qui indique que les seringues peuvent fournir une dose précise pour les études de population. Les limites de confiance à 95 % étaient d’environ ± 8 % de la dose cible administrée. Les techniciens ayant plus d’expérience préalable avec les seringues avaient un IC à 95 % plus étroit (± 6 %) et une contribution de variance plus faible du technicien par rapport aux techniciens moins expérimentés (± 10 %). Cela suggère qu’un protocole de formation et de validation à l’aide d’huile pour véhicule devrait être effectué avant la mise en œuvre sur le terrain. Ces résultats méritent d’être validés davantage dans chaque laboratoire qui souhaite utiliser des seringues à tuberculine à usage unique comme méthode d’administration rentable et rapide pour administrer les doses dans les tests dose-réponse et RID dans les études basées sur la population.

Nous avons opté pour la pipette à déplacement positif pour la recherche et les études cliniques utilisant le test RID afin de maximiser la précision au niveau individuel, car leur exactitude et leur précision rapportées sont de ≤1 %. En comparaison, l’essai dose-réponse relative modifiée est qualitatif, et aucun calcul n’est basé sur la quantité de dose administrée1. Par conséquent, nous avons recommandé d’utiliser des seringues pour l’essai dans les enquêtes basées sur la population et de dissoudre la dose dans environ 0,7 mL de véhicule.

Le test RID est une méthode sensible pour quantifier la TBS et estimer le TLR, qui est la norme de référence pour évaluer le statut en vitamine A. Il a été utilisé dans de nombreuses applications de recherche en utilisant le marquage au deutérium ou au 13C. Les applications actuelles et futures utiliseront le test RID en milieu clinique et dans des sous-groupes de population dans des enquêtes. La simplification du dosage sera importante pour ces applications.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de ce manuscrit.

Remerciements

Ce travail a été financé par le NIH-R01 DC019357 et le projet de recherche coordonné E43035 de l’AIEA. Nous remercions Nicholas Keuler du groupe de consultation statistique de l’Université du Wisconsin-Madison pour son aide dans l’analyse de la comparaison de la méthode de la seringue à usage unique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
anhydride acétiqueSigma Aldrich242845
acétoneSigma Aldrich179124
alumineSigma Aldrich199974
BéchersQuelconqueToute entreprise de fourniture de verre
bêta-iononeSigma AldrichW259500
étherSigma Aldrich673811
Pipettes Pasteur en verreQuelconqueToute entreprise de fourniture de verre
hexanesSigma178918
triéthylphosphonoacétate marquéSigma Aldrich293202
solution d’hydrure d’aluminium et de lithiumAcros organics199511000
Oxyde de manganèseSidma Aldrich310700
Pipettes à déplacement positifRainin17008579
acétate de rétinyleSigma AldrichRéf. R4632
Entonnoirs de séparationQuelconqueToute entreprise de fourniture de verre
gel de siliceSigma Aldrich1.07734
hydrure de sodiumAldrich223441
hydroxyde de sodiumFisher ScientificS318-100
spectrophotomètreToute numérisationLe double faisceau est préférable
triéthylamineSigma Aldrich471283
triéthylphosphonoacétateAldrichRéf. T61301
Seringue à tuberculineNorm-JectRéférence 19G334
huile végétalesojaÉpicerie
Fioles jaugées (25 mL)QuelconqueToute entreprise de fourniture de verre

Références

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