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Article de méthode

Examen des caractéristiques anatomiques des cellules ganglionnaires rétiniennes sous excitotoxicité induite par l’acide N-méthyl-D-aspartique (NMDA)

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DOI :

10.3791/68537

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19 septembre 2025

 ,  , 
1Ruiz Department of Ophthalmology and Visual Science, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center at Houston (UTHealth)

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons l’utilisation d’une méthode de marquage à la phosphatase alcaline (AP) génétiquement dirigée pour étudier les caractéristiques anatomiques et les phénotypes des rétines de souris sous excitotoxicité induite par NMDA. En conjonction avec plusieurs lignées de rapporteurs spécifiques aux sous-types de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), nous découvrons de nouveaux phénotypes chez les CGR mourants tout au long du processus dégénératif.

Résumé

Les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) sont les neurones de sortie de la rétine, responsables de la transmission des informations visuelles au cerveau. Dans la rétine mature de la souris, plus de 40 types de CGR ont été identifiés sur la base de caractéristiques génomiques, morphologiques et fonctionnelles. La dégénérescence RGC est une caractéristique de diverses maladies rétiniennes débilitantes, notamment le glaucome et la neuropathie optique traumatique. Il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la dégénérescence, à la survie et à la résilience des CGR dans différentes maladies pour développer des interventions thérapeutiques efficaces. Pour étudier la dégénérescence du CGR, nous avons adopté une technique simple mais puissante précédemment largement utilisée dans les études de développement rétinien pour les morphologies du CGR et la projection centrale. Ici, nous appliquons cette méthode pour évaluer les phénotypes anatomiques des CGR sous excitotoxicité induite par NMDA. Cette approche permet de visualiser un grand nombre de CGR en dégénérescence au fil du temps, ce qui nous permet de cartographier la séquence des événements dégénératifs, d’identifier les phénotypes caractéristiques des CGR mourants et de distinguer les CGR qui résistent aux dommages induits par le NMDA.

Introduction

Le traumatisme crânien (TCC) est une blessure soudaine qui cause des lésions neuronales au cerveau. Dans les formes graves de TCC, telles que celles causées par des accidents de voiture ou des collisions sportives et des blessures dues à des explosions, les forces mécaniques peuvent perturber l’architecture cellulaire, entraînant une inflammation, un stress oxydatif, une excitotoxicité et finalement la mort neuronale 1,2.

La rétine, la partie la plus accessible du système nerveux central (SNC), a servi de système modèle de traumatisme crânien pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’excitotoxicité et pour élaborer des stratégies d’intervention thérapeutique 3,4,5. Les modèles de rétine les plus pertinents pour les études de TCC sont le modèle d’écrasement du nerf optique et l’excitotoxicité induite par l’acide N-méthyl-D-aspartique (NMDA) des rétines. Dans le modèle rétinien d’excitotoxicité induite par NMDA, les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) ont été identifiées comme le type de neurones rétiniens le plus sensible, car les CGR utilisent le glutamate comme neurotransmetteur excitateur majeur et divers types de récepteurs du glutamate, y compris les récepteurs AMPA (AMPAR), les récepteurs KAPA (KAPAR) et les récepteurs NMDA, pour déclencher le potentiel axonal6. En plus des CGR, d’autres cellules rétiniennes et circuits neuronaux pourraient également être affectés par le traitement NMDA 7,8,9. L’application intra-vitrée de NMDA provoque une ouverture prolongée du récepteur NMDA, ce qui entraîne un afflux excessif de calcium dans les cellules, provoquant une activité neuronale surexcitatrice et une homéostasie calcique déséquilibrée 10,11,12,13.

Le récepteur NMDA est un complexe hétéromérique composé de trois sous-unités : GluN1, GluN2 et GluN3 14,15,16,17,18. GluN1, codé par Grin1, contient huit isoformes chez la souris en raison de l’épissage alternatif de Grin1. Il existe quatre sous-unités GluN2 différentes (a-d), qui sont codées par quatre gènes distincts : Grin2a-2d. Il existe deux sous-unités GluN3 différentes (a et b), qui sont encodées par Grin3a et 3b. Selon les données de scRNA-seq19,20, Grin1 est fortement exprimé dans la plupart des sous-types RGC (Figure 1A) ainsi que dans quelques sous-types de cellules amacrines (AC) avec des niveaux d’expression faibles à modérés (Figure 1B). Grin2a est enrichi dans moins de sous-types RGC et AC, tandis que Grin2b est exprimé modérément dans la plupart des RGC et de nombreux sous-types AC (Figure 1A,B). Les niveaux d’expression de Grin2c, Grin2d et Grin3b dans les CGR et les CA sont extrêmement faibles (Figure 1A,B). L’expression de Grin3a peut être observée dans quelques sous-types RGC et faiblement dans quelques AC (Figure 1A,B). En plus du rôle des récepteurs NMDA, l’excitotoxicité déclenchée par l’afflux de calcium par le biais d’AMPAR perméables au calcium a été décrite dans plusieurs modèles de maladies21. L’expression des sous-unités des récepteurs NMDA peut fournir des indices sur la raison pour laquelle l’excitotoxicité induite par NMDA cible principalement les CGR ainsi que les AC 9,10,14,22,23.

Les méthodes conventionnelles d’évaluation des phénotypes rétiniens globaux induits par le NMDA comprennent la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour détecter les anomalies histologiques, le test TUNEL pour la mort cellulaire et la coloration immunofluorescente (IF) à l’aide d’un biomarqueur spécifique au type de cellule 8,10,24,25,26 . Au niveau cellulaire, des techniques d’imagerie confocale et de remplissage de colorants ont été utilisées pour étudier la séquence des événements chez les CGR mourants dans le modèle rétinien induit par NMDA. Ces méthodes ont fourni des informations précieuses sur les compartiments subcellulaires des CGR mourants et ont permis d’identifier les types de CGR résilients qui survivent sous l’agression NMDA27,28.

Ici, nous utilisons la coloration à la phosphatase alcaline (AP) génétiquement activée pour étudier les caractéristiques anatomiques et les phénotypes des neurones rétiniens de souris sous excitotoxicité induite par NMDA 29,30,31. La raison du choix de cette méthode est due à sa simplicité, à sa rentabilité et à sa capacité à obtenir une vue d’ensemble complète des caractéristiques anatomiques des sous-types neuronaux dans l’ensemble de la rétine, ce qui la rend bien adaptée aux évaluations grossières et aux analyses comparatives à grande échelle. Cette approche fournit de nouvelles informations sur la façon dont des neurones rétiniens distincts et génétiquement marqués réagissent au NMDA aux niveaux macroscopique et subcellulaire. Nous prévoyons que cette stratégie sera largement applicable pour évaluer les changements morphologiques dans divers modèles de maladies qui affectent l’architecture neuronale et l’organisation synaptique 4,26,32,33.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont suivi la politique du Service de santé publique des États-Unis sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine McGovern de l’Université du Texas à Houston. Les compositions des solutions sont répertoriées dans le tableau des matériaux.

1. Injection de tamoxifène

  1. Mélangez 30 mg de tamoxifène avec 30 μL d’éthanol. Dans de l’eau sous-bouillante, chauffer 1 mL d’huile de tournesol et le mélange tamoxifène/éthanol.
  2. Une fois que le tamoxifène s’est dissous dans l’éthanol, ajoutez rapidement 1 ml d’huile de tournesol chauffée à la solution de tamoxifène. Bien mélanger par pipetage.
  3. Des souris des deux sexes à différents âges entre 2 et 6 mois ont été utilisées. Injecter la solution de tamoxifène à une dose de 100 μg/g de poids corporel par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue à insuline. Déterminez le nombre d’injections de tamoxifène en fonction de la lignée de souris. Dans ce protocole, le tamoxifène a été administré une fois par jour pendant quatre jours consécutifs.
    REMARQUE : Étant donné que la solution de tamoxifène est mélangée à de l’huile dense, elle est difficile à manipuler avec une seringue dotée d’une aiguille détachable. Ainsi, une seringue à insuline avec une aiguille attachée est préférée pour l’injection de tamoxifène.
  4. Hébergez la souris en groupes de 5 personnes maximum dans des cages ventilées individuellement. jusqu’à l’injection de NMDA.

2. Injection de solution NMDA dans les yeux de la souris

  1. Préparez 20 mM de solution NMDA dans 1x PBS stérile. Lavez le nano-injecteur avec une aiguille 35G attachée en utilisant de l’éthanol à 100 % 20x, puis lavez-le avec de l’eau stérile ultrapure 20x supplémentaires. Remplissez le nano-injecteur avec 1 μL de solution NMDA.
  2. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale d’une kétamine/xylazine dans un mélange de solution 1X PBS (80/10 mg par kg de poids corporel). Évaluer l’inconscience par réflexe, réponse de retrait au pincement de la queue et des orteils.
  3. Placez la souris anesthésiée sur un stéréomicroscope. Positionnez la souris avec son œil droit vers le haut et son nez pointant vers le côté droit. Appliquez une goutte de solution de chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 % sur le globe oculaire droit pour une anesthésie locale.
  4. À l’aide d’une aiguille d’injection stérile de 30G, perforez le limbe à 7 heures, en créant un petit trou. Surveillez l’emplacement et la direction de l’aiguille au stéréomicroscope. Assurez-vous que la taille de l’aiguille d’injection est légèrement plus grande que celle de l’aiguille de nano-injection pour permettre une insertion facile.
  5. Retirez soigneusement l’aiguille d’injection du globe oculaire et jetez-la correctement. Utilisez le stéréomicroscope pour vous guider, insérez l’aiguille de nano-injection dans le vitré à travers le limbe à un angle de 45°.
  6. Injectez lentement 1 μL de solution NMDA dans le vitré. Après l’injection, maintenez l’aiguille de nano-injection dans le vitré pendant environ 10 s pour éviter l’écoulement de la solution injectée.
  7. Retirez soigneusement et lentement l’aiguille de nano-injection de l’œil. Appliquez la pommade ophtalmique à l’érythromycine à 0,5 % sur la cornée de l’œil injecté.
  8. Placez la souris dans une cage sur un coussin chauffant. Surveillez la souris toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie. Hébergez la souris pendant une à deux semaines jusqu’à la collecte de tissus.

3. Prélèvement de tissus et coloration à la phosphatase alcaline (AP)

  1. Euthanasier la souris avec asphyxie au CO2, suivie d’une luxation cervicale. Coupez soigneusement les muscles reliant le globe oculaire et le nerf optique avec des ciseaux Vanna.
  2. Le globe oculaire a ensuite été prélevé à l’aide d’une pince et transféré dans des tubes de 2,0 ml étiquetés séparément.
  3. Fixez les globes oculaires dans du formol tamponné à 10 % de neutre pendant 10 min à température ambiante. Montez à plat les rétines sur un filtre à membrane en nitrate de cellulose comme décrit ci-dessous.
    1. Transférez les globes oculaires dans des boîtes de Pétri de 10 cm contenant 1x PBS. Tenez tout tissu musculaire attaché au globe oculaire à l’aide d’une pince. Créez un trou au niveau du limbe à l’aide d’une aiguille d’injection 30G. Insérez la pointe des ciseaux Vanna dans le trou et coupez autour de l’ora serrata. Retirez la lentille de l’œilleton à l’aide d’une pince.
    2. Faites 3-4 incisions sur l’œilleton et utilisez des pinces pour tenir l’EPR et retirer doucement l’EPR de la rétine.
    3. Coupez un petit morceau de filtre à membrane en nitrate de cellulose et trempez-le dans 1x PBS. Placez la rétine isolée sur le filtre. Poussez doucement une zone périphérique de la rétine avec la pointe d’un pinceau fin pour fixer le bord de la rétine au filtre.
    4. Tenez le bord du filtre et retirez-le lentement du PBS 1x, en vous assurant que la rétine reste attachée et s’aplatit sur le filtre. Placez la rétine/le filtre sur une serviette en papier pendant 1 minute pour aider à fixer la rétine attachée au filtre.
    5. Transférez la rétine/le filtre dans une boîte de Pétri avec 1x PBS. Retirez soigneusement tous les débris, cheveux et vitrés de la rétine à l’aide d’une pince et/ou d’un pinceau fin, autant que possible. Pour distinguer les rétines injectées et non injectées, découpez les filtres de différentes formes.
  4. Transférez la rétine/le filtre dans une boîte de Pétri. Fixez la rétine dans du formol tamponné à 10 % de neutre pendant 5 min à température ambiante avec une agitation douce.
  5. Préparez un bain-marie à 65 °C. Préchauffer 30 ml de 1x PBS dans un bécher en verre de 50 ml. Transférez la rétine/les filtres directement dans le PBS 1x préchauffé. Incuber les rétines à 65°C pendant 30 min.
    REMARQUE : Le traitement thermique inactive l’activité endogène AP, ce qui provoque une coloration de fond dans la rétine. Il est crucial de traiter la rétine dans la solution chauffée pour éliminer efficacement ce fond.
  6. Après le traitement thermique, transférez les rétines dans une boîte de Pétri de 30 mm contenant un tampon AP (100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2).
  7. Incuber les rétines dans le tampon AP à température ambiante pendant 5 minutes en agitant doucement.
    REMARQUE : Cette étape remplace le tampon dans la rétine de 1x PBS à tampon AP, empêchant ainsi la précipitation chimique pendant le développement de la couleur.
  8. Remplacer le tampon AP par une solution colorante (30 μL de BCIP à 10 mg/mL et 60 μL de NBP à 10 mg/mL dans 10 mL de tampon AP).
  9. Placez la boîte de Pétri dans une boîte à l’abri de la lumière. Développer la réaction AP à température ambiante pendant 1 à 2 jours avec une légère agitation jusqu’à ce que l’intensité de la coloration AP soit satisfaisante pour l’imagerie.
  10. Arrêtez la réaction en lavant les rétines avec 1x PBS pendant 5 min, 2x, à température ambiante avec une agitation douce.
  11. Postfixez les rétines avec 10 % de formol tamponné neutre pendant 10 min à température ambiante avec une agitation douce.
  12. Lavez les rétines avec 1x PBS pendant 5 min, 3x, à température ambiante avec une agitation douce. Déshydratez les rétines en les incubant dans de l’éthanol à 30 %, puis à 50 % d’éthanol pendant 30 minutes chacune à température ambiante avec une légère agitation.
  13. À l’aide d’un pinceau fin, vous retirez délicatement les rétines du papier filtre. Déshydratez les rétines sans filtre dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 min, suivies de deux incubations de 30 minutes dans de l’éthanol à 100 % à température ambiante avec une agitation douce.
  14. Nettoyez les rétines dans une boîte de Pétri en verre avec une solution nettoyante de benzyle benzyle/alcool benzylique (2:1, v/v) pendant 30 min à 2 h à température ambiante avec une agitation douce.
    REMARQUE : Cette procédure de nettoyage ne doit pas être effectuée pendant la nuit, car une incubation prolongée peut souvent entraîner la perte de la coloration AP. La solution éclaircissante peut faire fondre le plastique, la procédure doit donc être effectuée dans un récipient en verre.
  15. Pour monter les rétines sur une lame de verre, appliquez du ruban adhésif double face sur la diapositive afin de créer une plate-forme pour la lamelle et la rétine. Placez les rétines sur la lame, remplissez l’espace avec une solution éclaircissante, appliquez la lamelle et scellez la lame avec du vernis à ongles pour fixer la rétine et la lamelle.
  16. Imagez les rétines colorées par AP à l’aide d’un microscope Zeiss Apotome.

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Résultats

L’application de NMDA dans le vitré induit la mort du CGR, qui a été conventionnellement détectée à l’aide de la coloration histologique ou de la coloration par immunofluorescence (FI) avec des marqueurs RGC. Dans notre cadre expérimental, en utilisant la stratégie IF conventionnelle avec un marqueur pan-RGC RBPMS, nous avons confirmé que le nombre de RGC diminuait d’environ 65 %, 1 semaine après l’injection de NMDA (Figure 2E-G). Des études antérieures ont découvert que les...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons utilisé un système de marquage AP clairsemé génétiquement dirigé en conjonction avec un certain nombre de lignées de souris génétiquement manipulées pour examiner les événements dégénératifs induits par NMDA dans divers sous-types RGC et AC et avons découvert plusieurs phénotypescaractéristiques 29,31,39. Le phénotype le plus notable est la réduction significative de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health-National Eye Institute à C.A.M. (EY024376) et en partie par des subventions de base pour la vision du National Eye Institute P30EY028102 (UTHealth). Nous reconnaissons également le soutien financier du Stephen Lasher Endowment (UTHealth) et du Raye White Endowment (UTHealth).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 % d’érythromycine pommade ophtalmique  ;Bausch+Lomb24208-910-55
Chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 %  ;Bausch+Lomb24208-730-06
10 % de formol tamponné neutre  ;VWR89370-094
Pétridish de 10 cmCorning430167
10 fois par PBSFisher ScientificBP399Diluer dans l’eau pour créer 1x PBS et autoclave.  ;
Tube de 2,0 mlVWR525-1136
Aiguille d’injection de calibre 30EXELINT International26437
Pétride de 30 mmFaucon35208
Alcool benzylique  ;Acros Organics447000010
BenzylbenzateAcros Organics105860010
Filtre à membrane en nitrate de celluloseCytiva7188-002
CouvercleSciences de la microscopie électronique72204-01
Ruban adhésif double faceScotch597020
ÉthanolLaboratoires de décontamination2716Évitez les réactifs Fisher Bioreagents (Cat# : BP2818) pour la déshydtration après coloration AP. Ce réactif déforme les rétines.
ForcepsTED PELLA505
Coussin chauffantLe710298-001
Seringue à insulineBD329424
KétamineDechra17033010110
MicroscopeZeissAxio Imager 2
Vernis à onglesSciences de la microscopie électronique72180
Injecteur NanofilInstruments de précision mondiauxNANOFIL
Aiguille NanofilInstruments de précision mondiauxNF25BL
Kit de réactifs NBT/BICPInvitrogenN° N6547
NMDASigma-AldrichRéférence M3262
PinceauKingart6650
Verre coulissantFisher Scientific12-550-15
StéréomicroscopeMotiqueDM143
Huile de tournesolSigma-AldrichRéf. S5007
TamoxifèneSigma-AldrichRéf. T5648Conserver la solution de tamoxifène à 4 ° ; C dans une boîte étanche à la lumière. Utilisez la solution de tamoxifène dans la semaine.
Ciseaux Vanna  ;Outils scientifiques fins15000-00
Bain d’eauLigne de laboratoire18052
XylazineDechra17033-0099-05Nom du produit : Rompun

Références

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