Article de méthode

Détection métabolique en temps réel dans des cellules vivantes à l’aide de la RMN 13C hyperpolarisée

DOI :

10.3791/68539

⸱

8 juillet 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantum Life Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 2Institute of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba, 3Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Osaka Metropolitan University, 4Center of Quantum Life Science for Structural Therapeutics (cQUEST), Chiba University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole intègre un système de bioréacteur sur mesure avec une spectroscopie RMN ¹³C hyperpolarisée pour mesurer le métabolisme des pyruvates en temps réel dans les cellules vivantes, améliorant ainsi la reproductibilité et la précision cinétique pour les études métaboliques et les applications de criblage de médicaments.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole présente une méthode permettant d’intégrer un système de bioréacteur construit en interne avec une spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) hyperpolarisée de 13°C pour mesurer le métabolisme des pyruvates dans des cellules vivantes en temps réel. Le protocole décrit la construction d’un système de bioréacteur qui permet un timing précis de l’injection de substrat hyperpolarisé et de l’acquisition du signal RMN tout en maintenant un environnement de culture cellulaire stable. La méthode détecte de manière fiable la conversion métabolique du pyruvate en lactate dans une fenêtre de mesure de 60 s tout en maintenant un rapport signal/bruit suffisant tout au long du processus. La capacité de mélange in situ du système accélère la détection du signal RMN et réduit les pertes de relaxation T1. Le protocole comprend également des instructions détaillées pour la préparation de gels d’alginate afin d’encapsuler les cellules et de les placer dans le bioréacteur. La méthode proposée présente une reproductibilité et une précision cinétique améliorées par rapport aux méthodes conventionnelles, ce qui indique des applications potentielles dans les études sur le métabolisme du cancer et le dépistage de médicaments. D’autres améliorations du système, telles que l’adoption de matrices de gel alternatives, pourraient améliorer sa polyvalence dans diverses études biologiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La RMN hyperpolarisée, en particulier par le biais de la polarisation nucléaire dynamique (DNP), augmente considérablement l’intensité du signal RMN1 et permet le suivi en temps réel des changements métaboliques avec une sensibilité considérablement améliorée 2,3. Cette technique a été appliquée avec succès dans divers systèmes biologiques, y compris la levure 4,5, les modèles de cellules cancéreuses 6,7,8 et les micro-organismes 9,10. Il a également été utilisé pour surveiller les principales voies métaboliques telles que la glycolyse11,12, l’homéostasie redox13,14 et la régulation du pH15,16. Au-delà de la recherche fondamentale, la RMN hyperpolarisée est maintenant utilisée en imagerie clinique par IRM, permettant une évaluation métabolique de l’échelle cellulaire à l’échelle du corps entier17. Ces développements soulignent la demande croissante de protocoles accessibles qui facilitent l’utilisation plus large de la RMN hyperpolarisée dans divers contextes biologiques.

Malgré sa polyvalence, la mise en œuvre de mesures métaboliques en temps réel dans des cellules vivantes à l’aide de la RMN hyperpolarisée reste techniquement difficile. Les systèmes conventionnels reposent souvent sur des configurations complexes et spécifiques au laboratoire qui manquent de reproductibilité et sont difficiles à utiliser sans une expertise approfondie 8,18,19,20. Cela représente un obstacle majeur pour les chercheurs qui souhaitent adopter cette technologie pour la recherche biologique ou translationnelle. Par rapport à d’autres méthodes telles que l’imagerie optique ou la spectrométrie de masse, la RMN 13C hyperpolarisée permet une surveillance non invasive et résolue dans le temps de réactions métaboliques spécifiques sans échantillonnage destructif. Il fournit des informations biochimiques directes avec une précision temporelle, ce qui le rend bien adapté aux études dynamiques du métabolisme cellulaire.

Pour remédier à ces limites, cette étude présente un protocole pratique et reproductible spécialement conçu pour permettre aux chercheurs d’effectuer des mesures RMN hyperpolarisées du métabolisme des cellules vivantes avec un minimum d’obstacles techniques. Une méthode complète est décrite pour la mesure de base du métabolisme des pyruvates dans les cellules vivantes. Bien que ce protocole puisse être appliqué à d’autres sondes marquées au carbone 13, le pyruvate est particulièrement adapté en raison de son absorption cellulaire rapide, de ses voies métaboliques bien caractérisées et de son rôle central dans le métabolisme cellulaire. La procédure consiste en : (i) la préparation d’échantillons cellulaires, (ii) l’encapsulation dans des gels d’alginate, (iii) l’hyperpolarisation à l’aide d’un polariseur DNP, et (iv) la mesure RMN 13C en temps réel dans un spectromètre de 400 MHz (Figure 1). De plus, les paramètres clés pour la construction du système de bioréacteur sont fournis afin d’assurer la reproductibilité et la compatibilité avec le matériel RMN standard. Le protocole est optimisé pour faciliter la mise en œuvre à l’aide de composants disponibles dans le commerce et est destiné à aider les chercheurs, en particulier ceux qui découvrent la technique, à déterminer son adéquation à leurs besoins expérimentaux.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Configuration du bioréacteur (Figure 2A-B)

  1. Assemblage du tube RMN
    1. Utilisez un tube RMN à bouchon à vis (10 mm de diamètre, longueur 178 mm) avec un capuchon ouvert pour l’insertion du tube.
    2. Préparez un septum de flacon en silicone/PTFE (9 mm de diamètre) et insérez-y un tube en PEEK pour une fermeture étanche (Figure supplémentaire 1).
    3. Insérez le septum avec un tube PEEK résistant aux produits chimiques (diamètre intérieur 1,0 mm, diamètre extérieur 1,6 mm, épaisseur de paroi 0,3 mm, longueur 1 m) dans l’ouverture du capuchon modifié.
    4. Placez le septum entre le tube RMN et son capuchon ouvert, et fixez-le en fermant fermement le capuchon. Cette configuration maintient le septum en place et fournit une étanchéité suffisante pour éviter les fuites pendant la perfusion ou l’injection.
  2. Mise en place d’une tubulure à débit moyen (Figure 2C)
    1. Connectez le tube PEEK aux orifices d’entrée et de sortie du tube RMN pour permettre une perfusion continue. Fixez les raccords à l’aide d’un kit de raccord sans bride pour éviter les fuites.
  3. Installation des composants de réchauffement moyen
    1. Connectez le tube PEEK à une pompe péristaltique réglable à un débit stable d’environ 0,2 mL/min, assurant une circulation continue du fluide via un kit de circulation externe. Placez le réservoir moyen dans un bain-marie réglé à 37 °C pour maintenir la température.
  4. Ajout d’un composant de prévention des fuites de gel
    1. Coupez une éponge dense pour l’adapter au diamètre du tube RMN. Insérez l’éponge dans le fond du tube pour éviter les fuites de gel d’alginate tout en permettant un écoulement moyen.
  5. Fabrication et insertion de l’élément de fixation de l’éponge imprimé en 3D (Figure 2D-F)
    1. Imprimez en 3D un support cylindrique (diamètre extérieur 9,1 mm, longueur 20 mm, avec un trou central de 1,5 mm de diamètre) à l’aide d’une résine photopolymère compatible avec l’impression 3D stéréolithographique. Les spécifications de conception sont fournies dans le dossier supplémentaire 1 ci-joint.
    2. Insérez un capillaire en verre borosilicate (diamètre extérieur 1,5 mm, diamètre intérieur environ 0,9 mm, longueur 90 mm) à travers le trou préformé du support imprimé en 3D.
    3. Fixez l’éponge à la plate-forme du support à l’aide d’une résine durcissable aux UV avec une propriété de résistance à l’eau. Durcir pendant 30 s sous lumière UV pour assurer la solidification.
    4. Insérez le support assemblé avec une éponge dans le tube RMN.

2. Préparation cellulaire (commencer 2 semaines avant la mesure)

  1. Décongeler rapidement les stocks cellulaires congelés (SCCVII ou HeLa) dans un bain d’eau à 37 °C. Transvaser environ 1 × 106 cellules dans un milieu RPMI-1640 de 10 mL complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin et 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine.
  2. Cultiver des cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 et les passer tous les 2-3 jours une fois que la confluence de 70 %-80 % est atteinte. Poursuivre l’élevage pendant environ 2 semaines pour obtenir ~4 x 107 cellules, estimées à partir de cinq boîtes de 10 cm cultivées jusqu’à environ 90 % de confluence (chacune produisant ~8 x 106 cellules).

3. Préparation du gel d’alginate

  1. Préparation de la solution d’alginate
    1. Dissoudre la poudre d’alginate de sodium biologique de qualité recherche dans de l’eau désionisée pour préparer une solution à 2 % (p/v). Incuber la solution pendant la nuit à 25 °C ou plus en agitant doucement de bout en bout. Utilisez un rotateur de tube réglé à environ 10-20 tr/min pour éviter les bulles et assurer une dissolution uniforme.
  2. Encapsulation de cellules dans un gel d’alginate
    1. Ajouter 2 ml de trypsine-EDTA à 0,25 % (v/v) dans la boîte de 10 cm. Inclinez la parabole pour couvrir toute la surface et aspirez l’excès de trypsine-EDTA.
    2. Incuber le plat à 37 °C pendant 2 minutes.
    3. Ajouter 10 ml de milieu de culture dans le plat. Pipetez doucement de haut en bas pour détacher les cellules. Recueillir toute la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.
    4. Prélever environ 10 μL de suspension et compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules. En règle générale, environ 1 × 107 cellules sont nécessaires pour les procédures ultérieures, mais le nombre réel doit être confirmé par mesure.
    5. Centrifuger la suspension cellulaire restante à 120 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 mL de solution d’alginate à 2 % (p/v). Pipeter lentement pour minimiser la génération de bulles.
  3. Formation de gel par réticulation du calcium (Figure 3)
    1. Ajouter 10 mL de solution de CaCl2 de 50 mM dans un tube à centrifuger de 50 mL (Figure 3A).
    2. Prélever 300 μL du mélange cellule-alginate dans une seringue de 0,5 mL munie d’une aiguille de 30 G de 10 mm et la fixer au capuchon du tube à centrifuger (figure 3B).
    3. Fermez hermétiquement le capuchon du tube de centrifugation avec la seringue fixée dessus et centrifugez doucement l’ensemble à 200 × g pendant 5 min. Retirer la solution surnageante après la centrifugation et remettre en suspension le gel chargé de cellules dans le milieu (Figure 3C-D).
  4. Chargement du gel dans le tube RMN
    1. Transférez le gel encapsulé dans le tube RMN à l’aide d’une pipette Pasteur. Insérez le dispositif d’éponge et assurez-vous d’une étanchéité parfaite.
    2. Préchauffer le réservoir de milieu (contenant 5 % (v/v) de D2O) préparé à l’étape 1.3.2 dans un bain d’eau à 37 °C et le faire circuler à un débit d’environ 500 μL/h pour stabiliser les conditions.
    3. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites avant d’insérer le tube RMN dans l’aimant. Tout en gardant le tube PEEK droit, insérez le tube RMN dans l’aimant. Ajustez la taille du gel, le nombre de billes et la vitesse de pipetage en fonction du type de cellule et des exigences expérimentales.

4. Préparation de la sonde hyperpolarisée à l’aide d’un polariseur DNP (Figure 4)

  1. Préparation du flacon d’échantillon
    1. Ajouter 18 μL d’acide pyruvique [1-13°C] (14,2 M) dopé avec 25 mM d’OX063 dans un flacon d’échantillon. Connectez le flacon au chemin du fluide du système de polarisation DNP.
  2. Polarisation de l’échantillon
    1. Insérez le flacon dans l’unité d’alésage du polariseur DNP (6,7 T, 1,25 K, 1,2 mbar). Appliquer un rayonnement par micro-ondes à environ 188 GHz (22 mW) pendant 60 à 80 min.
  3. Surveillance du signal pendant la polarisation
    1. Utilisez le spectromètre RMN à semi-conducteurs intégré au système DNP pour surveiller l’intensité du signal de 13°C. Enregistrez les données du signal toutes les 5 minutes à l’aide du logiciel RMN (SPINit).
  4. Dissoudre et préparer la solution hyperpolarisée
    1. Dissoudre rapidement l’échantillon polarisé dans 3,2 mL de tampon de dissolution préchauffé (40 mM Tris, 50 mM NaCl, 80 mM NaOH, 100 mg/L EDTA). Assurez-vous que la solution atteint la température biologique (308-313 K, pH ~ 7) avant de la transférer pour la mesure RMN.
      REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous manipulez des composants à haute pression. Préchauffez le tampon de dissolution à ~461 K pour assurer un transfert efficace et l’intégrité de l’échantillon.

5. Configuration RMN

  1. Préparation du spectromètre RMN
    1. Chargez l’échantillon dans le tube RMN et insérez-le dans le spectromètre.
    2. Effectuez le verrouillage, le réglage, l’appariement et le calage sur la console RMN à l’aide de la procédure automatisée avec l’échantillon inséré, afin d’optimiser la résolution spectrale et la stabilité du signal.
  2. Paramétrage des paramètres d’acquisition
    1. Chargez une séquence d’acquisition d’impulsions 13C (p. ex., zg2d) avec le découplage des protons activé (p. ex., 13-CPD).
    2. Réglez l’angle de basculement à 90° à l’aide d’une impulsion de 1 μs (P1). Réglez le temps d’acquisition sur 1,376 s, la largeur spectrale sur 23 663 Hz et le nombre de points d’acquisition (TD) sur 65 536. Réglez le délai de relaxation (D1) sur 0 s.
    3. Réglez le nombre d’incréments de temps (TD1) sur 150 pour acquérir 150 spectres séquentiels en mode pseudo-2D. Ajustez le gain du récepteur à une valeur faible (par exemple, ~1) pour éviter la saturation du signal provenant d’échantillons hyperpolarisés.
      REMARQUE : En raison de l’intensité élevée du signal de la RMN hyperpolarisée, réglez le gain du récepteur sur une valeur faible (par exemple, ~1), ce qui correspond généralement à moins de 1 % du gain maximum disponible. Le gain du récepteur est un paramètre interne, sans unité, qui contrôle l’amplification du signal. Des valeurs trop élevées peuvent entraîner une saturation du signal.

6. Mesure RMN

  1. Préparation à la mesure
    1. Remplissez tout le chemin d’entrée de la tubulure entre la tubulure d’entrée et la gaine RMN avec un tampon de dissolution pour éviter l’emprisonnement d’air (Figure 2B). La tubulure d’entrée est utilisée à la fois pour la perfusion moyenne et l’injection de sonde hyperpolarisée.
    2. Vérifiez soigneusement qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le tube d’entrée ou à l’intérieur du tube RMN, car les bulles dans cette région peuvent interférer avec l’acquisition du signal pendant les mesures RMN.
  2. Préparation à l’injection d’une solution hyperpolarisée
    1. Arrêtez la pompe péristaltique pour arrêter temporairement la circulation du fluide avant d’injecter la solution hyperpolarisée à travers la tubulure d’entrée.
    2. Commencer l’acquisition spectrale environ 10 s avant de dissoudre le substrat hyperpolarisé pour s’assurer que le signal est capturé immédiatement à l’arrivée au site de détection RMN après l’injection.
    3. Prélevez 1 mL de la solution à l’aide d’une seringue à la sortie du polariseur DNP.
  3. Injection de la solution hyperpolarisée et confirmation du signal
    1. Mettez la vanne à trois voies à l’entrée du bioréacteur en position B pour injecter la solution hyperpolarisée dans le tube RMN.
    2. Remettez la vanne en position A après l’injection pour reprendre la circulation du fluide et éviter le refoulement.
    3. Confirmez la réussite de l’injection et de l’arrivée du substrat en observant une augmentation du signal FID (Free Induction Decay) dans le logiciel d’acquisition.

7. Traitement et analyse des données

  1. Traitement des données spectrales
    1. Chargez le spectre RMN résolu dans le temps dans le logiciel de traitement des données. Si les données sont stockées au format de fichier ser, localisez et chargez le fichier approprié.
  2. Analyse des spectres
    1. Effectuez la transformation de Fourier (FT) pour convertir le FID brut en domaine fréquentiel. Appliquez la correction de phase manuellement ou automatiquement. Effectuez une correction de la ligne de base pour supprimer les distorsions.
  3. Visualisation de la conversion des métabolites
    1. Tracer les signaux temporels pour le pyruvate C1 (~171 ppm) et le lactate C1 (~183 ppm).
  4. Quantification de la conversion métabolique
    1. Calculez l’aire sous la courbe (AUC) pour les pics de pyruvate et de lactate.
    2. Déterminez le rapport [Lactate]/[Pyruvate] en divisant l’ASC du lactate par celle du pyruvate.
      REMARQUE : L’AUC est utilisée à la place de la hauteur de crête pour minimiser l’influence des artefacts de résonance causés par le grand signal de pyruvate hyperpolarisé [1-¹³C]. Les valeurs AUC sont obtenues par la simple somme des intensités du signal dans la plage d’intégration définie pour chaque crête.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, un système fabriqué a été couplé à une spectroscopie RMN 13C hyperpolarisée pour mesurer le métabolisme du pyruvate dans des cellules vivantes en temps réel. Les principaux signaux détectés dans le spectre RMN 1D 13C correspondaient au pyruvate (environ 171 ppm) et au lactate (environ 183 ppm)21, ce qui nous permet d’évaluer la conversion métabolique du pyruvate en lactate dans des conditions physiologiques (Figure 4).

Qualité spectrale et dynamique du signal
La figure 5 présente des résultats représentatifs de mesures répétées sur le même échantillon à l’aide de cellules SCCVII – une lignée de carcinome épidermoïde de souris fréquemment utilisée dans les études d’IRM hyperpolarisée – . La première mesure a montré une nette augmentation du signal de lactate, indiquant une conversion métabolique active. Cependant, des mesures ultérieures effectuées à des intervalles de 1,5 heure ont montré un déclin progressif de l’activité métabolique. Cette réduction dépendante du temps reflète probablement le stress biologique ou l’adaptation induite par l’injection initiale de pyruvate. Notamment, une modulation métabolique transitoire similaire a été rapportée in vivo à l’aide de l’IRM hyperpolarisée et de l’EPRI, où l’oxygénation tumorale a temporairement diminué après l’administration de pyruvate22. Ces résultats démontrent que la répétabilité de ces mesures permet un suivi non destructif des changements métaboliques dynamiques – un avantage difficile à obtenir avec des méthodes destructrices23.

Pour évaluer l’applicabilité de ce protocole à d’autres types de cellules, des mesures supplémentaires ont été effectuées à l’aide de cellules HeLa, une lignée cellulaire cancéreuse humaine largement utilisée. Comme le montre la figure 6, les cellules HeLa ont également montré une conversion claire du pyruvate en lactate. Bien que l’intensité du signal ait progressivement diminué en raison de la relaxation T1, le rapport signal/bruit est resté suffisant tout au long de la période d’acquisition de 60 s. Ces résultats suggèrent que le protocole actuel est largement applicable et peut servir d’outil polyvalent pour le profilage métabolique en temps réel dans divers types de cellules.

Bien que la décroissance rapide du signal soit une limitation inhérente à la RMN basée sur DNP, notre système de mélange in situ minimise le délai entre la dissolution et la mesure, améliorant ainsi la sensibilité de détection. D’autres améliorations, telles que l’optimisation de la composition de la matrice de gel, pourraient étendre l’applicabilité de cette méthode à un plus large éventail de systèmes biologiques.

figure-results-1
Figure 1 : Schéma de principe du flux de travail global, de la culture cellulaire à la mesure RMN hyperpolarisée. Le processus commence par une culture cellulaire (~2 semaines), suivie d’une préparation de gel d’alginate (~60 min) pour encapsuler les cellules afin d’obtenir une mesure stable. Ensuite, l’hyperpolarisation est réalisée à l’aide d’un système de polarisation DNP (~60 min), et la mesure RMN est effectuée à l’aide d’un spectromètre RMN de 400 MHz (~5 min). Les photographies de droite montrent les instruments correspondants utilisés dans ce flux de travail. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Configuration du bioréacteur pour la mesure RMN hyperpolarisée. (A) Schéma de principe de l’installation du bioréacteur. Le milieu de culture est introduit dans le tube RMN par l’entrée A et ensuite dirigé vers les déchets. Des billes d’alginate contenant des cellules vivantes sont placées à l’intérieur du tube RMN. Lors des mesures RMN hyperpolarisées, la sonde hyperpolarisée est injectée par l’entrée B, appelée entrée de la sonde hyperpolarisée. (B) Photographie de l’ensemble de l’installation du bioréacteur, avec les tubes d’entrée et de sortie clairement étiquetés. (C) Vue rapprochée de l’interrupteur de la tubulure d’entrée, montrant l’entrée A (perfusion moyenne) et l’entrée B (injection de sonde hyperpolarisée). (D) Conception CAO et (E) Photographie représentative du composant de fixation de l’éponge imprimé en 3D placé à l’intérieur du tube RMN. Le composant comprend un trou pour guider un capillaire en verre qui délivre la solution de substrat hyperpolarisé et une plate-forme pour tenir une éponge. Le composant lui-même ne s’adapte pas étroitement à la paroi interne du tube RMN ; (F) à la place, une éponge est insérée autour de celui-ci pour combler l’espace. Cette structure stabilise le composant et permet aux déchets de s’écouler vers le haut à travers l’éponge, éliminant ainsi le besoin d’un trou de sortie supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Préparation du gel d’alginate. (A) Illustration schématique et (B) Photographie de l’appareil de formation de la boule de gel d’alginate. L’image de gauche montre l’ensemble de l’installation, y compris le tube de centrifugation avec une seringue fixée à son couvercle modifié. L’image en haut à droite montre un couvercle avec un petit trou pour l’embout de la seringue, tandis que l’image en bas à droite montre un couvercle avec une ouverture carrée pour un positionnement stable de la seringue. Le tube de centrifugation est pré-rempli de 10 ml de solution de chlorure de calcium, ce qui permet à la solution d’alginate sortant de l’extrémité de la seringue de subir une gélification, formant des boules de gel d’alginate. (C) Image microscopique représentative montrant la morphologie des billes de gel d’alginate. (D) Image microscopique représentative montrant la morphologie des boules de gel d’alginate contenant des cellules HeLa. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Représentation schématique des étapes de préparation pour la mesure RMN et l’hyperpolarisation. Au cours du processus de construction DNP de ~60 minutes, la configuration NMR est effectuée en parallèle pour minimiser les retards. La préparation implique le chargement de billes d’alginate dans le tube RMN, suivi d’un réglage de verrouillage 1H, d’un calage et d’un réglage de la sonde pour s’assurer que le système est prêt pour une mesure immédiate. Après dissolution et mélange in situ, la spectroscopie RMN 13C résolue en temps révèle des pics clairs de pyruvate et de lactate. Les pics observés à environ 171 ppm, 179 ppm et 183 ppm correspondent respectivement au pyruvate, à l’hydrate de pyruvate et au lactate. Environ 4 × 107 cellules HeLa encapsulées dans un gel d’alginate ont été utilisées pour la mesure RMN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Détection résolue dans le temps des signaux de pyruvate et de lactate lors de mesures répétées. Des spectres RMN 13C hyperpolarisés du même échantillon encapsulé dans des cellules SCCVII ont été acquis à des intervalles de 1,5 heure afin d’évaluer la faisabilité de mesures non destructives répétées. Les intensités maximales de pyruvate (cercles ouverts) et de lactate (cercles remplis, à l’échelle de 1000×) sont tracées au fil du temps pour chaque acquisition. (A) Première mesure. (B) La deuxième mesure, après 1,5 h, révèle une réduction marquée de la production de lactate. (C) La troisième mesure, après 1,5 heure supplémentaire, a confirmé une faible activité métabolique soutenue. L’analyse quantitative basée sur l’aire sous la courbe (AUC) a montré que le rapport [Lactate]/[Pyruvate] a diminué de 0,00134 (première mesure) à 0,00019 (deuxième) et 0,00027 (troisième). La concentration finale de cellules dans le gel d’alginate était d’environ 1,0 × 107 cellules/mL (4 × 107 cellules dans 4 mL). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 6 : Conversion du pyruvate en lactate dans les cellules HeLa. Des signaux RMN 13C hyperpolarisés résolus dans le temps du pyruvate et du lactate ont été mesurés dans des cellules HeLa vivantes. L’intensité du signal pyruvate est normalisée à sa valeur maximale au temps zéro. L’intensité du signal de lactate est mise à l’échelle d’un facteur de 103 pour la visibilité. L’analyse quantitative basée sur l’aire sous la courbe (AUC) a montré un rapport [Lactate]/[Pyruvate] de 0,00121. La concentration finale de cellules dans le gel d’alginate était d’environ 7,5 × 106 cellules/mL (3 × 107 cellules dans 4 mL). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Figure supplémentaire 1. Images représentatives du septum de la fiole utilisé dans le système du bioréacteur. (A) Septum en silicone/PTFE (9 mm de diamètre) avant utilisation. (B) Le même septum en utilisation réelle, avec un tube en PEEK inséré dans des trous perforés. L’élasticité du matériau du septum lui permet de se refermer autour du tube, maintenant des conditions d’étanchéité à l’air lors de l’injection de substrat hyperpolarisé. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure

Figure supplémentaire 2 : Spectre RMN 13C hyperpolarisé résolu dans le temps acquis après mélange externe. Spectre représentatif résolu dans le temps du métabolisme du pyruvate [1-13°C] mesuré à l’aide d’un système RMN de paillasse après mélange externe de pyruvate hyperpolarisé et de cellules à l’extérieur du tube RMN. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure

Dossier supplémentaire 1 : Conception CAO du support cylindrique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Étapes critiques du protocole
Le succès de ce protocole dépend de plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, il est important d’assurer une dissolution et un transfert corrects du pyruvate 13Chyperpolarisé pour maintenir un rapport signal/bruit élevé. Pour capturer la conversion métabolique précoce du pyruvate en lactate, le moment de l’injection de la sonde hyperpolarisée et de l’acquisition de la RMN doit être synchronisé. De plus, il est important de maintenir la viabilité cellulaire tout au long de l’expérience. Les écarts par rapport à ces paramètres peuvent entraîner une réduction de l’activité métabolique et une perte de signal.

Modifications et dépannage de la méthode
Bien que ce protocole offre une approche robuste pour la surveillance métabolique en temps réel, certaines modifications peuvent améliorer son applicabilité. Par exemple, le réglage de l’angle de retournement de l’acquisition RMN permet d’équilibrer l’intensité du signal et la décroissance de la polarisation afin d’optimiser la collecte de données. De plus, bien qu’une méthode ait été introduite pour préparer de manière stable des gels d’alginate d’une certaine taille, la taille des gels à créer peut être facilement ajustée en sélectionnant une seringue ou une aiguille. Cela peut contribuer à reproduire un environnement hypoxique24 en plus d’empêcher les cellules de s’échapper du tube RMN. De plus, le gel d’alginate devient dense et visqueux à l’intérieur du tube RMN, en particulier dans la zone de mesure RMN. Si de l’air pénètre lors de l’injection du milieu de culture ou de la sonde hyperpolarisée à partir du tube PEEK, il est probable qu’il reste sur le site de mesure RMN, ce qui entraînera une diminution de la qualité du spectre.

Limites de la méthode
Bien que les mesures hyperpolarisées aient l’avantage d’une sensibilité élevée des signaux RMN, elles ont des limites inhérentes. En raison de la relaxation T1 du pyruvate 13C hyperpolarisé, la durée des mesures métaboliques est limitée à environ 1 min, limitant l’observation de décalages métaboliques à long terme. De plus, il est difficile de mesurer un échantillon cellulaire plusieurs heures après qu’il a été mesuré une fois, ce qui peut être lié à l’écoulement d’une grande quantité de pyruvate en une seule mesure. C’est la même chose que le fait que des groupes apparentés ont mesuré des spectres un jour plus tard18, et l’intervalle de mesure doit être aussi long.

Importance de la méthode par rapport aux techniques existantes
Par rapport aux tests métaboliques conventionnels, notre méthode présente un avantage par rapport aux mesures finales telles que la spectrométrie de masse et les tests biochimiques en ce sens qu’elle fournit un aperçu en temps réel du métabolisme cellulaire. Bien qu’il soit possible d’obtenir des spectres RMN hyperpolarisés similaires sans utiliser de bioréacteur, la possibilité de démarrer immédiatement les mesures avec un mélange in situ est bénéfique, compte tenu de la rapidité de la relaxation. De plus, les cellules peuvent être préréglées dans un environnement stable avant l’injection, ce qui améliore la reproductibilité et la précision cinétique de l’analyse métabolique. Cet avantage est étayé par une expérience supplémentaire (figure supplémentaire 2), où des spectres résolus en temps ont été acquis à l’aide d’un système RMN de paillasse après mélange externe. Dans cette configuration, un délai d’environ 30 s entre le mélange et l’acquisition du signal a entraîné une perte de polarisation importante, affectant particulièrement la détection du lactate. Cela confirme que le mélange in situ améliore la fidélité des mesures cinétiques dans des conditions de décroissance rapide de T1 . Cependant, il convient de noter que l’intensité du signal dans cette configuration in situ était plus faible, probablement en raison de la dilution causée par la perfusion moyenne - un problème qui reste à optimiser.

Importance et applications potentielles
Cette méthode pourrait ouvrir la voie à des applications dans la compréhension des propriétés métaboliques de diverses formes de vie. La mesure en temps réel des flux métaboliques permet aux chercheurs d’évaluer dynamiquement les effets des inhibiteurs métaboliques. L’intégration de cette approche à d’autres techniques de mesure pourrait améliorer davantage la précision de l’analyse du métabolisme intracellulaire.

Nous envisageons un flux de travail expérimental pratique dans lequel la métabolomique destructrice à haut débit est utilisée pour identifier les voies candidates, suivie d’une validation en temps réel à l’aide de la RMN hyperpolarisée 13C pour évaluer la fonction enzymatique et la dynamique des flux dans les cellules vivantes. Cette approche permet de détecter directement les réponses métaboliques transitoires dans des conditions physiologiques, ce qui est difficile à réaliser à l’aide d’immunoessais ou de capteurs de fluorescence, qui mesurent généralement les niveaux de métabolites statiques ou nécessitent des sondes exogènes. Alors que l’imagerie de fluorescence et les immunoessais sont indispensables pour la localisation spatiale et le criblage à haut débit, respectivement, la RMN hyperpolarisée fournit une lecture fonctionnelle complémentaire qui capture la cinétique de réaction de manière non destructive. Cette stratégie facilite non seulement les connaissances mécanistes au niveau cellulaire, mais sert également de pont vers des applications de diagnostic à l’échelle des tissus ou de l’organisme. En particulier, la capacité de capturer les changements métaboliques fonctionnels en temps réel peut soutenir la détection précoce des troubles métaboliques et des réponses thérapeutiques dans des systèmes biologiques complexes.

Des progrès ont également été réalisés dans la mise au point de sondes métaboliques ciblant diverses voies métaboliques et de substrats synthétiques conçus pour des enzymes spécifiques, élargissant ainsi les possibilités de recherche métabolique25,26. De plus, les progrès réalisés dans les techniques d’hyperpolarisation, telles que l’administration de substrats hyperpolarisés directement du polariseur à la RMN à travers un tunnel magnétique27- peuvent améliorer la rétention du signal et élargir les applications potentielles de cette méthode dans la recherche biomédicale.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 23KJ2179 et 24K17833 (à T.U.), 23K27561 (à Y.T.) ; MEXT Q-LEAP [JPMXS0120330644 (à Y.T.)] ; et MEXT Promotion du développement d’un système conjoint d’utilisation et de recherche : Coalition des universités pour le programme d’excellence en recherche (CURE) Numéro de subvention JPMXP1323015488 (programme Spin-L n° spin24XQ007).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide pyruvique [1-13C]Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.Référence CLM-8077
Imprimante 3DElegooSaturne 2
Chlorure de calciumNacalai Tesque, Inc.06729-55
D2OSigma-Aldrich151882
Kit de circulation externe pour pompeCOMME UN1-4141-02
Sérum fœtal bovinGibco10270106
Kit de raccords sans brideGL Sciences Inc.6010-46390
Verre capillaire avec noyauNarishigeGDC-1.5Diamètre intérieur ~0,9 mm, longueur 90 mm
Pompe de circulation magnétiqueCOMME UN1-4141-01
MestReNovaMestrelab RechercheLogiciel de traitement et d’analyse spectrale RMN
Ma seringue à injectionNipro Corporation82770,5 ml/100U, 30G x 10 mm, 140 pièces
OX063  ; Oxford Instruments Co. Ltd. et Polarize IVS Co. Ltd.-
PEEK TubeCOMME UN3-780-05
Pénicilline-streptomycineNacalai Tesque, Inc.26252-94
Mini pompe bio-staltiqueATTO1221200Haute précision, type de débit large pour un débit de fluide stable
RésineSiraya TechNoir fumé
RPMI-1640 MoyenNacalai Tesque, Inc.30264-85
Septum fiole en silicone/PTFEGL Sciences Inc.1030-50009
Alginate de sodium 80-120FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation194-13321
Logiciel SPINitRS2DLogiciel RMN dans le polariseur DNP
Éponge--Éponge disponible dans le commerce, coupée à la taille pour la stabilisation du gel
Robinet d’arrêt à trois voiesCOMME UN3-6247-04
TopspinBrukerLogiciel d’acquisition et de traitement de données RMN
Trypsine-EDTA (0,25 %)Thermo Fisher Scientific07086-74
Résine durcissable aux UVBONDICBD-SKCJ
Bain-marieCOMME UN1-5832-41Robot thermique TR Series TR-1&alpha ; pour maintenir 37 ° ; Température C
Wilmad Tube RMN à bouchon à visSigmaZ271977Fréquence 400 MHz, diamètre 10 mm, L 178 mm.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of >10,000 times in liquid-state NMR. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  2. Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function. Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).
  3. Balzan, R., et al. Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR. J Vis Exp. (108), e53548(2016).
  4. Liu, M., Hilty, C. Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR. Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).
  5. Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast. Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).
  6. Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).
  7. Rao, Y., et al. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).
  8. Mathiassen, T. B. W., et al. Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system. J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).
  9. Meier, S., et al. Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life. Molecules. 29 (17), 4133(2024).
  10. Sriram, R., et al. Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate. ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).
  11. Park, J. M., et al. Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo. J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).
  12. Singh, J., et al. Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules. NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).
  13. Bohndiek, S. E., et al. Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo. J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).
  14. Yamamoto, K., et al. Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine. Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).
  15. Düwel, S., et al. Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid. Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).
  16. Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester. Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).
  17. Eills, J., et al. Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance. Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).
  18. Keshari, K. R., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism. Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).
  19. Sriram, R., et al. Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor. NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).
  20. Mangas-Florencio, L., et al. A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy. Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).
  21. Hill, D. K., et al. Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data. PLoS One. 8 (9), e71996(2013).
  22. Saito, K., et al. 13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors. Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).
  23. Sengupta, D., Pratx, G. Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI. Mol Cancer. 15, 43(2016).
  24. Read, G. H., et al. Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells. Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).
  25. Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. Hyperpolarized NMR probes for biological assays. Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).
  26. Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging. Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).
  27. Milani, J., et al. A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids. Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

M tabolisme du pyruvateSyst me de bior acteurEncapsulation cellulaireGel d alginatePolarisation nucl aire dynamiqueConversion du lactateProfilage m taboliqueCriblage de m dicaments

Articles connexes