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Article de méthode

Organoïdes cornéens dérivés de l’iPSC spécifiques au patient pour l’étude des troubles cornéens associés à l’aniridia

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DOI :

10.3791/68556

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28 juillet 2026

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1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole pour générer des organoïdes cornéens à partir de iPSC dérivés de patients aniridés, créant un modèle spécifique à chaque patient pour étudier les troubles cornéens. Ces organoïdes imitent des caractéristiques structurelles et fonctionnelles clés, offrant une plateforme in vitro fiable pour étudier les mécanismes de la maladie, tester des traitements potentiels et faire progresser des approches régénératives personnalisées pour les maladies oculaires antérieures.

Résumé

L’aniridia est une maladie oculaire congénitale rare caractérisée par l’absence partielle ou totale de l’iris, et elle est souvent associée à une opacification cornéenne et à une carence en cellules souches limbaires. Les mutations génétiques sous-jacentes, affectant principalement le gène PAX6, perturbent à la fois le développement et la fonction de la cornée. Les caractéristiques oculaires les plus courantes, en plus des défauts de l’iris, sont le nystagmus, l’hypoplasie fovéale, la cataracte, le glaucome et la kératopathie associée à l’aniridia (AAK). Bien que les modèles in vivo offrent des informations précieuses sur la pathologie de l’aniridia, les modèles in vitro dérivés des patients sont cruciaux pour étudier les mécanismes de la maladie et évaluer les thérapies potentielles. Dans cette étude, nous présentons un modèle AAK in vitro utilisant des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dérivées du patient. Notre protocole consiste à différencier progressivement les iPSC en cellules cornéennes proches de l’épithéliale au sein d’organoïdes tridimensionnels auto-assemblés, qui imitent le microenvironnement cornéen natif. Grâce à l’optimisation des conditions de culture de différenciation, nous avons réussi à générer des organoïdes cornéens qui abritent des populations cellulaires cornéennes distinctes, reprenant ainsi les attributs structurels et fonctionnels clés de la cornée humaine.

Introduction

La cornée est un tissu avasculaire et transparent formant la couche la plus externe de l’œil, composé principalement de trois couches : une couche épithéliale externe, une couche stromale contenant une matrice extracellulaire riche en collagène peuplée de kératocytes, et une couche cellulaireendothéliale 1. La cornée joue un rôle essentiel dans la vision en protégeant les structures oculaires internes et en réfractant la lumière.

L’aniridia est un trouble panoculaire congénital rare principalement causé par des mutations hétérozygotes du gène boîte apparié 6 (PAX6), un régulateur maître du développement oculaire, caractérisé par l’absence partielle ou totale de l’iris2. En plus de l’hypoplasie ou de l’absence de l’iris, la plupart des patients développent des anomalies cornéennes progressives appelées collectivement kératopathie associée à l’aniridia (AAA), qui incluent des défauts épithéliaux, un dysfonctionnement des cellules souches limbaires, des altérations stromales et une opacification cornéenne progressive, conduisant finalement à une déficience visuelle. L’AAK touche environ 78 % à 90 % des patients atteints d’aniridia, avec une gravité croissanteau fil du temps 3. Nous avons visé à établir un protocole détaillé et reproductible pour générer des organoïdes cornéens à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dérivées des patients en aniridia afin de modéliser les altérations cornéennes pertinentes pour la maladie in vitro. Bien que les modèles animaux et les études ex vivo aient fourni des informations précieuses sur la pathogenèse des aniridies, les différences spécifiques à chaque espèce et l’accès limité aux tissus des patients restreignent leur pertinence translationnelle.

Les organoïdes humains dérivés de l’iPSC se sont imposés comme des systèmes in vitro puissants pour modéliser le développement humain et les maladies 4,5. Les organoïdes cornéens, en particulier, permettent la génération de structures tissulaires tridimensionnelles ressemblant davantage à l’architecture cornéenne native, incluant l’organisation épithéliale stratifiée, les interactions stromal-épithéliales et le dépôt de matrices extracellulaires, contrairement aux cultures monocouches bidimensionnelles conventionnelles, qui manquent d’organisation spatiale, d’interactions physiologiques cellule-cellule et de complexité microenvironnementale 4,5. Plusieurs stratégies de différenciation, incluant des approches basées sur le SEAM et les progéniteurs oculaires, ont été rapportées pour générer des tissus cornéens à partir desiPSC 6. Ces approches impliquent généralement une phase initiale d’induction de la lignée oculaire, suivie d’une spécification progressive des tissus et d’une sélection parmi des populations hétérogènes de progéniteurs oculaires. La création d’organoïdes cornéens offre l’opportunité d’étudier différents types cellulaires présents dans le tissucornéen 7,8. De plus, les organoïdes cornéens dérivés de l’iPSC des patients atteints par aniridia permettent d’étudier le fond génétique de la maladie et offrent une opportunité unique d’étudier les aniridia.

Dans le protocole actuel, les lignées iPSC de type sauvage et dérivées de l’aniridia sont soumises à une stratégie de différenciation identique, en plusieurs étapes, impliquant une exposition séquentielle à la différenciation (DM), à la différenciation rétinienne (RDM) et aux milieux de différenciation cornéenne (CDM) sur une période de culture prolongée de plusieurs semaines. Une étape expérimentale cruciale est la transition de la culture adhérente vers des conditions de suspension, durant lesquelles certaines régions cornéennes sélectionnées sont maintenues afin de favoriser l’auto-organisation épithéliale.

Bien que cette approche favorise la génération reproductible de structures épithéliales cornéennes adaptées à la modélisation comparative des maladies, elle ne récapitule pas entièrement des caractéristiques complexes in vivo telles que l’innervation neuronale ou l’organisation complète des niches limbales, qui doivent être prises en compte lors de l’évaluation de l’applicabilité de la méthode.

Dans ce contexte, nous décrivons un protocole standardisé pour générer des organoïdes cornéens à partir d’iPSC dérivés du patient portant des mutations PAX6 associées à l’aniridia. Il est important de noter que la stratégie de différenciation elle-même n’est pas modifiée entre les lignées de type sauvage et dérivées de l’aniridia ; au contraire, les phénotypes spécifiques à la maladie émergent du contexte génétique spécifique au patient dans un cadre expérimental par ailleurs uniforme.

Dans l’ensemble, cette méthode offre une plateforme robuste et reproductible pour étudier le développement cornéen et les mécanismes associés à l’aniridia, et pourrait servir de base à de futures études mécanistiques et translationnelles.

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Protocole

Toutes les procédures ont été menées conformément aux directives du comité d’éthique. L’étude a été enregistrée dans la base de données du Registre des Cellules Souches Pluripotentes Humaines (hPSCreg), et les approbations éthiques ont été documentées sous le Ministère de l’Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l’Innovation (MESRI ; IE-2018-967)9. Les iPSC portent les codes AAKIPSi001-A (AAK1), AAKIPSi002-A (AAK2), AAKIPSi003-A (AAK3) et WT (provenant des donneurs de santé). De plus, le comité d’éthique de l’Université Hacettepe a approuvé l’utilisation de cette recherche, comme l’indique le numéro de référence 16969557-1213. Les lignées cellulaires humaines utilisées dans cette étude nécessitaient une autorisation réglementaire nationale au moment de l’acquisition. L’approbation a été accordée dans le cadre d’un consortium impliqué par l’un des auteurs. Bien que le présent manuscrit ne soit pas directement lié à ce projet du consortium, les matériaux biologiques utilisés ont été obtenus et autorisés dans ce cadre éthique. Par conséquent, l’approbation de cette université a été citée à juste titre afin d’assurer une transparence réglementaire totale. Tous les détails relatifs aux matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux. Toutes les procédures expérimentales étaient réalisées dans une armoire à écoulement laminaire (BSL-2) afin de maintenir un environnement stérile. Cette configuration garantit que tous les matériaux et équipements utilisés dans l’étude sont correctement stérilisés, minimisant ainsi le risque de contamination et garantissant l’intégrité des résultats expérimentaux.

1. Génération d’organoïdes cornéens dérivés des cellules souches pluripotentes humaines (hiPSC)

  1. Maintien et culture initiale de cellules souches pluripotentes humaines induites par des patients d’aniridia (AAK1, AAK2, AAK3)10 sous un milieu conditionné sans alimentation (Figure 1)
    1. Préparez à l’avance les éléments suivants : recouvrir un puits dans une plaque à 6 puits avec 1 mL d’une solution de matrice extracellulaire (ECM) glacée à une concentration de 0,1 mg/mL. Cette procédure de revêtement doit être appliquée sur glace, sans solidifier l’ECM, et doit être laissée à incuber à 37 °C pendant une durée minimale de 30 minutes, en respectant les instructions du fabricant pour garantir une préparation correcte du substrat.
    2. Dégelez une aliquote cryopréservée de 1 x 106 hiPSC (WT, AAK1, AAK2, AAK3). Ne décongelez pas complètement les cellules gelées ; Au lieu de cela, laissez la suspension cellulaire gelée dans le cryovial décongeler jusqu’à ce qu’environ la moitié du volume reste congelée.
    3. Transférer immédiatement la suspension partiellement décongelée dans 1 mL de milieu d’entretien complet à température ambiante (RT) contenant 10 μM inhibiteur de la protéine kinase associée à la Rho (ROCK), pré-aliquoté dans un tube de 15 mL. N’utilisez aucune pipette pendant le transfert.
    4. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes et jetez le surnageant.
    5. Ensuite, resuspendez les cellules dans 1 mL de milieu d’entretien complet contenant un inhibiteur de ROCK à 10 μM.
    6. Déterminez la densité cellulaire avec l’exclusion du bleu de trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre après une coloration de viabilité avec du bleu de trypan. En résumé, mélangez 20 μL de suspension cellulaire 1:1 avec 20 μL de bleu de trypan à 0,4 %, suivi d’une addition de 60 μL de PBS, ce qui donne une dilution finale 1:5 de la suspension originale de la cellule. À partir de ce mélange, chargez 10 μL dans la chambre de l’hémocytomètre. Compter les cellules viables (bleu trypan-négatif) dans quatre grands carrés. Calculez le nombre moyen de cellules par carré et multipliez par 5 (facteur de dilution en suspension cellulaire) et 10 000 pour déterminer la concentration finale de cellules (cellules/mL).
      Cellules/mL = (Nombre moyen de cellules par carré) x 5 x 104
    7. Semez les cellules sur un puits ECM pré-revêtu dans une plaque à 6 puits, assurant une densité cellulaire de 2 x 104 cellules/cm 2 par puits.
    8. Observez la morphologie et l’attache cellulaires à l’aide d’une microscopie à contraste de phase à un gros grossissement de 10x. Ensuite, incubez les plaques à 6 puits à 37 °C avec 5 % de CO₂ pour assurer des conditions de croissance optimales.
      REMARQUE : L’inhibiteur de ROCK ne doit être utilisé que pendant la nuit lors de la transmission ou de la décongélation des cellules. Lors des changements quotidiens de substrat, ajoutez doucement le substrat le long de la paroi du puits. Évitez de chauffer un milieu d’entretien complet dans un bain-marie ; Au lieu de cela, équilibrez le milieu à température ambiante pendant 15 minutes avant utilisation.
  2. Phase de différenciation spontanée (Jour 0 – 2)
    1. Préparez le milieu de différenciation (DM) en mélangeant les éléments suivants : remplacement sérique KnockOut à 8 % (KSR), 1x acides aminés non essentiels (NEAA), 1x Glutammax, 1x pénicilline-streptomycine, et le mélange modifié Eagle’s Medium/Nutriment F-12 Ham (DMEM/F-12) de Dulbecco.
    2. Une fois que les cultures hiPSC atteignent environ 70 % à 80 % de confluence, pour induire une différenciationspontanée 8, aspirez doucement et jetez complètement le milieu, puis remplacez-le quotidiennement par 1 mL de DM frais par puits jusqu’au jour 3, lorsque la phase de différenciation rétinienne est lancée selon le calendrier expérimental.
  3. Phase de différenciation rétinienne (jour 3 – 47)
    REMARQUE : Le milieu de différenciation rétinienne est utilisé pendant de longues périodes afin de permettre la formation de populations hétérogènes de progéniteurs oculaires.
    1. Préparez le milieu de différenciation rétinienne (RDM) en mélangeant les éléments suivants : 8 % KSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 2 % B27, 1x Penicillin-Streptomycine et DMEM/F-12.
    2. Après 2 jours de différenciation spontanée, rafraîchez quotidiennement le milieu de culture en aspirant soigneusement le milieu DM et en le remplaçant par 1 mL de substrat RDM frais par puits. Continuez ainsi pendant un total de 30 jours.
      REMARQUE : Une augmentation significative de la densité cellulaire est attendue durant cette période de 30 jours. Il est essentiel d’effectuer des observations microscopiques de la densité cellulaire dans différentes zones de chaque puits. Pour éviter le soulèvement cellulaire, il faut éviter de se laver et faire attention lors des changements de milieu. Ajoutez le substrat à travers la paroi du puits. Équilibrez le milieu à la RT pendant 15 minutes avant utilisation.
    3. Au jour 32, les cellules atteignent un état apparent de confluence et forment des agrégats 2,5D multicouches. À ce stade, initiez la transition vers la culture en suspension en grattant doucement tout le puits à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL. Au cours de ce processus, fragmentez la couche cellulaire en petits groupes.
      REMARQUE : Bien que toutes les cellules soient libérées de la surface de culture, les agrégats multicouches 2,5D sont préférentiellement collectés et transférés en culture en suspension (Figure supplémentaire 1), car leur enrichissement favorise un auto-assemblage plus rapide et la formation d’organoïdes plus grands comparativement aux cellules uniques ou aux fragments monocouches.
    4. Immédiatement après le grattage, on collecte les grappes cellulaires résultantes et on les transfère dans des plaques de culture à faible attachement à 6 puits contenant du RDM afin d’établir les conditions de culture en suspension.
    5. Maintenir les cellules en culture en suspension pendant 15 jours supplémentaires, avec un remplacement quotidien du milieu en utilisant 2 mL de RDM frais par puits. Durant les deux premiers jours de culture en suspension, évitez le changement de milieu pour éviter la perte de petits groupes cellulaires. Lors de la culture en suspension, les cellules s’auto-organisent progressivement et donnent naissance à des structures 3D, transparentes, semblables à une cornée, régulièrement surveillées par microscopie à contraste de phase à 4x et 10x.
  4. Phase de différenciation cornéenne (jours 48 – 90)
    1. Préparez le milieu de différenciation cornéenne (CDM) en mélangeant les éléments suivants : 8 % de KOSR, 1 x NEAA, 1 x Glutamax, 1 x N2-MAX, 1x insuline-transférrine-sélénium, 5 ng/mL FGF2, 10 ng/mL EGF et DMEM/F-12.
    2. Après les 15 premiers jours (du jour 32 au jour 47) de culture en suspension dans des plaques à faible attachement (37 °C, 5 % CO₂), remplacer le RDM par le CDM tout en maintenant les granulats en conditions de suspension au jour 47. Renouvelez le CDM tous les deux jours avec 2 mL par puits, afin de garantir que les organoïdes sont toujours complètement immergés dans le milieu de culture. Durant cette période, des structures primordiales cornéennes (CP) transparentes et en forme de bulle émergent progressivement.
    3. Poursuivre la culture en suspension en CDM jusqu’au jour 90, permettant une maturation supplémentaire et une ségrégation spatiale des régions CP transparentes à partir de compartiments tissulaires plus opaques.
    4. Au jour 90, séparez mécaniquement les régions transparentes de la CP des compartiments tissulaires plus opaques à l’aide de pinces et de pinces stérilisées lorsque des analyses en aval spécifiques à la CP sont prévues.
      REMARQUE : L’isolation mécanique des régions CP est réalisée lorsque les analyses nécessitent spécifiquement des structures enrichies en CP. Si d’autres compartiments tissulaires ou l’architecture organoïde globale sont d’intérêt, les organoïdes peuvent être maintenus intacts afin de préserver l’hétérogénéité structurelle.
    5. Poursuivre la culture en suspension dans le CDM pour les structures CP isolées ou les organoïdes intacts, selon l’objectif expérimental.

2. Caractérisation des organoïdes cornéens

  1. Évaluation morphologique et structurale des organoïdes
    1. Surveillez régulièrement les organoïdes cornéens à l’aide de la microscopie en champ clair aux grossissements 4x et 10x. Évaluer la taille, la transparence et la morphologie globale à des moments définis et documenter les changements structurels par acquisition d’images.
  2. Caractérisation basée sur l’immunofluorescence
    1. Fixation organoïde cornée
      1. Préparez des solutions de 4 % de PFA et 30 % de saccharose avant la fixation. Prenez l’organoïde cornéen issu de la culture avec une cuillère autoclavée. Transférez l’organoïde dans le PFA à 4 % dans un tube de 1,5 mL et faites couver pendant 20 minutes à température ambiante.
      2. Après l’incubation, éliminez soigneusement le PFA du tube sans endommager l’organoïde cornéen. Ajoutez 1 mL de solution de saccharose à 30 % dans le tube et placez-le à 4 °C. Après 24 heures, préparez et identifiez des tubes de 5 mL et de l’azote liquide pour la fixation de l’OCT.
      3. Jetez soigneusement la solution de saccharose du tube. Transférez l’organoïde dans la cuillère stérile. Avec une pipette de 20 μL, retirez soigneusement l’excès de solution de saccharose de l’organoïde.
      4. Versez de l’OCT dans le bouchon tubulaire de 5 mL, puis placez l’organoïde dans l’OCT. Utilisez une autre cuillère stérile pour transférer l’organoïde dans le bouchon contenant l’OCT.
      5. Ajoutez l’OCT pour recouvrir la surface de l’organoïde cornéen. Insérez les ballons dans l’OCT avec une aiguille pour obtenir des sections claires de l’organoïde.
      6. Fermez le bouchon des tubes de 5 mL et utilisez une pince à épiler pour tremper dans l’azote liquide. Conservez les échantillons à -20 °C jusqu’à la coupe.
      7. Séparez-les à une épaisseur de 5 μm à l’aide d’un cryostat et conservez-les également à -20 °C jusqu’à la coloration. Maintenez une épaisseur de section et une orientation tissulaire constantes pour garantir une coloration reproductible.
    2. Coloration IF
      1. Pour préparer les sections organoïdes cornéennes à la coloration IF, lavez les lames 3 fois avec PBS-T (0,3 % Triton X-100) à RT pendant 10 minutes.
      2. Nettoyez la lame avec du papier de soie et faites une bordure avec un stylo PAP. Ajouter une quantité appropriée de solution bloqueante pour couvrir complètement la section tissulaire (généralement 100 à 200 μL par lames, selon la limite du stylo PAP) et l’incuber à la RT pendant 1 heure.
      3. Aspirez la solution de blocage et tracez une bordure avec le stylo PAP. Ajoutez les 150 μl de solutions primaires Ab (PAX6, p63, OCT3/4, NANOG, Na+/K+-ATPase, AQP1, CK3, CK5, CK14, CK19, N-cad, KERA, COLIV, les taux de dilution sont listés dans le tableau des matériaux) sur la lame et incubez-la à RT pendant 1 heure.
      4. Laver 2 fois avec PBS-T (0,3 % Triton X-100) à RT pendant 10 minutes. Refais la bordure avec un stylo PAP.
      5. Ajoutez les 150 μl de solution secondaire d’Ab (Anti Rabbit-488, Anti Mouse-594, les taux de dilution sont indiqués dans le tableau des matériaux) sur la lame et faites-la couver à RT dans des conditions sombres pendant 2 heures. Laver 2 fois avec PBS-T (0,3 % Triton-X) à la rétention pendant 10 minutes. Nettoyez les lames et montez avec une solution DAPI.
      6. Pour les iPSC non différenciés, effectuez le blocage et la perméabilisation après fixation et procédez à la coloration en utilisant le même protocole. Visualisez des échantillons colorés à l’aide de la fluorescence ou de la microscopie confocale à un gros grossissement 4x et 10x.

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Résultats

Tige des cellules souches pluripotentes induites par l’humain (hiPSC)

Pour évaluer la tige des iPSC humaines utilisées dans les expériences, nous avons réalisé des images en champ clair, des immunocolorations et des analyses qRT-PCR. Nous avons évalué l’expression des marqueurs clés de pluripotence, notamment OCT3/4, SOX2 et NANOG, qui sont des facteurs de transcription essentiels nécessaires au maintien de la pluripotence et de l’aut...

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Discussion

L’analyse comparative entre les organoïdes témoins et ceux dérivés de patients aniridiaux révèle des défauts de stratification épithéliale, un dépôt anormal de la matrice extracellulaire et une expression dérégulée du gènePAX6 9.

Le taux de croissance des iPSC dérivés de différents échantillons de patients avec aniridia, en particulier les lignées AAK1, AAK2 et AAK3, présente une variabilité, reflétant potentiellement la divers...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne l’ont pas divulgué.

Remerciements

Cette étude est financée par TÜBİTAK 121N276 et le Programme européen conjoint sur les maladies rares, et partiellement soutenue par l’Union européenne (Programme de chaires Horizon 2020 ERA, subvention du projet RareBoost n° : 952346). L’A.C.K. est soutenue par la bourse de doctorat YÖK 100/2000 et les bourses TÜBİTAK-BİDEB 2211A.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 mL serological pipettesZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL Conical Tubes Labselect CT-002-15A
2 mL serological pipettesLabselect Labselect SP-003-2
5 mL serological pipettesCleanteksBiofil GSP010005
50 mL Conical TubesGolden Gate CT-002-50
50 mL serological pipettesBIOFILLGSP020050
Anti Mouse 594Jackson Immuno715-585-150Dilution Range: 1:100 - 1:800
Anti Rabbit 488 Jackson Immuno711-545-152Dilution Range: 1:100 - 1:800
Autoclave VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 SupplementGIBCO12587010avec vitamine A
Benchtop CentrifugeEppendorf5702
Benchtop microscope DMI1OlympusCKX41
Biological Safety Cabinets Class IIThermoSafe 2020
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Coverslips 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
CryovialBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390.5 ug/mL
DMEM/F12 MediaGIBCO 31330-038
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
Ethanol 100%Sigma64-17-5
Ethanol 70%Sigma64-17-5Ethanol dilutions
Extracellular Matrix (ECM)Corning354277LDEV-free
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
IncubatorMemmert INCO 153 med44043
Insulin-Selenium-TransferrinGIBCO41400045
KnockOut Serum (KOSR)GIBCO10828028
Microtome RM2235LeicaRM2235
Mounting mediumabcamab104135
mTSER MediaSTEMCELL85850
Mutiwell Culture Plates (6-well)CORNING   3516
N2 SupplementR&DAR003
Non-essential amino acids (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 and P1000 pipettesGilsonF167350
ParaffinVWR chemicals10048502
Paraformaldehyde Sigma-AldrichF8775
Primer Antibody Aquaporin mAbabcamab9566Dilution Range: 1:50-1:200
Primer Antibody CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253Dilution Range: 1:50-1:500
Primer Antibody CK19ProteinTech14965-1-APDilution Range: 1:150-1:600
Primer Antibody CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 MLDilution Range: 1:50-1:200
Primer Antibody CK5Thermo MA517057Dilution Range: 1:200-1:1000
Primer Antibody Collagen Type IVabcamab6586Dilution Range: 1:100-1:500
Primer Antibody KeratocanBiossbs-11054RDilution Range: 1:50-1:200
Primer Antibody Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712Dilution Range: 1:50-1:500
Primer Antibody N-Cadherinabcamab76011Dilution Range: 1:50-1:500
Primer Antibody p63SANTACRUZ   sc-25268Dilution Range: 1:50-1:500
Primer Antibody Pax6NovusNBP2-44576Dilution Range: 1:50-1:200
RNA isolation kitMacherey–Nagel 740984.50
Rock Inihibitor (Y-27632)TOCRIS1254
SlidesStarFrostMBB-0302-55AAdhesive, ground
Stainless steel forceps no:5Sigma F6521-1EA
Stainless Stell Scalpel Sterile N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA Synthesis Kit Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol reagentThermo15596026
Trypan blueGIBCO15250061
Ultra low attachment (ULA) 6-well  plate Corning3471
Water bathNüveNb9

Références

  1. Hassell, J. R., Birk, D. E. The molecular basis of corneal transparency. Exp Eye Res. 91 (3), 326-335 (2010).
  2. Daruich, A., et al. Congenital aniridia beyond black eyes: From phenotype and novel genetic mechanisms to innovative therapeutic approaches. Prog Retin Eye Res. 95, 101133(2023).
  3. Eden, U., Riise, R., Tornqvist, K. Corneal involvement in congenital aniridia. Cornea. 29 (10), 1096-1102 (2010).
  4. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  7. Foster, J. W., et al. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 7, 41286(2017).
  8. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
  9. Koc, A. C., et al. Patient-derived cornea organoid model to study metabolomic characterization of rare disease: aniridia-associated keratopathy. BMC Ophthalmol. 25 (1), 14(2025).
  10. Ilmarinen, T., et al. Production and Limbal Lineage Commitment of Aniridia Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 41 (12), 1133-1141 (2023).
  11. Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
  12. Okur, F. V., Cevher, I., Ozdemir, C., Kocaefe, C., Cetinkaya, D. U. Osteopetrotic induced pluripotent stem cells derived from patients with different disease-associated mutations by non-integrating reprogramming methods. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 211(2019).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Lima Cunha, D., Arno, G., Corton, M., Moosajee, M. The Spectrum of PAX6 Mutations and Genotype-Phenotype Correlations in the Eye. Genes (Basel). 10 (12), 1050(2019).
  15. Hayashi, R., et al. Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature. 531 (7594), 376-380 (2016).
  16. Gonzalez, G., Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Limbal stem cells: identity, developmental origin, and therapeutic potential. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (2), (2018).
  17. Ji, H. P., et al. MicroRNA-28 potentially regulates the photoreceptor lineage commitment of Muller glia-derived progenitors. Sci Rep. 7 (1), 11374(2017).
  18. Hatou, S., et al. Role of insulin in regulation of Na+-/K+-dependent ATPase activity and pump function in corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (8), 3935-3942 (2010).
  19. Higa, K., et al. Aquaporin 1-positive stromal niche-like cells directly interact with N-cadherin-positive clusters in the basal limbal epithelium. Stem Cell Res. 10 (2), 147-155 (2013).
  20. Chen, Q., et al. Stromal fibroblasts derived from mammary gland of bovine with mastitis display inflammation-specific changes. Sci Rep. 6, 27462(2016).
  21. Soiberman, U., Foster, J. W., Jun, A. S., Chakravarti, S. Pathophysiology of Keratoconus: What Do We Know Today. Open Ophthalmol J. 11, 252-261 (2017).
  22. Lima Cunha, D., et al. Restoration of functional PAX6 in aniridia patient iPSC-derived ocular tissue models using repurposed nonsense suppression drugs. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 240-253 (2023).
  23. Harding, P., et al. Variant-specific disruption to notch signalling in PAX6 microphthalmia and aniridia patient-derived hiPSC optic cup-like organoids. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (6), 167869(2025).
  24. Cunha, D. L., Smits, J., Zhou, H. Q., Moosajee, M. Transcriptomic analysis of aniridia iPSC-derived limbal epithelial stem cells reveals early changes linked to the limbal niche. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2821(2023).
  25. Harding, P., et al. Generation of human iPSC line (UCLi013-A) from a patient with microphthalmia and aniridia, carrying a heterozygous missense mutation c.372C>A p.(Asn124Lys) in. Stem Cell Res. 51, (2021).
  26. Theerakittayakorn, K., et al. Differentiation Induction of Human Stem Cells for Corneal Epithelial Regeneration. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  27. Bar-Nur, O., et al. Small molecules facilitate rapid and synchronous iPSC generation. Nat Methods. 11 (11), 1170-1176 (2014).
  28. Maiti, G., et al. Single cell RNA-seq of human cornea organoids identifies cell fates of a developing immature cornea. PNAS Nexus. 1 (5), pgac246(2022).
  29. Dorot, O., et al. The antipsychotropic drug Duloxetine rescues PAX6 haploinsufficiency of mutant limbal stem cells through inhibition of the MEK/ERK signaling pathway. Ocul Surf. 23, 140-142 (2022).
  30. van Velthoven, A. J. H., et al. Future directions in managing aniridia-associated keratopathy. Surv Ophthalmol. 68 (5), 940-956 (2023).
  31. Kocak, G., et al. Generation of Anterior Segment of the Eye Cells from hiPSCs in Microfluidic Platforms. Adv Biol (Weinh). 8 (5), e2400018(2024).

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