Flux de travail optimisé pour l’isolement et la culture à long terme de cellules de gliome dérivées de patients en conservant les caractéristiques tumorales d’origine

Résumé

Cette étude présente un protocole standardisé pour établir des lignées cellulaires de gliome dérivées de patients (PDGC), garantissant leur fidélité génétique et phénotypique. Le système de culture adhérente assistée par extrait de matrice de membrane basale améliore la croissance et l’homogénéité cellulaires, ce qui rend ces modèles précieux pour le criblage de médicaments et la recherche sur le GBM.

Résumé

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primitive la plus agressive, caractérisée par une grande hétérogénéité et une résistance aux traitements standard. Les lignées cellulaires de gliome traditionnelles ne parviennent souvent pas à conserver les caractéristiques génétiques et phénotypiques spécifiques au patient, ce qui limite leur pertinence translationnelle. Pour résoudre ce problème, nous avons établi 50 lignées cellulaires de gliome dérivées de patients (PDGC) à l’aide d’un système de culture de cellules souches neurales sans sérum. Ce protocole décrit la collecte, le traitement et la culture à long terme d’échantillons tumoraux obtenus chez des patients atteints de GBM, garantissant ainsi la préservation des caractéristiques moléculaires clés. Notre méthodologie comprend la dissociation enzymatique des tissus, la lyse des globules rouges et la culture adhérente assistée par extrait de matrice de membrane basale, ce qui améliore la viabilité cellulaire et facilite le criblage de médicaments à haut débit. La caractérisation des PDGC par séquençage du génome entier et transcriptomique et coloration par immunofluorescence confirme leur rétention des altérations génétiques courantes du GBM et des marqueurs de cellules souches neurales et de progéniteurs. De plus, ces cellules présentent un potentiel tumorigène dans les modèles de xénogreffes. En optimisant les conditions de culture, ce protocole fournit un cadre standardisé pour générer des modèles de GBM biologiquement pertinents afin de soutenir la découverte thérapeutique et les études mécanistes.

Introduction

Le gliome, la tumeur intracrânienne primitive la plus courante, provient de cellules souches neurales ou de cellules progénitrices qui ont subi des mutations génétiques¹. L’Organisation mondiale de la santé classe les gliomes de grades 1 à 4 en fonction de caractéristiques pathologiques et moléculaires, allant de bas grade à^{haut grade 2}. Le glioblastome (GBM), un gliome de grade 4, représente environ 57 % de tous les gliomes et 48 % de toutes les tumeurs malignes primitives du système nerveux central³. Les patients atteints de GBM ont un mauvais pronostic, avec une durée de survie médiane inférieure à 2 ans et un taux de survie à 5 ans de seulement 5,4 %⁴. Le traitement standard implique une résection maximale sûre suivie d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie au témozolomide⁵. Malgré ces interventions, le GBM reste incurable en raison de sa nature infiltrante et de sa résistance inhérente aux thérapies, créant un besoin urgent de nouvelles approches de traitement.

Les chercheurs utilisent couramment des lignées cellulaires tumorales dérivées de l’homme comme modèles pour étudier le développement du cancer et les mécanismes thérapeutiques. Cependant, les lignées cellulaires de gliome classiques maintenues dans un milieu contenant du sérum et largement transmises in vitro présentent des altérations significatives des caractéristiques phénotypiques et des profils génétiques par rapport aux tumeurs des patients ^6,7,8. Par conséquent, les modèles de dépistage précliniques basés sur ces lignées cellulaires ne parviennent souvent pas à identifier des cibles thérapeutiques et des molécules qui se traduisent efficacement dans les milieux cliniques. Le succès du traitement du GBM est encore compliqué par l’hétérogénéité et la plasticité tumorale⁹. Cette hétérogénéité se manifeste non seulement dans les sous-types transcriptomiques (par exemple, proneural, mésenchymateux), mais aussi dans les divers états de développement des cellules constitutives¹⁰. Le GBM utilise des mécanismes neurodéveloppementaux et contient des sous-populations de cellules souches de glioblastome (GSC) qui entraînent la prolifération tumorale et présentent une résistance accrue à la radiothérapie et à la chimiothérapie^11,12. La culture de cellules de gliome dérivées de patients dans un milieu de cellules souches neurales sans sérum préserve efficacement le spectre de mutation et les modèles d’expression génique de la tumeur d’origine tout en conservant des caractéristiques partielles de GSC⁸.

Par rapport aux modèles de culture de la neurosphère, la culture adhérente assistée par extrait de matrice de membrane basale favorise une croissance cellulaire plus stable et plus rapide, ce qui la rend plus adaptée au criblage chimique et génétique¹³. À l’aide de cette approche, nous avons établi 50 lignées cellulaires de GBM dérivées de patients et les avons caractérisées par le séquençage du génome entier, le séquençage transcriptomique et le criblage de la bibliothèque de médicaments de la FDA afin d’explorer des stratégies thérapeutiques potentielles. Cette ressource fait progresser la recherche sur le gliome, avec des résultats détaillés publiés dans nos études précédentes¹⁴. Nous décrivons ici la méthodologie utilisée pour développer des lignées cellulaires de gliome dérivées de patients (PDGC).

Protocole

Ce protocole utilise des échantillons de tissu et de sang de gliome dérivés de patients obtenus grâce à des collaborations hospitalières. Toutes les procédures d’échantillonnage et les protocoles expérimentaux ont reçu l’approbation du Comité d’éthique de l’hôpital Tiantan de Pékin, Université de médecine de la capitale (KY 2020-093-02 et KY 2014-021-02). Les patients fournissent un consentement éclairé signé avant l’opération, et toutes les informations d’identité sont anonymisées avant que les échantillons ne soient transférés au laboratoire. Les chercheurs doivent obtenir l’approbation du comité d’éthique de leur établissement et obtenir le consentement du patient avant de mettre en œuvre ce protocole.

1. Préparation avant le traitement de l’échantillon

1. Stérilisez les ciseaux, les pinces à épiler et autres instruments par autoclavage.
2. Préparez le milieu de culture PDGC en combinant 47,5 ml de DMEM/F12, 500 μL de N2, 1 ml de B27, 500 μL de 100x pénicilline/streptomycine, 250 μL de 100x substitut de glutamine, 100 μL de 2,5 M HEPES, 100 μL de glucose à 30 %, 50 μL de 50 mM de β-mercaptoéthanol, 1,5 ml de facteur de croissance épidermique (EGF) de 1 μg/mL, et 1,5 mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) de 1 μg/mL.
3. Préparez 1 tampon de lyse des globules rouges (ACK) en dissolvant 8,29 g de chlorure d’ammonium, 1 g de bicarbonate de potassium et 37 mg d’EDTA dans de l’eau, puis en diluant à 1 L.
4. Placez les instruments stérilisés, le tampon PBS, les conteneurs à déchets, les tubes à centrifuger et autres fournitures dans une enceinte de biosécurité et effectuez une désinfection par UV pendant 30 min.
5. Placez l’azote liquide dans un récipient isotherme.

2. Prélèvement d’échantillons de patients

REMARQUE : Effectuez toutes les procédures de prélèvement de tissus dans des conditions de stérilité strictes afin d’éviter la contamination bactérienne des cultures cellulaires ultérieures. Maintenez une technique aseptique tout au long du flux de travail.

1. Prélever des échantillons de sang avant l’opération et exciser le tissu tumoral du cerveau du patient. Pour les tumeurs de grande taille et hautement infiltrantes où il est difficile de distinguer la tumeur des tissus normaux environnants, maximisez la résection du tissu péritumoral tout en préservant les zones cérébrales fonctionnelles critiques. Séparez environ 500 à 2 000^mm3 de tissu tumoral et placez-le dans des tubes à centrifuger de 15 ml contenant 10 ml de milieu de conservation hypothermique.
2. Scellez les tubes d’échantillons, placez-les dans une glacière et transportez-les rapidement au laboratoire pour traitement.
   REMARQUE : S’assurer que l’intervalle entre le prélèvement et le traitement de l’échantillon ne dépasse pas 6 h à 4 °C. Lors du prélèvement de l’échantillon, excluez soigneusement les tissus brûlés et les zones de nécrose tumorale. La surface des incisions tissulaires est souvent brûlée par le couteau électrique utilisé pendant la chirurgie, ce qui peut compromettre la viabilité cellulaire en culture.

3. Traitement des échantillons de sang

1. Centrifugez les tubes d’échantillon de sang à 1 000 × g pendant 10 min et jetez la couche supérieure de plasma.
2. Transférez le reste des globules blancs et des globules rouges dans un tube à centrifuger de 50 ml. Ajouter 10 ml de 1x ACK et incuber à température ambiante pendant 5 min pour lyser les globules rouges.
3. Ajouter 40 ml de PBS pour terminer la lyse, mélanger doucement et centrifuger à 1 000 × g pendant 10 min.
4. Jetez le surnageant, ajoutez 3 ml de 1x ACK et incubez à température ambiante pendant 5 minutes pour une deuxième étape de lyse des globules rouges.
5. Ajouter 12 ml de PBS pour terminer la lyse, mélanger doucement et centrifuger à 1 000 × g pendant 10 min.
6. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule mononucléée du sang périphérique (PBMC) dans 1 mL de PBS, transférer dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger à 510 × g pendant 10 min.
7. Jetez le surnageant, congelez la pastille de PBMC dans de l’azote liquide et conservez-la à -80 °C.

4. Traitement des tissus tumoraux

1. Retirez la solution de préservation des tissus du tube d’échantillon et lavez les tissus dans du PBS pour éliminer les caillots sanguins visibles et les tissus nécrotiques. Effectuez un deuxième lavage PBS sur le tissu restant.
2. Découper la partie la plus intacte du tissu et fixer pendant la nuit dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 °C.
   REMARQUE : La taille du tissu fixé est d’environ 10 mm. Ignorez cette étape si l’échantillon est petit.
3. Coupez 2 à 4 petits morceaux de tissu, transférez-les dans un tube à centrifuger de 1,5 ml, congelez-les dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C.
   REMARQUE : La taille des petits morceaux de tissu varie généralement de 5 à 10 mm, selon la quantité d’ADN et d’ARN requise pour le séquençage.
4. Placez le tissu tumoral restant dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et coupez-le en une pâte fine à l’aide de ciseaux tout en le gardant sur de la glace.
5. Ajouter 1 à 3 ml de solution de décollement cellulaire et transférer le tissu haché dans le tube de digestion. Digérer le tissu à l’aide d’un dissociateur tissulaire à 37 °C pendant 16 min.
6. Ajoutez 3 fois plus de PBS pour arrêter la digestion et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger avec une crépine de 70 μm. Broyez doucement le tissu à travers la passoire à l’aide d’une petite tige pour maximiser la collecte de cellules. Centrifuger à 510 × g pendant 10 min et retirer le surnageant.
7. Ajouter 1 à 3 ml de 1x ACK et incuber à température ambiante pendant 5 minutes pour lyser les globules rouges. Ajouter 4 fois plus de PBS pour arrêter la lyse, mélanger doucement et centrifuger à 510 × g pendant 10 minutes pour éliminer le surnageant.
8. Remettre les cellules en suspension dans le milieu PDGC et ensemencer une partie de la suspension cellulaire dans des plaques de culture. Placez les plaques dans un incubateur hypoxique à 37 °C. Congelez les cellules restantes dans un milieu de culture contenant 10 % de DMSO.
   REMARQUE : En règle générale, pour les échantillons de tissus mesurant environ 10 à 20 mm, nous ensemenceons environ 1/3 à 1/10 de la suspension cellulaire dans une boîte de 6 cm avec 3 ml de milieu de culture, et les cellules restantes sont cryoconservées dans 2 à 4 flacons, selon le rendement cellulaire.
9. Enduisez les plaques en ajoutant de l’extrait de matrice de membrane basale à du PBS glacé dans un rapport de 1:100 et incubez les plaques à température ambiante sur un incubateur à agitation pendant 2 h. Jetez le PBS avant d’ajouter le milieu de culture PDGC.
   REMARQUE : Effectuez tous les passages cellulaires et la culture ultérieurs à l’aide de plaques recouvertes d’un extrait de matrice de membrane basale.
10. Après 2 jours, transférez les cellules cultivées sur des plaques recouvertes d’extrait de matrice de membrane basale pour permettre l’adhésion et la croissance cellulaires.

5. Culture cellulaire et passage

1. Une fois que les cellules adhèrent aux plaques de culture, retirez les cellules non adhérentes et remplacez ou complétez le milieu de culture tous les 2-3 jours.
   REMARQUE : La capacité d’adhésion varie entre les différentes cellules. Même en présence d’extrait de matrice de membrane basale, une petite fraction de cellules peut rester non adhérente, comme BNI7-11, qui nécessite une culture en suspension continue. De plus, certaines cellules présentent un modèle de croissance semi-adhérent, comme BNI20. Par conséquent, une observation minutieuse de l’état cellulaire est essentielle. Pour les cellules non adhérentes, une augmentation des cellules en suspension peut être notée. Si les agrégats cellulaires apparaissent sous la forme de structures sombres, semblables à du coton, et ne montrent aucun changement significatif au fil du temps, ils sont généralement incapables d’expansion à long terme.
2. Lorsque les cellules atteignent la confluence, ajoutez une solution de dissociation cellulaire pour détacher les cellules. Mettre fin à la dissociation avec 3x PBS et centrifuger à 250 × g pendant 3 min. Passez les cellules dans un rapport de 1:2 à 1:4. Congelez les cellules restantes dans un milieu de culture contenant 10 % de DMSO.
3. Continuez à passer pendant au moins 10 à 20 générations pour établir une lignée cellulaire stable.
   1. Documentez la morphologie cellulaire avec des images lors de chaque passage et notez les numéros de passage. Étiquetez clairement la congélation initiale de la cellule avec des informations détaillées (par exemple, les numéros de passage).
   2. Une fois la lignée cellulaire stabilisée, prélever 2 à 3 tubes de pastilles de cellules (300 000 à 1 000 000 000 cellules/tube) et les stocker à -80 °C.

6. Opérations expérimentales ultérieures

1. Pour les échantillons fixés au PFA, après une fixation pendant la nuit, déshydrater les échantillons à travers une série graduée de solutions d’éthanol par immersion séquentielle dans de l’éthanol à 60 %, de l’éthanol à 70 %, de l’éthanol à 80 %, de l’éthanol à 90 %, de l’éthanol à 95 % et deux changements d’éthanol à 100 %, chacun pendant 40 min. Par la suite, éclaircir les échantillons en deux changements de xylène, chacun pendant 40 min, puis infiltrer avec deux changements de solution de paraffine, chacun pendant 40 min. Enfin, intégrez les échantillons déshydratés et infiltrés dans des blocs de paraffine pour une section et une coloration ultérieures¹⁵.
2. Pour les granules PBMC, les tissus tumoraux ou les échantillons de cellules tumorales stockés à -80 °C, extrayez de l’ADN et de l’ARN pour diverses études omiques, y compris le séquençage du génome entier, le séquençage de l’exome, le séquençage de l’ARN en vrac et le séquençage de l’ARN unicellulaire, selon les besoins.
3. Utilisez des lignées cellulaires PDGC stables pour l’établissement de modèles de xénogreffes de souris, le criblage de médicaments à haut débit, la recherche sur les mécanismes et d’autres expériences connexes.
   1. Pour établir le modèle de xénogreffe orthotopique intracrânienne de PDGC, dissociez et comptez les cellules, puis remettez-les en suspension dans un mélange 1:1 d’extrait de matrice de membrane basale et de PBS glacé jusqu’à une concentration finale de 100 000 cellules/μL. Injectez 5 μL de suspension cellulaire de manière stéréotaxique dans le striatum gauche de souris immunodéficientes âgées de 6 à 8 semaines à l’aide d’une microseringue et d’un instrument stéréotaxique standard. Réglez les coordonnées d’injection par rapport au bregma comme suit : +0,5 mm avant-postérieur (AP), -1,9 mm médial-latéral (ML) et -3,6 mm dorsal-ventral (DV).
   2. Générer des PDGC exprimant la luciférase et établir des xénogreffes intracrâniennes pour l’imagerie par bioluminescence de la croissance tumorale.
      1. Empaquetez le gène rapporteur luciférase-tdTomato dans des particules lentivirales, puis infectez les PDGC avec le lentivirus emballé pour établir une expression stable¹⁶.
      2. Après l’infection, trier les cellules tdTomato positives par cytométrie en flux pour obtenir une population cellulaire stable exprimant la luciférase.
      3. Avant l’imagerie, injecter la D-luciférine par voie intrapéritonéale à une dose de 10 μL/g de poids corporel à l’aide d’une solution de D-luciférine de 15 mg/mL. Anesthésez les souris avec de l’isoflurane et attendez 10 min après l’injection de D-luciférine. Placez les souris dans le système d’imagerie par bioluminescence. Réglez le temps d’exposition sur le mode automatique pendant l’imagerie¹⁷.

Résultats

La figure 1 fournit une vue d’ensemble complète du flux de travail du protocole. Les échantillons de patients comprennent du sang périphérique et du tissu tumoral. Les échantillons de sang subissent une centrifugation pour éliminer le plasma, suivie de deux cycles de lyse ACK pour obtenir des PBMC qui servent de témoins pour les analyses de séquençage. Les échantillons de tumeurs sont lavés au PBS pour éliminer les caillots sanguins et les zones nécrotiques avant d’être transformés en petits...

Discussion

L’hétérogénéité du GBM présente d’importants défis de traitement. Les lignées cellulaires conventionnelles de GBM développent souvent des fonds génétiques homogènes et perdent les caractéristiques tumorales des patients après une culture prolongée dans un milieu contenant du sérum, ce qui limite leur valeur translationnelle. L’optimisation des conditions de culture du GBM et la standardisation des flux de travail de traitement des échantillons de patients sont essentielles pour maximiser...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
70 &mu ; Matrice de cellules m	Falcon	352350
Solution de détachement de cellules d’accutase	BioLegend	423201
Chlorure d’ammonium	Aladdin	60-92-4
Anticorps anti-Sox2	Merckmillipore	AB5603
Milieu de montage anti-décoloration avec DAPI	Beyotime	P0131
Anticorps anti-nestine	NOVUS	NB100-1604
B27 sans supplément de vitamines	Gibco	12587010
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer	BD Biosciences	/
Boîte de culture cellulaire	NEST	705001
D-Luciferin, Sel de potassium	Invitrogen	L2916
DMEM/F12 Gibco		C11330500BT
DMSO	Sinopharm	30072418
EDTA	BBI Life Sciences	A600107-0500
Glucose	Sangon Biotech	A50991-0500
GlutaMAX	Gibco	35050-061 substitut de	glutamine
Hématoxyline-Eosin colorant Kit Solarbio		G1120
HEPES	Beyotime	ST090
Humain bFGF	Origene	TP750002
Novoprotéine EGF humaine		C029-500&mu ; g
HypoThermosol FRS	Biolife Solutions	101104	milieu de conservation hypothermique
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
IVIS Lumina XR III  ;	PerkinSystème	/	bioluminescence
Matrigel	Corning	356231	extrait de matrice de membrane basale
Microseringue	Hamilton	80300
N2 Supplement	Gibco	17502048
Nunclon Sphera 6-Well Plate	Thermo Scientific	174932	de fixation ultra-basses
Paraformaldéhyde	Sangon Biotech	A500684-0500
Tampon PBS	Solarbio	P1010-100*2L
Pénicilline/Streptomycine	Solarbio	P8420/S8290
Bicarbonate de potassium	Sangon Biotech	A501195-0500
RWD Dissociateur de tissus	RWD Life Science	DSC-410
Instrument stéréotaxique standard	RWD Life Science	68801
Tube de traitement d’échantillons de tissus	RWD Life Science	SCT-100
&beta ;-mercaptoethanol	Sigma	M3148-100mL