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Analyse de l’enrichissement en vitamine A en 13C dans des échantillons biologiques par chromatographie en phase gazeuse-combustion-spectrométrie de masse du rapport isotopique

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DOI :

10.3791/68571

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14 novembre 2025

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit l’analyse d’échantillons de sérum, de lait maternel et de foie pour l’enrichissement en 13C du rétinol et des esters de rétinyle pour des applications de traçage. La chromatographie liquide à haute performance est utilisée pour purifier et quantifier les concentrations de rétinol, et la chromatographie en phase gazeuse-combustion-spectrométrie de masse du rapport isotopique (GC-C-IRMS) est utilisée pour analyser les extraits purifiés.

Résumé

La vitamine A est essentielle à la santé, mais l’évaluation de son statut est difficile. La vitamine A circulant dans le sang est contrôlée par l’homéostatique et ne reflète souvent pas une carence ou un excès de vitamine A. L’utilisation de la 13-vitamineC A permet de retracer et de quantifier les réserves totales de vitamine A du corps et d’obtenir des informations supplémentaires sur la pharmacocinétique et le métabolisme. Ce protocole décrit l’extraction, la purification et la détermination de l’enrichissement en vitamine A de l’isotopique 13C dans des échantillons de sérum, de lait maternel et de tissus à l’aide de la spectrométrie de masse du rapport entre chromatographie en phase gazeuse et combustion isotopique (GC-C-IRMS). L’analyse à l’aide de la GC-C-IRMS fournit des valeurs d’enrichissement sensibles et précises, en particulier pour les échantillons avec des enrichissements en 13C proches des niveaux d’abondance naturels. Cela permet une flexibilité dans la conception des études pour utiliser des doses de traceur plus faibles et un échantillonnage pharmacocinétique à plus long terme. En bref, à 0,4 à 1 mL de sérum, on ajoute de l’éthanol pour précipiter les protéines, du C-23 β-apo-caroténol est ajouté comme étalon interne et de l’hexane pour extraire les rétinoïdes. L’extrait est ensuite remis en suspension dans du méthanol et purifié à l’aide de la HPLC. La fraction de rétinol est ensuite remise en suspension dans de l’hexane et injectée dans le système GC-C-IRMS. Le % d’atomes (At %) est directement calculé en référence au dioxyde de carbone, qui est étalonné par rapport à un étalon de saccharose à l’aide d’un analyseur élémentaire. D’autres types de tissus qui ont été analysés par GC-C-IRMS comprennent le lait maternel et le foie après saponification. Les techniques d’extraction en phase solide peuvent être utilisées pour aider à la purification de ces matrices ou d’autres matrices complexes. De plus, un analyseur élémentaire peut être fixé à l’IRMS pour analyser les échantillons d’aliments pour une teneur totale en 13°C.

Introduction

La vitamine A (VA) est un micronutriment essentiel nécessaire à la vision, à la fonction immunitaire, à la différenciation cellulaire et à la régulation métabolique. L’optimisation du statut VA reste un défi de santé mondial, car une carence ou un excès peut nuire aux résultats de santé. Une évaluation précise du statut VA est essentielle pour les études cliniques ou de population orientant les interventions appropriées. Cependant, la concentration sérique de rétinol à elle seule est un mauvais biomarqueur et outil de diagnostic, car elle est régulée homéostatiquement dans un large éventail de réserves totales du corps (TBS) et est affectée par l’inflammation et d’autres carences ennutriments1,2.

Les traceurs marqués isotopiquement ont radicalement transformé la recherche sur les AV en permettant l’évaluation quantitative des TBS à l’aide du test de dilution isotopique du rétinol (RID) 3,4,5. Pour le RID, un traceur VA enrichi en 13C ou en 2H est administré, s’équilibre avec les réserves corporelles, et le rapport traceur/tracee (TTR) du rétinol sérique (ou plasmatique) est mesuré à l’aide de la spectrométrie de sodium. Une équation de dilution isotopique est appliquée avec des hypothèses spécifiques liées au métabolisme des VA pour calculer les TBS 5,6.

De nombreuses combinaisons de chromatographie et de spectrométrie de sodium peuvent être utilisées pour déterminer le taux sérique de rétinol (p. ex., GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS). La précision analytique est essentielle pour obtenir des estimations précises du RID, car les SCT sont inversement proportionnels au TTR. LC-MS/MS est bien adapté aux applications à haut débit lorsque l’on utilise des traceurs fortement marqués et des doses de traceur relativement élevées. Les méthodes LC-MS/MS typiques rapportent des écarts-types relatifs (RSD) du rétinol de 3 à 6 % pour l’intra-dosage et de <8 % pour l’inter-essai7, mais il existe peu de données sur l’exactitude et la précision des TTR. En revanche, la spectrométrie de masse du rapport isotopique chromatographie en phase gazeuse-combustion (GCCIRMS) offre une précision exceptionnelle pour l’enrichissement en 13C-rétinol, avec des RSD typiques d’abondance des isotopes 13C/12C de ~0,02-0,05 8,9. Cela permet de déterminer avec précision les concentrations de traceurs dans des échantillons où les enrichissements sont faibles. L’utilisation d’IRMS pour les applications RID permet d’obtenir un signal analytique adéquat en utilisant moins de masse de traceur et moins d’atomes marqués dans le traceur, ce qui permet de réduire les coûts associés aux doses de traceur.

Ce manuscrit présente une analyse du 13-C-rétinol dans le sang, le lait maternel et les tissus à l’aide de la GC-C-IRMS. Selon l’échantillon biologique testé, l’analyse du rétinol 13marqué au carbone à l’aide de GC-C-IRMS commence par l’une des nombreuses méthodes d’extraction potentielles pour isoler les composés non polaires qui incluent le rétinol marqué. Pour les échantillons de sérum, il s’agit d’une extraction liquide-liquide en ajoutant de l’éthanol et de l’hexane et en recueillant la fraction hexane. Si vous testez le lait maternel, les échantillons sont d’abord saponifiés avec de l’hydroxyde de potassium, puis une extraction liquide-liquide similaire au sérum. Ces échantillons de lait maternel sont également purifiés à l’aide de cartouches d’extraction en phase solide afin de réduire la quantité d’autres lipides restants. S’il est extrait d’un tissu (p. ex., foie), l’échantillon est broyé avec du sulfate de sodium anhydre pour éliminer l’eau, extrait avec du chlorure de méthylène et filtré dans une fiole jaugée ou à fond rond pour une évaporation rotative. Une aliquote est séchée, remise en suspension dans de l’éthanol, saponifiée et extraite selon la même méthode que le lait maternel. Ces solutions apolaires de chaque échantillon sont séchées sous azote et reconstituées dans du méthanol pour la purification et la quantification par chromatographie liquide à haute performance (HPLC).

La sensibilité de l’IRMS permet de déterminer l’enrichissement dans des échantillons à faible enrichissement d’échantillons, tels que les échantillons pharmacocinétiques pour les applications de modélisation mathématique à long terme ou les échantillons de tissus extrahépatiques pour le traçage précis du métabolisme des VA. Des tests RID appariés à dose unique ont été proposés pour évaluer le statut VA avant et après l’intervention afin de déterminer l’efficacité chez les sujets théoriques10, ce qui pourrait être une approche prometteuse si elle est validée chez l’homme. L’IRMS est capable de détecter les traceurs VA proches des valeurs d’enrichissement naturel, ce qui permettrait de longues fenêtres de suivi et une flexibilité dans les protocoles d’échantillonnage.

Le lait maternel s’est avéré être une approche d’échantillonnage alternative moins invasive pour l’évaluation de l’état VA1. Le rétinol du lait maternel peut être utilisé comme source d’échantillonnage pour le test RID, et a montré une forte corrélation avec les valeurs RID dérivées du sérum chez les femmes en Zambie ayant de faibles réserves d’VA11. Pour les tissus et les échantillons de lait maternel, les techniques d’extraction en phase solide peuvent aider à la purification de ces échantillons dans des matrices complexes. L’IRMS a également été utilisé pour discriminer les sources alimentaires d’AV et déterminer les contributions alimentaires relatives en utilisant les changements dans l’abondance naturelle de 13C de rétinolsérique 9,12,13. Un analyseur élémentaire peut également être utilisé avec l’IRMS pour analyser les échantillons d’aliments pour la teneur totale en 13°C et la comparer à l’enrichissement en VA.

Lors de l’utilisation d’étiquettes 13C, il est essentiel de comprendre l’enrichissement de base en rétinol 13C, dû à la présence naturelle de 13C (~ 1,1 % du carbone total), qui peut varier en fonction des sources d’AV consommées par les individus et les populations. Par conséquent, pour une meilleure précision au niveau individuel, un échantillon de sang de base est recommandé. Pour les évaluations de la population, une estimation basée sur la population peut être générée à l’aide d’un sous-groupe sélectionné au hasard ou d’individus distincts du même groupe de population14.

Protocole

1. Extraction du rétinol à partir d’échantillons biologiques

REMARQUE : Toutes les procédures de manipulation et d’extraction des échantillons sont effectuées sous une lumière jaune ou filtrée par UV afin de minimiser la dégradation.

  1. Extraction du sérum
    1. Pipeter 1 mL de sérum (ou autant que possible) dans un tube à essai en verre de 13 x 100 mm (ou de taille similaire). Enregistrez le volume sérique utilisé.
      REMARQUE : L’utilisation d’une pipette à déplacement positif est recommandée.
    2. Ajoutez 1,5 fois le volume d’éthanol à 200 degrés.
    3. Ajouter 25 μL de l’étalon interne, comme le C-23 β-apo-caroténol (synthétisé à partir du rétinien tout-trans, abs = 0,9)9. Boucher l’échantillon et mélanger par vortex pendant 15 s.
    4. Ajouter 1 mL d’hexane, mélanger par vortex pendant 15 s et centrifuger pendant 2 min (~1 300 × g) à température ambiante.
    5. À l’aide d’une pipette Pasteur, pipetez soigneusement la couche supérieure d’hexane dans un tube à essai en verre neuf (12 x 75 mm ou 13 x 100 mm).
    6. Répétez les étapes 1.1.4 et 1.1.5 2 fois, en regroupant les trois extraits d’hexane dans le deuxième tube. Placez l’extrait d’hexane mélangé sous un léger jet d’azote jusqu’à ce qu’il soit sec.
    7. Ajoutez 100 μL de méthanol à l’échantillon séché et bouchez-le immédiatement. Faites tourner la solution de haut en bas sur les côtés du tube, puis mélangez l’échantillon par vortex pendant 15 s.
    8. Placez les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant au moins 5 min.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent rester stockés à cette étape à -80 °C jusqu’au lendemain.
  2. Extraction d’échantillons de lait maternel
    1. Décongelez complètement les échantillons de lait et retournez-les doucement à plusieurs reprises pour vous assurer que les échantillons sont uniformes. Dans un tube à centrifuger en verre de 10 ml, mesurer une aliquote de 0,5 à 1,5 ml (standard de 1,0 ml) de lait et noter le volume utilisé.
    2. Ajouter 1,5 fois le volume d’éthanol à 200 degrés (contenant 0,1 % d’hydroxy toluène butylé (w :v)), mélanger avec un vortex pendant 15 s.
    3. Ajouter 25 μL de l’étalon interne, comme le C-23 β-apo-caroténol (synthétisé à partir du rétinien tout-trans, abs = 0,9)15. Boucher l’échantillon et mélanger par vortex.
    4. Ajouter 0,8 fois le volume de l’échantillon de lait d’hydroxyde de potassium 50:50 dans de l’eau (préparée en tant que w :v, par exemple, 50 g de KOH dissous dans 50 mL d’eau), mélanger par vortex pendant 15 s.
      REMARQUE : KOH :l’eau doit être préparée dans des récipients en plastique (par exemple, HDPE).
    5. Saponifier les échantillons pendant 1 h dans un bain-marie à 45 °C, et mélanger brièvement au vortex toutes les 15 min.
    6. Ajouter de l’eau froide désionisée ou de l’eau osmosée du même volume que le volume de lait de départ.
    7. Ajouter 1 mL d’hexane, mélanger par vortex pendant 15 s et centrifuger pendant 2 min (~1 300 × g) à température ambiante.
    8. À l’aide d’une pipette Pasteur, pipeter soigneusement la couche supérieure d’hexane dans un tube à essai en verre neuf (12 x 75 mm ou 13 x 100 mm).
    9. Répétez les étapes 1.2.7 et 1.2.8 deux fois de plus, en accumulant de l’hexane dans le deuxième tube.
    10. Prélever chaque échantillon par extraction en phase solide (SPE) ; commencez par connecter les cartouches SPE nécessaires (PE 500 mg/3 mL de -NH2) au collecteur à vide.
    11. Conditionnez chaque cartouche en faisant passer 3 x 2 ml d’hexane dans chaque cartouche, sans jamais laisser le niveau de solvant descendre en dessous du haut du matériau d’emballage. Recueillir l’hexane dans un tube de verre de 16 x 75 mm et l’éliminer de manière appropriée.
    12. Chargez les échantillons dans des cartouches et tirez à travers avec le vide jusqu’à ce que le solvant soit juste au-dessus du niveau du matériau d’emballage. Rincez chaque cartouche avec 3 x 2 mL d’hexane de la même manière qu’à l’étape 1.2.11. Jetez les déchets de solvant et remplacez les tubes de collecte en verre par des tubes neufs de la même taille, étiquetés avec l’ID de l’échantillon.
    13. Lavez le rétinol avec 3 x 2 ml de chlorure de méthylène, en recueillant cette fraction.
    14. Sécher l’éluat sous azote et le reconstituer dans 100 μL de méthanol (grade MS). Mélangez l’échantillon par vortex et faites tourner le solvant sur tous les côtés du tube. Centrifugeuse pendant 20-30 s.
    15. Placez les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant au moins 5 min.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent rester stockés à cette étape à -80 °C jusqu’au lendemain.
  3. Extraction d’échantillons de foie
    1. Dans un entonnoir en verre de 8 cm de diamètre, pliez et placez un papier filtre Whatman #1 de 15 cm en forme de cône. Placer une fiole jaugée de 50 mL sous l’entonnoir.
    2. Décongelez le tissu et pesez 0,5 g, ou autant d’échantillon que possible. Enregistrez le poids du tissu utilisé.
    3. Transférez les échantillons dans un mortier et un pilon et broyez-les avec environ 5 g de sulfate de sodium.
    4. Ajouter 250 μL d’un étalon interne tel que C-2315.
      REMARQUE : Les formes estérifiées de vitamine A (c’est-à-dire l’acétate de rétinyle, le butyrate de rétinyle) ne doivent pas être utilisées car l’échantillon finira par être saponifié, ce qui rendra l’étalon impossible à distinguer du rétinol endogène.
    5. Dans une hotte, verser 10 à 15 ml de chlorure de méthylène dans le mortier avec l’échantillon de foie moulu et mélanger délicatement à l’aide du pilon.
    6. Verser le chlorure de méthylène à travers le papier filtre dans la fiole jaugée.
    7. Répétez les étapes 1.3.5 et 1.3.6 deux fois de plus, en vous assurant que la totalité du solvant dans la fiole jaugée reste sous la ligne.
    8. À l’aide d’une pipette Pasteur, rincez le contenu restant du mortier dans l’entonnoir avec du chlorure de méthylène. Continuez à ajouter du chlorure de méthylène dans l’entonnoir à l’aide de la pipette Pasteur jusqu’à ce que le solvant contenu dans la fiole jaugée atteigne la ligne. Boucher la fiole jaugée et, tout en maintenant le capuchon en place, retourner la fiole plusieurs fois.
    9. Versez environ 10 ml d’extrait de chlorure de méthylène dans un erlenmeyer de 25 ml. Transférez 5 ml de la solution dans un tube à centrifuger en verre de 10 ml avec capuchon à vis. Séchez l’échantillon sous un léger jet d’azote gazeux.
    10. Reconstituez l’échantillon dans 2 mL d’éthanol + hydroxy toluène butylé à 0,1 % et un vortex pour mélanger l’échantillon.
    11. Ajouter 0,8 mL d’hydroxyde de potassium 50:50 (p :v) dans l’eau et mélanger par vortex pendant 15 s.
    12. Saponifier les échantillons pendant 1 h dans un bain-marie à 45 °C, et mélanger brièvement au vortex toutes les 15 min.
    13. Ajouter 0,1 mL d’eau froide désionisée ou d’eau osmosée.
    14. Ajouter 1 mL d’hexane, mélanger par vortex pendant 15 s et centrifuger pendant 2 min (~1 300 × g).
    15. À l’aide d’une pipette Pasteur, pipeter soigneusement la couche supérieure d’hexane dans un tube à essai en verre neuf (12 x 75 mm ou 13 x 100 mm).
    16. Répétez les étapes 1.3.14 et 1.3.15 deux fois de plus, en accumulant de l’hexane dans le deuxième tube.
    17. Sécher l’hexane accumulé sous azote et le reconstituer dans 100 μL de méthanol (grade MS). Mélangez l’échantillon par vortex et faites tourner le solvant sur tous les côtés du tube. Centrifuger pendant 20 à 30 s et placer les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant au moins 5 min.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent rester stockés à cette étape à -80 °C jusqu’au lendemain.

2. Purification et quantification d’échantillons par chromatographie liquide à haute performance

  1. Préparez le système HPLC 1 avec une colonne C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) et un détecteur UV-Vis réglé sur 325 nm.
  2. Préparez la phase mobile de l’acétonitrile 92:8 : eau en mesurant les volumes d’acétonitrile et d’eau séparément, puis en versant l’eau dans l’acétonitrile. Filtrez sous vide la solution mélangée pour éliminer les gaz dissous.
  3. Allumez le système HPLC 1, effectuez une purge de solvant sur le HPLC si nécessaire, puis réglez le débit à 1 mL/min pendant au moins 15 min pour équilibrer complètement le système.
  4. Injectez des normes dans le système HPLC.
    1. Pour quantifier les concentrations de rétinol, injecter 25 μL de solution étalon interne de C-23 et enregistrer le résultat 3x pour le comparer avec les échantillons.
    2. Injectez un étalon de rétinol pour déterminer le temps de rétention exact du système utilisé pour guider la collecte des fractions et la quantification du rétinol.
  5. Préparez le système HPLC 2 (les composants sont les mêmes que ceux du système 1). Si vous utilisez un système HPLC pour les deux étapes, remplacez la colonne utilisée pour la purification primaire par une deuxième colonne identique afin de minimiser le risque de transfert de composés des échantillons.
  6. Pour le système 2, mettez le filtre sous vide avec du méthanol, purgez la phase mobile HPLC, puis faites fonctionner 0,7 ml/min pendant 20 minutes pour équilibrer.
  7. Retirer les échantillons un par un du congélateur à -80 °C et centrifuger à 1 300 × g pendant 30 s à température ambiante.
  8. Injectez l’échantillon entier dans la HPLC, en évitant tout matériau granulé. Commencer l’enregistrement si vous quantifiez le rétinol.
  9. Recueillez le pic de rétinol dans un petit tube en verre (12 x 75 mm ou 13 x 100 mm) pendant que le solvant passe à travers le détecteur. Prélevez la partie centrale du pic pour maximiser la pureté, généralement des valeurs d’absorbance supérieures à 0,1 unité d’absorbance (Figure 1), qui peuvent être ajustées en fonction de la concentration de rétinol de l’échantillon. Attendez que le pic C-23 s’élue et arrêtez l’enregistrement.
  10. Sécher l’échantillon sous un léger jet d’azote.
  11. Ajouter 100 μL de méthanol (grade MS) à l’échantillon séché et boucher immédiatement. Faites tourner la solution de haut en bas sur les côtés du tube, puis mélangez l’échantillon par vortex pendant 15 s. Placez les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant au moins 5 min.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent rester stockés à cette étape à -80 °C jusqu’au lendemain.
  12. Retirer les échantillons un par un du congélateur à -80 °C. Centrifugeuse à 1 300 × g pendant 30 s.
  13. Injectez l’échantillon entier dans le système HPLC 2, en évitant tout matériau granulé.
  14. Au fur et à mesure que le pic de rétinol élue, recueillir le solvant lors de son passage à travers le détecteur dans un petit flacon en verre (<1 ml) à fond conique, et glisser doucement le flacon d’échantillon dans un tube à essai de 12 x 75 mm.
  15. Allumez le concentrateur sous vide et laissez refroidir le condenseur pendant 20 min.
  16. Placez les échantillons dans une formation équilibrée dans le carrousel, réglez le réglage de chaleur sur aucun et le vide sur 05,1, fermez le couvercle et appuyez sur exécuter.
    REMARQUE : Les échantillons prennent généralement 10 à 20 minutes pour sécher. Il est important pour le chromatographe en phase gazeuse que tout le méthanol ait été retiré des échantillons.
  17. Une fois sec, transférez le flacon HPLC dans un flacon ambré de 4 mL avec un couvercle à bouchon à vis et reconstituez l’échantillon avec 4 à 7 μL d’hexane.
    REMARQUE : Il s’agit généralement de 7 μL, mais il est réduit lorsque l’échantillon est déterminé comme étant une faible concentration lors de la purification. Les échantillons de foie peuvent être beaucoup plus concentrés, donc se reconstituer dans un plus grand volume. Visez entre 75 ng/μL et 400 ng/μL.
  18. Injecter 1 à 5 μL dans le GC-C-IRMS pour obtenir un signal adéquat, basé sur la concentration de l’échantillon nécessaire pour injecter environ 75 ng de rétinol.

3. Analyse d’échantillons avec GC-C-IRMS

  1. Préparez le CG à l’aide d’une colonne (100 % de diméthylpolysiloxane, non polaire, 15 m, 0,25 mm de diamètre intérieur, film de 0,25 μm) et d’un débit d’hélium de 1,2 mL/min.
  2. Effectuez des vérifications du système pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites et que la source IRMS est correctement concentrée sur les masses 44, 45 et 46.
    Injecter chaque jour 2 μL d’un étalon de rétinol enrichi en 13C de 75 ng/μL comme première injection pour déterminer le temps de rétention et vérifier les performances du système.
  3. Dans le logiciel d’acquisition, chargez la méthode de l’instrument, tapez le nom de l’échantillon et appuyez sur exécuter l’échantillon. Le système GC-C-IRMS effectuera une routine de configuration du système de pré-injection. Une fois que le voyant vert Prêt à injecter à l’avant du GC s’allume, injectez le volume prédéterminé d’échantillon dans l’injecteur PTV de vaporisation à température programmable, retirez la seringue et appuyez sur le bouton Démarrer .
  4. Faites fonctionner l’injecteur PTV en mode PTV Splitless, avec la colonne de protection située en haut de l’insert d’injecteur pour une injection simulée sur colonne. Réglez le programme de l’injecteur pour qu’il commence avec une température initiale de 50 °C, maintenez l’injecteur pendant 1,05 min, augmentez à 200 °C à une vitesse de 14,5 °C/s, maintenez à 200 °C pendant 1 min, passez à 300 °C à 14,5 °C/s, puis maintenez pour purger l’injecteur pendant 4 min avec un flux d’hélium de 50 mL/min avant de revenir à 50 °C pour l’injection suivante.
  5. Programmez la température du four GC jusqu’à une température initiale de 50 °C, maintenez la position pendant 1 min, augmentez la vitesse de 30 °C/min à 150 °C, puis de 15 °C/min à 265 °C, puis jusqu’à 295 °C à 40 °C/min, puis maintenez pendant 2,50 min avant de refroidir à 50 °C pour l’injection suivante.
  6. S’assurer que chaque chromatogramme commence par trois impulsions de CO2 (pureté de 99,999 %), calibrées en fonction du saccharose (AIEA-CH-6). L’accès aux résultats dans le logiciel d’acquisition.
  7. Après chaque injection, inspectez chaque chromatogramme pour vérifier que le pic de rétinol est présent et que l’intégration est appropriée. Utilisez le logiciel pour intégrer automatiquement les pics de rétinol autant que possible afin de minimiser les biais potentiels des intégrations manuelles. Utilisez les paramètres standard de détection de pente de début et de fin de 20 mV/s.
    REMARQUE : Une amplitude de crête de 200 mV ou inférieure est trop petite pour fournir une mesure précise du rapport 13°C.
  8. Exportez les données du chromatogramme vers un tableur. Incluez les catégories de données essentielles suivantes : Nom de l’échantillon, temps de rétention du pic, amplitude du pic à la masse 45 et AT %.
    REMARQUE : Les données exportées peuvent être spécifiées à l’aide d’une méthode d’exportation définie. La valeur δ est bénéfique pour faciliter l’interprétation, mais n’est pas nécessaire pour les calculs.

4. Calcul des réserves totales de vitamine A et des concentrations hépatiques

  1. Équations de dilution des isotopes du rétinol.
    REMARQUE : L’équation du bilan isotopique privilégiée et la notation correspondante utilisées par certains chercheurs sont basées sur les recommandations de l’Union internationale de chimie pure et appliquée16. Nous notons que certains groupes de recherche utilisent la notation qui tente de maintenir l’utilisation historique des facteurs utilisés dans les équations RID. Nous notons également que les facteurs et la littérature à l’appui peuvent différer quant à savoir s’ils s’appliquent plus directement aux calculs des concentrations de TBS ou d’AV hépatiques, selon la conception de l’étude, le modèle expérimental et les résultats analytiques.
    1. Déterminer le RTT du rétinol sérique à l’aide de l’abondance isotopique de 13°C de CO2 après combustion selon l’équation suivante :
       figure-protocol-1    
      Où F est l’abondance isotopique (également connue sous le nom de fraction isotopique-quantité, abrégée « x ») de la dose de traceur (Fa), du rétinol sérique au départ (Fb) et du rétinol sérique après dosage et mélange avec le pool corporel (Fc). Les périodes de mélange utilisées sont généralement d’environ 14 à 21 jours pour les humains, mais peuvent être plus courtes ou plus longues selon la conception spécifique de l’étude.
    2. Utilisez les équations RID pour calculer VA TBS selon l’équation de base suivante.
      figure-protocol-2
      Où
      figure-protocol-3
      REMARQUE : Les facteurs utilisés pour l’absorption et le stockage comprennent i) le stockage de la dose au moment de l’équilibre (absorption de la dose) généralement estimé entre 75 % et 90 % pour les personnes en bonne santé. L’estimation peut être réduite si une inflammation est présente. ii) rétention de dose ; Constante : e-kt ; k = LN(2)/demi-vie du rétinol ; 32 à 136 jours pour les enfants ; 140 jours pour les adultes) ; t = jours depuis l’administration (généralement 14 à 21 jours) ; Partage du traceur sérique/hépatique : TTRserum / TTRliver ; 0,65-0,9 avec admission VA pendant la période de mélange ; 0,9-0,1 en cas d’utilisation d’une faible dose de traceur, d’un apport contrôlé en VA et d’un échantillonnage à jeun.
      figure-protocol-4
    3. Calculer les concentrations hépatiques d’AV à l’aide d’hypothèses supplémentaires concernant le poids du foie et la fraction d’AV TBS dans le foie.
      figure-protocol-5
      Où
      figure-protocol-6
      Le rapport foie/poids corporel est généralement estimé comme une constante selon l’âge : nourrissons : 4-4,2 % ; enfants : 3 %; adultes : 2,4 %; La fraction de TBS dans le foie varie selon le statut en vitamine A. Les estimations précédemment utilisées sont les suivantes : statut VA marginal ou faible : 0,5 ; État VA adéquat : 0,8-0,9.

Résultats

Un exemple de chromatogramme d’échantillon de sérum surveillé à 325 nm est fourni pour la section 2 du protocole (Figure 1). Selon le système et la colonne utilisés, le temps de rétention typique du rétinol est de 4 à 6 min et de 6 à 8 min pour l’étalon interne. La zone ombrée en vert indique la plage de collecte cible de la fraction de rétinol afin de minimiser les impuretés. L’efficacité d’extraction du rétinol à partir du sérum est généralement ≥ 85 %, tandis que le lait maternel saponifié et les échantillons de tissus ont tendance à avoir des efficacités inférieures, en moyenne ~70-80 %. Des quantités mineures d’isomères cis du rétinol peuvent être observées s’éluant peu de temps avant ou après le pic principal tout trans pendant la purification HPLC. Aucun isomère cis appréciable n’a été observé dans l’échantillon présenté à la figure 1 , mais on peut le voir dans la figure supplémentaire 1 de la référence17. Souvent, un isomère supplémentaire sera séparé lors de la deuxième purification HPLC (non illustrée) ou lors de la séparation GC (Figure 2).

Des exemples de chromatogrammes GC-C-IRMS pour un étalon, un échantillon de sérum et un blanc sont illustrés pour la section 3 du protocole (Figure 2)9. Chaque échantillon comprend des pics de référence de CO2 avec un enrichissement en 13°C étalonnés selon un étalon de saccharose de l’AIEA (AIEA-CH-6).

La précision expérimentale de l’IRMS (CV %) pour l’abondance isotopique de 13C/C total pour : 1) le CO2 de référence était de 0,012 pour la stabilité et de 0,031 pour la linéarité (n = 10 chacune) ; 2) l’étalon de rétinol était de 0,036 pour la stabilité interjournalière et de 0,022 pour la linéarité intrajournalière (n = 4 chacun) ; et 3) expérimental était de 0,073 ± 0,061 dans les groupes de traitement initial et huit groupes de traitement diététique chez les gerbilles (n = 46 dans 9 groupes)9.

Vous trouverez ci-dessous un exemple de la façon dont les données sériques GC-C-IRMS résultantes sont utilisées pour calculer les concentrations de TBS et d’AV hépatiques déterminées 14 jours après l’administration de la dose à l’aide de l’équation RID pour la méthode 4 :

Caractéristiques des participants à l’étude :

Âge:4 ans
Poids corporel :16,0 kg
Fa (2 carbones marqués plus abondance naturelle) :0.11
Fb:0.010757
Fc:0.011057
Dose de traceur appliquée :1,0 μmol
Temps écoulé depuis l’administration :14 jours
Demi-vie VA :32 jours
Absorption:0.8
Rapport de TTR dans le sérum/foie (régime non contrôlé) :0.9
Fraction de TBS dans le foie :0.8

Calcul:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0,0110568 à 0,010757) / (0,11 à 0,0110568) = 0,0030300213
1/TTR = 1 / 0,0030300213 = 330,03

Rétention de dose = e-kt avec une demi-vie de 32 jours et un temps de prélèvement de 14 jours
k= ln(2)/36 = 0,693147181 / 36 = 0,021660849
t = 14
e-kt = e-0,02166 x 14 = 0,738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330,03 x 0,8 x 0,738413073 × 0,9 = 175 μmol

Pour le calcul des concentrations hépatiques en VA :
Poids du foie (g) = 1 000 × poids corporel (kg) × 3 % (estimation pour les enfants)
Poids du foie = 1 000 x 16,0 x 0,03 = 480 g
figure-results-2
Concentration hépatique en VA = (175 / 480) x 0,8 = 0,29 μmol/g

figure-results-3
Figure 1 : Chromatogramme HPLC d’un échantillon de sérum humain. Système HPLC 1 avec phase mobile isocratique 90:10 MeOH :H2O et détection à 325 nm. Le pic de rétinol est collecté pour des valeurs d’absorbance supérieures à ~0,1 (zone ombrée en vert). L’étalon interne C-23 β-apo caroténol est utilisé pour quantifier la concentration sérique de rétinol (si vous le souhaitez) au cours de cette étape. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 2 : Chromatogrammes GC-C-IRMS montrant la détermination du rétinol 13 C/12 C. Chromatogramme GC-C-IRMS de (A) rétinol standard, (B) rétinol purifié à partir de sérum et (C) injection à blanc adapté de Gannon et al.9. Trois traces sont pour la masse 44 (correspondant à 12C16O2), 45 (correspondant à 13C16O2 ou 12C16O17O), et 46 (correspondant principalement à 12C16O18O, qui est utilisé pour corriger la masse 45 pour la contribution de 17O). Trois larges pics avant 200 s sont des pics de référence deCO2 étalonnés sur un matériau de référence en saccharose 13C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les méthodes décrites pour mesurer l’enrichissement en 13C du rétinol à l’aide de la GC-C-IRMS peuvent fournir des données précieuses pour l’évaluation des interventions diététiques,18 la modélisation de la cinétique de la vitamine A,19,20,21 la recherche clinique ou les études de population intégrant le RID pour améliorer les estimations du statut VA 22.

Dans ce test, le rétinol purifié à partir d’un échantillon biologique est transporté à travers la colonne GC par de l’hélium de qualité recherche (pureté de >99,99999 %) avec un gradient de température, le séparant des impuretés restantes dans l’échantillon. Le rétinol est brûlé pour former du CO2 et de l’eau, et l’eau est éliminée. Le CO2 est transporté vers l’IRMS, où les masses 44, 45 et 46 sont mesurées, et le δ et le % AT sont déterminés par rapport à une référence de gaz CO2 , qui est en outre étalonnée par rapport à l’étalon de saccharose (AIEA-CH-6).

Lors de la préparation du rétinol pour injection, le rétinol extrait doit être d’une pureté maximale afin d’obtenir des rapports isotopiques reproductibles et de maximiser la longévité de la plate-forme analytique entre les nettoyages en profondeur. Les solvants utilisés pour l’extraction doivent être du degré de pureté le plus élevé disponible, qui est généralement de grade MS. Toute la verrerie, comme les tubes d’extraction, les pipettes Pasteur et les flacons d’injection HPLC, doit être neuve car elle est difficile à nettoyer adéquatement pour l’analyse MS. Il est important d’utiliser des tubes en verre et des pipettes plutôt que du plastique afin de minimiser les plastifiants dans les extraits qui s’accumulent sur le GC et les colonnes de combustion.

Des modifications peuvent être apportées à ce flux de travail d’analyse d’échantillon en fonction de la conception de l’étude spécifique et de la source d’échantillonnage. Par exemple, un système HPLC pourrait probablement être optimisé pour la purification du rétinol. D’après notre expérience, cela nécessiterait de l’eau dans la phase mobile, et nécessiterait soit un gradient de phase mobile, soit une augmentation du temps de séchage de l’échantillon avant l’injection sur le GC-C-IRMS. Nous avons constaté que l’utilisation de deux systèmes HPLC avec des méthodes isocratiques courtes équilibre les exigences analytiques tout en obtenant des signaux clairs sur le GC-C-IRMS (figure 2). L’utilisation de la LC-MS/MS pourrait permettre de rationaliser le flux de travail analytique des échantillons RID7. Cependant, la sensibilité de la GC-C-IRMS présente des avantages distincts : elle permet d’utiliser des doses plus faibles et des quantités de marquage isotopique, de quantifier les traceurs à des points temporels plus longs et d’analyser des échantillons à faible enrichissement.

Les limites de cette méthode comprennent la nécessité de plusieurs instruments, une manipulation technique qualifiée et des contraintes de débit d’échantillons dues à des temps de préparation d’échantillons plus longs. Le temps-personne nécessaire à la préparation de chaque échantillon pourrait être amélioré par la mise en œuvre d’une HPLC avec des capacités de collecte automatisée des fractions, car les étapes de purification HPLC utilisent des méthodes isocratiques, ce qui permet d’obtenir des temps de rétention d’analyte cohérents. La méthode pourrait être optimisée pour n’utiliser qu’une seule purification HPLC. Nous utilisons deux systèmes en parallèle pour augmenter le débit et faciliter le séchage des échantillons avant la reconstitution en hexane et l’injection sur le GC-C-IRMS.

Bien que la GC-C-IRMS soit extrêmement sensible pour déterminer les rapports isotopiques, elle nécessite une masse totale de rétinol plus importante pour un signal de rétinol adéquat. Les exigences en matière d’échantillon dépendent à la fois de la quantité de l’échantillon et de la concentration en VA de l’échantillon. En règle générale, 75 ng de rétinol sont ciblés pour un pic fort, ce qui permet des variations dans le transfert de GC et l’efficacité de la combustion. En pratique, dans des conditions de fonctionnement optimales, nous avons obtenu un signal adéquat avec des échantillons résultant en des injections de GC-C-IRMS aussi faibles que 25 ng. Cela correspond à un échantillon de sérum avec un volume plus faible (~0,4 mL), une faible concentration en rétinol (~0,5 μmol/L) et des pertes mineures dans les procédures d’extraction et de purification. Dans le développement analytique de la méthode RID, une amélioration majeure a été de passer à un injecteur PTV. La basse température de démarrage empêche l’hexane transportant l’échantillon de se dilater trop rapidement, ce qui permet de simuler des injections d’échantillons sur colonne. L’injection directe dans la colonne maximise le signal du rétinol avec l’inconvénient d’une forme de pic un peu plus mauvaise et d’un entretien plus constant.

Le lait maternel a été proposé comme substitut des échantillons de sérum dans le test RID. Cela a été validé chez les femmes allaitantes zambiennes qui avaient en grande partie de faibles réserves de VA11. Il n’a pas encore été validé chez les femmes qui ont un apport plus élevé en VA préformé, comme on le trouverait dans les pays à revenu élevé ou dans les populations qui consomment plusieurs sources d’AV, y compris l’apport alimentaire, l’enrichissement des aliments et la supplémentation.

L’évaluation de l’AV dans le lait maternel présente plusieurs avantages par rapport aux autres indicateurs biochimiques de l’état VA. La collecte du lait maternel est souvent plus facile que celle du sang car les phlébotomistes ne sont pas nécessaires, et la collecte du lait maternel est généralement considérée comme moins invasive pour les sujets23. L’utilisation d’échantillons de lait maternel occasionnels est pratique et ne nécessite que 5 ml de lait. De plus, les échantillons n’ont pas besoin d’être traités immédiatement, ce qui raccourcit le temps de manipulation des échantillons, en particulier sur le terrain. Cependant, la normalisation du prélèvement d’échantillons de lait maternel complet est essentielle car les concentrations de matières grasses et de rétinol sont plus élevées dans le lait postérieur que dans le lait antérieur, et les concentrations de matière grasse et de rétinol dans le lait ont tendance à varier avec le moment de la journée et l’intervalle écoulé depuis la dernière tétée 1,24. Pour les échantillons occasionnels, la concentration en rétinol est mieux exprimée par g de matière grasse laitière. Idéalement, la matière grasse du lait doit être déterminée juste après le prélèvement à l’aide de la méthode du crématocrite25. Les échantillons doivent être à l’abri de la lumière. Des aliquotes (généralement de 1 à 5 ml) pour l’analyse HPLC doivent être préparées au moment de la collecte, car le lait n’est pas homogène après congélation et décongélation.

Il y a deux circonstances principales dans lesquelles la mesure de l’enrichissement en 13C de l’AV dans le foie peut être possible et intéressante. La situation la plus courante est l’utilisation de rétinol marqué au 13C dans des études animales lorsque le foie est collecté. Les TBS calculés de VA seront comparés à la concentration de VA dans le foie déterminée par HPLC/UPLC, mais l’enrichissement en 13C des réserves hépatiques est également utile pour déterminer comment le traceur est distribué en circulation par rapport aux réserves à long terme. De plus, dans certaines circonstances uniques, il est possible d’obtenir des échantillons de biopsie hépatique d’humains qui ont donné leur consentement et qui ont également pris une dose étiquetée de vitamine A26,27. Ces échantillons sont également utiles pour la validation et les tests du mélange de 13C-rétinol. Le traitement d’un échantillon de foie commence par le broyage d’un échantillon mesuré avec du sulfate de sodium anhydre pour piéger l’eau et décomposer les tissus. Celui-ci est ensuite extrait avec 50 ml de chlorure de méthylène à travers du papier filtre. Une fraction est séchée sous azote et reconstituée dans de l’éthanol avec 0,1 % d’hydroxy toluène butylé ajouté comme conservateur. L’échantillon est saponifié et extrait selon la même procédure que celle utilisée pour le lait maternel.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été financé par le NIH-R01 DC019357 et le projet de recherche coordonné E43035 de l’AIEA.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériel de référence 13C traçable à l’échelle VPDB-LSVEC (Saccharose)Agence internationale de l’énergie atomiqueAIEA-CH-6  ;Nom de l’Institut national des normes et de la technologie : RM 8542
Acétonitrile (grade HPLC)Fischer ScientificUN1648
Éthanol (pur 200 proof, anhydre, &ge ; 99.5%)Sigma459836
Pipettes pasteur en verreQuelconque
Tubes à essai en verreQuelconque
Hélium (grâce de recherche, (>99,9995 % de pureté)Quelconque
HexanesSigma178918
Méthanol (qualité MS)VWRMSPP-A-456
Mortier et pestel, céramiqueQuelconque
Pipette à déplacement positif 3-25 & micro ; LGilsonFD10002
Pipette à déplacement positif 10-100 & micro ; LGilsonFD10004
Pipette à déplacement positif 50-250 & micro LGilsonFD10005
Pipette à déplacement positif 100-1000 & micro ; LGilsonFD10006
Hydroxyde de potassiumFisher ScientificUN1813
Papier filtre de qualité #1 150 mmWhatman1001-150
Cheminées séparatricesQuelconque
Sulfate de sodium, anhydreFischer ScientificS415-212
Fioles volumétriques (50 mL)Quelconque

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