Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

In situ Détection de cellules métaboliquement actives dans le tissu d’un carcinome hépatocellulaire à l’aide de l’imagerie par cryosection basée sur le MTT

324 vues

⸱

DOI :

10.3791/68575

⸱

31 octobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole simple pour détecter les cellules métaboliquement actives dans le tissu du carcinome hépatocellulaire à l’aide de l’imagerie par cryosection basée sur MTT. Cette méthode peut également être utilisée pour détecter des cellules actives in situ dans d’autres tissus ou organes.

Résumé

De nouvelles preuves, y compris des études antérieures, mettent en évidence une sous-population de cellules dans les tissus du carcinome hépatocellulaire (CHC) qui présentent une activité métabolique supérieure et une résistance au stress. Ces cellules sont les principaux moteurs de la progression tumorale et de la résistance au traitement. Cependant, les méthodes existantes de détection in situ de cellules viables compromettent souvent l’intégrité des tissus, modifient la viabilité cellulaire ou sont techniquement exigeantes. Cette étude présente une approche nouvelle, simple et non destructive pour la détection in situ de cellules métaboliquement actives dans les tissus CHC par réduction dépendante des mitochondries du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) en cristaux de formazan insolubles. En optimisant la taille des fragments de tissu (1 × 1 × 0,2 cm3), les conditions de culture (20 % de FBS, 1 mg/mL de MTT et 3 h d’incubation avec tourbillon intermittent) et les paramètres de cryosectionnement (épaisseur de 20 μm, fixation de 4 % de PFA et contre-coloration DAPI), la cartographie spatiale des cellules CHC viables a été réalisée en 5 h. Ce protocole rentable ne nécessite aucun équipement spécialisé et maintient l’architecture tissulaire, permettant l’identification spatiale d’amas de cellules à haute viabilité et résistants au stress dans les régions de surface. Les limitations comprennent une perte de viabilité progressive au-delà de 6 h et un déplacement cristallin pendant la section, qui peut être atténué par une supplémentation en FBS et une congélation contrôlée. Cette méthode fournit une plate-forme pratique pour l’isolement unicellulaire de sous-populations résistantes au traitement, faisant ainsi progresser la recherche sur le microenvironnement du CHC.

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CHC), troisième cause de décès par cancer dans le monde, se caractérise par une hétérogénéité élevée et des taux de récidive1. Cette hétérogénéité spatiale et temporelle rend certaines populations cellulaires des tissus tumoraux plus actives que d’autres dans le métabolisme, la prolifération, la progression, la tolérance au stress et la résistance aux médicaments. La détection in situ de cellules viables dans les tissus du CHC revêt une profonde importance clinique et biologique, car ces cellules englobent des sous-clones proliférants, des populations résistantes au traitement et des cellules initiatrices de métastases. De telles cellules viables pourraient servir de moteurs essentiels de la récidive tumorale, de l’évasion immunitaire et de l’échec thérapeutique2.

Cependant, les technologies actuelles de profilage spatial (par exemple, la transcriptomique spatiale) nécessitent une instrumentation spécialisée et sont associées à des coûts élevés, tandis que les analyses en vrac traditionnelles négligent souvent l’hétérogénéité spatiale des cellules viables et leurs interactions dynamiques avec les composants stromaux3. Par exemple, les cellules CHC viables résiduelles après résection présentent des profils métaboliques distincts qui ne peuvent pas être récapitulés fidèlement dans les systèmes cellulaires dissociés4. Ainsi, il est impératif de faire progresser les technologies de détection spatialement résolues pour démêler l’interaction fonctionnelle entre les cellules tumorales viables et leur microenvironnement, afin d’éclairer les stratégies thérapeutiques de précision. Bien que des méthodes conventionnelles telles que la cytométrie en flux ou l’immunohistochimie (IHC) aient été utilisées par notre groupe pour détecter les cellules viables dans le CHC, elles nécessitent une dissociation ou une fixation tissulaire, perdant ainsi le contexte spatial et entravant l’analyse des interactions cellule-cellule 5,6. Ainsi, le développement de technologies non destructives à haute résolution pour la détection in situ de cellules viables est essentiel pour élucider les mécanismes de résistance au CHC et guider les thérapies de précision.

Afin de détecter et d’afficher rapidement les cellules viables dans les tissus du CHC in situ sans traitement destructeur, une méthode simple de culture tissulaire à base de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) a été développée. En bref, les tissus minces frais du CHC (environ 1 × 1 × 0,2 cm3) ont d’abord été cultivés dans un milieu DMEM pendant 3 h contenant 20 % de sérum de veau fœtal (FBS) et de MTT (1 mg/mL). Ensuite, après une fixation à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) et un montage contenant du DAPI, des lames de tissu congelées incluses dans de l’OCT (20 μm d’épaisseur) ont été soumises à une observation microscopique sous une lumière vive ou UV. Les cellules viables afficheront une coloration violette, rouge-violet ou violet-noir. En utilisant ce protocole, nous avons réussi à détecter les cellules viables dans les tissus du CHC en 5 heures. Parallèlement, cette méthode préserve la microarchitecture 3D, est compatible avec l’analyse multi-omique en aval et est simple, tout en permettant d’économiser du temps et de l’argent. Cependant, cette méthode présente certaines limites. Les processus en plusieurs étapes de lavage, de sectionnement et de culture peuvent induire une déformation structurelle et une apoptose dans les tissus, en particulier dans les échantillons à métabolisme élevé, tels que le tissu CHC dans cette étude. De plus, l’épaisseur accrue des coupes de cryosection compromet la clarté et la planéité des observations microscopiques.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément à la Déclaration d’Helsinki et approuvées par le Comité d’éthique du premier hôpital affilié de Quanzhou (n°. FJMU IACUC2021257). Les tissus du CHC ont été retirés chirurgicalement et prélevés au premier hôpital de Quanzhou, affilié à l’Université de médecine du Fujian, avec le consentement éclairé des patients. Cette expérience nécessite des mesures de protection standard, notamment le port d’une blouse de laboratoire, d’un masque jetable et de gants.

1. Préparation des tissus

  1. Placez une boîte de Pétri stérile de 9 cm sur de la glace. Ajouter 30 ml de solution saline tampon phosphate (PBS) glacée.
  2. Transférez immédiatement le tissu CHC humain réséqué chirurgicalement dans le PBS.
  3. Agitez doucement le plat pendant 5 secondes pour éliminer les contaminants sanguins. Aspirer le PBS à l’aide d’une pipette stérile.
    REMARQUE : Répétez trois fois.
  4. Transférez le mouchoir sur le couvercle de la boîte de Pétri.
    REMARQUE : Les mouchoirs adhèrent facilement au couvercle de la boîte de Pétri non mouillé pour une meilleure manipulation par la suite.
  5. Coupez le tissu en fragments d’environ 1 × 1 ×0,2 cm 3 à l’aide d’une lame chirurgicale stérile (n° 11).
    REMARQUE : La longueur et la largeur des fragments peuvent être modifiées, mais la profondeur doit être inférieure à 0,2 cm.
  6. Remettre les fragments dans un plat frais de 9 cm rempli de 30 ml de PBS glacé.
  7. Agitez doucement le plat pendant 5 secondes pour éliminer les contaminants sanguins. Aspirer le PBS à l’aide d’une pipette stérile.
    REMARQUE : Répétez l’étape 1.7 trois fois. Un fragment de tissu bouilli dans du PBS (95 °C, 10 min) a été défini comme un témoin négatif. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles.

2. Culture tissulaire

  1. Ajouter 1,8 mL de milieu de culture complet DMEM (préchauffé à 37 °C) contenant du glucose (concentration finale = 4,5 g/L) et de la L-glutamine (concentration finale = 2 mM) dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Ensuite, ajoutez 0,6 mL de FBS (concentration finale = 20 % v/v) et 0,6 mL de MTT (concentration finale = 1 mg/mL) dans chaque puits d’une plaque à 6 puits.
  2. Transférez les fragments de tissu dans des puits à l’aide d’une pince stérile.
  3. Placez la plaque à 6 puits dans l’incubateur. Incuber pendant 3 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
    REMARQUE : Tournez doucement la plaque pendant 3 s toutes les 30 min. L’incubation pourrait prendre fin lorsque la surface des fragments de tissu devient violette ou violet-noir.

3. Résiliation et fixation

  1. Aspirez le support MTT. Lavez les fragments de tissus avec une solution saline glacée.
    REMARQUE : Répétez cinq fois.
  2. Ajouter 2 ml de formol à tampon neutre (FBN) à 4 % dans chaque puits d’une plaque à 6 puits.
  3. Placez la plaque au réfrigérateur à 4 °C pendant 1 h.

4. Cryosection

  1. Épongez doucement les fragments sur du papier absorbant propre.
  2. Placez le tissu dans un cryomoule rempli de composé OCT.
    REMARQUE : Assurez-vous que le tissu est entièrement recouvert de composé OCT.
  3. Congelez le mouchoir dans un réfrigérateur à basse température à -80 °C pendant 20 min.
  4. Montez le bloc congelé sur un mandrin de cryostat à -20 °C.
  5. Coupez des sections de 100 μm à -20 °C jusqu’à ce que la surface du tissu soit exposée.
    REMARQUE : La surface du tissu présente une coloration violette.
  6. Prélever des tranches de 20 μm à l’aide de lames enduites d’adhésif.
    REMARQUE : Les tranches de tissu doivent se présenter dans une nuance de violet, violet-rouge ou violet-noir.
  7. Fixez les tranches dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à température ambiante pendant 2 min.
  8. Rincez doucement les lames avec du PBS pendant 1 min.
    REMARQUE : Répétez trois fois.

5. Montage

  1. Appliquer 1 goutte de produit de montage contenant du DAPI (concentration finale : 1 μg/mL).
  2. Couvrir avec une lamelle.
  3. Scellez les bords avec du vernis à ongles.
    REMARQUE : Les lames avec des bords scellés peuvent être stockées à 4 °C dans l’obscurité si la microscopie n’est pas effectuée immédiatement.

6. Microscopie

  1. Visualisez des dépôts de formazan violet, rouge-violet ou violet-foncé (cellules viables) à un grossissement de 20× sous fond clair à l’aide de la microscopie à fond clair.
  2. Détectez les DAPI bleus (noyaux) sous éclairage UV à l’aide de la microscopie à fluorescence.
  3. Fusionnez les canaux en fond clair et en fluorescence pour une corrélation spatiale.
    REMARQUE : Le logiciel utilisé ici est NIS Element F (version 4.00.06).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Cette étude a permis de détecter avec succès des cellules métaboliquement actives dans le tissu CHC sans perturber l’architecture tissulaire. Tout d’abord, les images en fond clair (Figure 1A) ont montré que la surface du tissu présentait une couverture cellulaire dense et un empilement multicouche de cellules sur la lame, confirmant l’intégrité architecturale préservée du tissu CHC tout au long de la culture et du traitement. Notamment, des amas de cellules dans les régions superficielles p...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les méthodologies actuelles de détection in situ de cellules viables se heurtent encore à de multiples limites. L’IHC et l’immunofluorescence (IF), qui sont largement utilisées pour identifier les marqueurs de prolifération ou les protéines liées à l’apoptose, souffrent d’une perturbation de l’intégrité de la membrane induite par la fixation du formaldéhyde7. De plus, la pénétration des anticorps dans les sections de tissus épais n’est pas optimale

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le Bureau des sciences et de la technologie de la ville de Xiamen (n° 3502Z20227197), le Fonds de démarrage pour la recherche scientifique de l’Université médicale du Fujian (2021QH1240). Nous remercions Xianying Zhang, Jingjing Zhou et Shaocong Weng (Université Huaqiao) pour leur assistance technique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
-80 ° ; C congélateur (vertical)Thermo Fisher ScientificTSX60086V
Établi propre (écoulement laminaire vertical)AIRTECHSW-CJ-1FD
Incubateur CO2 (165 L)Thermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i (par exemple, 51030400 / 51033559)
Borderline (24 et fois ; 50 mm, #1,5)CITOGLAS (Citotest)0341-3610
Boîte de pétri de culture (90 mm)NID752001 (exemple)
Milieu de montage contenant DAPIBeyotimeP0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (glucose élevé, avec pyruvate)Invitrogen (Gibco)11995-065
FBS (Qualifié, origine américaine)Invitrogen (Gibco)A3160501
Microscope fluorescentNikonSérie ECLIPSE Ti2
Microtome de congélation (cryostat)LeicaCM1950
Lames de microscope (simples, 25 et plus de fois ; 75 mm)CITOGLAS (Citotest)0317-0001
Réactif MTT (poudre)BeyotimeST316
Vernis à ongles (transparent)Beyotime&mdash ;
NBF (Formol tamponné neutre)Beyotime&mdash ;
Composé OCTSAKURA (Sakura Finetek)4583
Microscope optique (vertical)NikonSérie Ci de l’ECLIPSE (par exemple, Ci-L)
PBS (500 mL)BeyotimeC0221A
PFA, 4 % dans le PBS (fixatif)BeyotimeP0099
Embout de pipette (1 mL, faible liaison)KIRGENKG1313-L
Pointe de pipette (200 & micro ; L)Axygène (Corning)T-200-Y (en volume) / T-200-Y-R-S (racké, stérile)
Pipettor (canal unique)Thermo Fisher ScientificFinnpipette F2 (cat# spécifique à la plage)
ScalpelHYSTICLe modèle varie (par exemple, référence fournisseur 100022208326)
PinceHYSTICLe modèle varie

Références

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
  6. He, J. The lactate receptor HCAR1 drives the recruitment of immunosuppressive PMN-MDSCs in colorectal cancer. Nat Immunol. 26 (3), 391-403 (2025).
  7. Zhou, H. G., Guo, M. Y., Li, J. Y. Hypoxia-triggered self-assembly of ultrasmall iron oxide nanoparticles to amplify the imaging signal of a tumor. J Am Chem Soc. 143 (4), 1846-1853 (2021).
  8. Baker, A. M., Huang, W. N., Wang, X. M. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nat Commun. 8 (1), 1998(2017).
  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Imagerie MTTcartographie des cellules viablesmicroenvironnement tumoralr sistance aux th rapiescristaux de formazanisolation de cellules uniques
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.