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Article de méthode

Surexpression et purification d’une nucléase toxique d’Escherichia coli

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DOI :

10.3791/68577

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29 août 2025

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit une méthodologie de surexpression de Nsp15 recombinant, une nucléase toxique, dans un système d’expression C41(DE3), suivie d’une purification de la protéine marquée à l’aide de la chromatographie d’affinité et d’exclusion stérique. Ces protocoles peuvent être adaptés à d’autres protéines toxiques difficiles.

Résumé

Escherichia coli a été largement utilisé comme système d’expression pour produire des protéines recombinantes. Pourtant, certains types de protéines recombinantes, telles que les nucléases, peuvent être difficiles à surexprimer de manière recombinante chez E. coli en raison de leur activité enzymatique sur l’ADN cellulaire ou l’ARN. De tels effets toxiques peuvent entraîner une croissance lente et de faibles rendements en protéines. C’est le cas, par exemple, de l’endoribonucléase Nsp15 des coronavirus : les rendements du gamma-coronavirus Nsp15 de type sauvage (WT) sont beaucoup plus faibles que ceux de Nsp15 catalytiquement inactif. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé des cellules C41(DE3) et des cultures de démarrage d’une seule colonie le même jour pour aider à réduire la toxicité. Nsp15 recombinant contenant un marqueur N-terminal 6xHis-tag a été surexprimé et purifié à l’aide d’une chromatographie d’affinité basée sur le cobalt suivie d’une chromatographie d’exclusion stérique (SEC). Les rendements résultants en protéines purifiées sont suffisants pour les tests biochimiques et les études structurelles de cryo-microscopie électronique. Cette approche s’est avérée efficace pour atténuer les effets toxiques et obtenir des rendements en protéines satisfaisants pour une analyse plus approfondie.

Introduction

Escherichia coli (E. coli) est une bactérie largement utilisée pour produire des protéines recombinantes. De nombreuses souches mutantes, dont BL21(DE3) et ses dérivés, ont été développées pour exprimer les protéines cibles1. Le processus est généralement piloté par une ARN polymérase T7 d’un bactériophage codé et induit par l’isopropyl ß-D1-thiopalactopyranoside (IPTG), un analogue du lactose qui activera l’opéron lac en libérant le répresseur lac 1,2,3. Parce qu’il n’est pas hydrolysable, il y a une expression continue de l’ARNm et une production de protéines plus élevée3.

Bien que ce type de système soit pratique et cohérent pour de nombreuses protéines, certains types de protéines recombinantes induisent une toxicité chez E. coli, entraînant de faibles rendements en protéines. La toxicité due à la présence de protéines recombinantes affectant négativement les bactéries peut être due à une expression perméable avant l’induction ou à un stress pour les bactéries lors de l’induction 3,4. Le résultat est une diminution du taux de croissance et de la viabilité des bactéries5. La suppression de l’expression fuyante peut jouer un rôle important dans l’expression réussie des protéines toxiques. Les souches d’expression d’E. coli avec les plasmides pLysS (c’est-à-dire BL21(DE3)pLysS, C41(DE3)pLysS, etc.) suppriment l’expression fuyante en exprimant un lysozyme T7 qui inhibe la polymérase T7 avant l’induction 6,7. D’autres souches, telles que les souches C41(DE3) et C43(DE3), contiennent des mutations qui réduisent l’activité de la polymérase T7 en réduisant ses niveaux d’ARNm, et éliminent les protéases lon et ompT 1,4,8,9,10. La suppression de l’expression fuyante ou la réduction du taux de production de protéines recombinantes (via la régulation de la polymérase T7 ou la diminution des températures) contribue à augmenter le rendement en protéines toxiques 1,9.

Les nucléases sont souvent des protéines toxiques et difficiles à exprimer lors de l’utilisation d’un système d’expression d’E. coli en raison de leur activité enzymatique envers l’ADN cellulaire ou l’ARN1. Par exemple, l’endoribonucléase Nsp15 présente dans les coronavirus et autres nidovirus est toxique pour les bactéries, ce qui entraîne un taux de croissance plus lent et de faibles rendements 11,12,13,14,15,16,17. En raison de son rôle catalytique, ccivant 3' des uridines dans l’ARN viral, on pense que Nsp15 agit à la fois sur son propre ARNm et sur l’ARNm cellulaire lorsqu’il est exprimé de manière recombinante, ce qui entraîne une dérégulation du métabolisme et de l’expression de la protéine recombinante11,14. Pour Nsp15, l’oligomérisation est nécessaire à l’activité enzymatique. Des études antérieures sur le bêta-coronavirus (comme le SRAS et le SRAS-CoV-2) Nsp15 ont démontré que l’enzyme s’oligomérise principalement en un homohexamère en solution, la forme monomère étant inactive 16,18,19,20. Lorsqu’ils ont muté pour ne former que des monomères, des augmentations significatives du rendement ont été observées14. De plus, lors de la mutation de l’un des résidus catalytiques au sein de la triade catalytique en alanine, une expression améliorée dans les mêmes conditions que le WT a été observée, ce qui confirme que la toxicité de Nsp15 pour E. coli est déterminée par son activité nucléase 13,16,17. Dans ce protocole, nous montrons la différence de rendement entre le gamma-coronavirus WT (virus de la bronchite infectieuse) Nsp15 et une version catalytique-morte obtenue par mutation de l’un des résidus catalytiques de l’histidine (H223A).

Nous décrivons ici une méthodologie étape par étape pour surexprimer Nsp15 recombinant dans un système d’expression C41(DE3), suivie d’une purification de protéines par chromatographie d’affinité et d’exclusion stérique. Une étiquette His-His-Tag N-terminale 6x avec chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) à base de cobalt est utilisée pour isoler la protéine. Une purification ultérieure est effectuée via SEC pour séparer Nsp15 par état oligomérique et isoler les espèces hexamères actives. Cette approche offre une méthode pour surexprimer et purifier les nucléases toxiques pour des études biochimiques et structurales.

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Protocole

1. Préparation pour tampon et réactifs

  1. Réactifs de surexpression
    1. Préparez 1 L de milieu 2xTY en combinant 16 g de tryptone, 10 g d’extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium (NaCl) et 900 ml d’eau déminéralisée dans une fiole défisée de 2 L. Autoclavez le ballon pendant au moins 30 min sur un cycle liquide.
      REMARQUE : Au moins 2L de milieu 2xTY est nécessaire par purification.
    2. Préparez le(s) stock(s) d’antibiotiques approprié(s) pour le plasmide. Pour Nsp15-pET-14b, préparez 15 mL d’ampicilline à 100 mg/mL en dissolvant 1,5 g d’ampicilline avec de l’eau désionisée dans un tube conique de 15 mL. Conservez les stocks d’antibiotiques à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    3. Préparez 250 ml de gélose au bouillon de lysogénie en combinant 2,5 g de tryptone, 1,25 g d’extrait de levure, 2,5 g de NaCl, 3,75 g d’agarose et 250 ml d’eau déminéralisée dans une bouteille en verre de 500 ml. Stérilisez la solution en autoclave pendant au moins 30 minutes sur un cycle liquide et laissez-la refroidir jusqu’à ce qu’elle soit chaude au toucher.
    4. Préparez des plaques de gélose LB complétées par de l’ampicilline en transférant 25 mL de gélose LB chaude dans un erlenmeyer stérilisé de 250 mL (25 mL par plaque à préparer). Ajouter 25 μL d’ampicilline à 100 mg/mL pour chaque 25 mL de milieu et agiter pour combiner le contenu. À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 25 ml de mélange de milieu dans une boîte de Pétri en plastique stérile ; Évitez d’introduire des bulles.
      1. Prévenez la contamination en essuyant la paillasse du laboratoire avec de l’éthanol à 20 % et en allumant un bec Bunsen pour maintenir la stérilité pendant que vous versez les plaques.
      2. Laissez refroidir les plaques avant de les stocker à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
    5. Préparez 15 mL de 1 M d’IPTG en dissolvant 3,574 g d’IPTG avec de l’eau désionisée dans un tube conique de 15 mL. Conserver à -20 °C jusqu’à utilisation. Évitez les cycles répétés de congélation/décongélation en effectuant une aliquote en trois aliquotes de 5 mL.
  2. Réactifs de purification
    REMARQUE : Tous les réactifs doivent être préparés au moins un jour avant la purification
    1. Préparez 250 mL de tampon de lyse (50 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 5 % de glycérol, 5 mM d’imidazole) et conservez-le à 4 °C.
    2. Préparez 15 mL de tampon d’élution (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 % de glycérol, 250 mM d’imidazole) et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    3. Préparez 250 ml de tampon de clivage (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 % de glycérol) et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    4. Préparez 1 L de tampon SEC (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl2) et filtrez à travers un filtre PES de 0,22 μm à l’aide d’une filtration sous vide. Conserver à 4 °C avec FPLC.
    5. Préparez 15 mL de chlorhydrate de fluorure de 4-(2-aminoéthyl)benzènesulfonyle (AEBSF) en dissolvant 3,595 g d’AEBSF avec de l’eau désionisée dans un tube conique de 15 mL. Préparez 1 mL d’aliquotes dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et conservez-les à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    6. Facultatif : Préparez le mélange maître de tampon de charge de gel de dodécylsulfate de sodium (SDS) en diluant 200 μL de solution mère (250 mM Tris pH 6,8, 8 % SDS, 0,1 % de bleu de bromophénol, 40 % de glycérol, 100 mM de DTT) dans 400 μL d’eau désionisée.
    7. Préparez des tubes d’échantillons de gel pour suivre la purification. Transférez 30 μL de 1x tampon de chargement dans chaque tube.
    8. Préparez 1 L de tampon courant 10x Tris-Glycine en dissolvant 30 g de base Tris, 144 g de glycine et 20 g de SDS, dans 1000 mL d’eau déminéralisée. Pour une solution 1x, diluer 100 mL de la solution 10x dans 900 mL d’eau déminéralisée dans une bouteille de 1 L. Conservez les deux réactifs à température ambiante jusqu’à nouvel ordre.

2. Surexpression de Nsp15

REMARQUE : Tous les réactifs et matériaux doivent être conservés aussi stériles que possible pour éviter tout risque de contamination.

  1. Transformation
    1. Retirer les cellules C41(DE3) E . coli de -80 °C et les laisser décongeler pendant 10 minutes sur de la glace. Pipeter 1 μL d’ADN plasmidique dans un tube contenant les cellules C41. Laissez incuber en le laissant reposer sur de la glace pendant 30 min.
      REMARQUE : Bien que les concentrations de plasmides puissent varier, pour les données décrites ici, 10 à 20 ng d’ADN ont été ajoutés par transformation. Le protocole commercial pour les cellules C41(DE3) recommande 10 à 50 ng d’ADN par transformation. Ce protocole est applicable à tout plasmide utilisant le système promoteur T7 ; cependant, ici, un plasmide pET14b codant pour le codon Nsp15 optimisé pour la traduction précédemment publiée, avec un site TEV suivant le marqueur N-terminal 6xHis-tag et le site de clivage de la thrombine, a été modifié en remplaçant SARS-CoV-2 Nsp15 par la séquence IBV Nsp15 (GENBANK : WIL95322.1, 5989-6324)19.
    2. Placez le tube dans un bloc chauffant à 42 °C pendant 45 s pour choquer thermiquement les cellules afin qu’elles absorbent les plasmides. Incuber le tube sur de la glace pendant 2 min.
    3. Pipeter 200 μL de milieu de récupération (SOC ou autre milieu riche) dans le tube contenant les cellules C41(DE3) et les plasmides. Agiter à 210 tr/min pendant 1 h à 37 °C.
    4. Retirer les plaques de gélose LB enrichies d’ampicilline à 4 °C et les placer dans un incubateur non agitateur réglé à 37 °C.
    5. Pipeter les bactéries sur la plaque de gélose. À l’aide d’un épandeur stérile, étalez les cellules sur la plaque de gélose. Placez la plaque dans un incubateur non secouant réglé à 37 °C pour une croissance de 14 à 16 h.

3. Croissance

  1. Cueillette d’une seule colonie
    REMARQUE : Des démarreurs d’une seule colonie le jour même ont été utilisés plutôt qu’une culture de démarrage d’une nuit afin d’inoculer les cellules dans la phase de croissance logarithmique. Pour les cultures nocturnes, les cellules sont généralement en phase stationnaire ou de mort, en particulier avec des protéines toxiques. De plus, avec des temps de culture plus longs, les contaminants ou les mutants peuvent supplanter les nucléases toxiques.
    1. Utilisez un erlenmeyer stérilisé de 50 ml pour chaque litre de culture, plus 2 ou 3 levains supplémentaires. Étiquetez l’un des flacons avec une étoile pour les contrôles de densité optique (DO). La DO recueillie dans ce flacon représentera la croissance entière, à moins qu’il n’y ait une différence visuelle entre les flacons.
      REMARQUE : Les fioles Erlenmeyer offrent une meilleure aération que les tubes de démarrage de 15 ml.
    2. Créez un mélange maître de 2xTY et d’antibiotiques appropriés en utilisant un volume de 10 mL x N de démarreurs. Pour une croissance de 4 L, faites 6 cultures de démarrage. Le mélange maître serait composé de 60 μL de stock d’ampicilline (décongelé à partir de -20 °C) et de 60 mL de 2xTY (dilution 1:1000). Mélanger et aliquote 10 mL dans chaque erlenmeyer.
    3. Retirez la plaque transformée de l’incubateur. Retirez une seule colonie isolée de la plaque à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de pipette. Transférez le cure-dent avec la colonie dans une fiole avec du milieu. Répétez l’opération jusqu’à ce que chaque fiole contienne un cure-dent.
    4. Placez les flacons de démarrage inoculés dans l’incubateur à agitation à 210 tr/min, 37 °C. Laissez pousser les flacons de démarrage pendant ~5-7 h.
  2. Inoculation de la culture
    1. Après 5 h, vérifier la DO à 600 nm (OD600) de la fiole marquée d’une étoile à l’aide d’une microcuvette et d’un spectromètre. Retirer et transférer 1 mL de la culture de la fiole dans une microcuvette. Répétez les mesures périodiquement jusqu’à ce que l’OD600 atteigne 0,8-1,0.
    2. 30 min à 1 h avant l’inoculation (lorsque la DO600 atteint 0,4), réchauffer les flacons de 2 L 2xTY à 37 °C. Les milieux chauds réduisent le temps de latence après l’inoculation avec la culture de démarrage.
    3. Décongeler un stock d’ampicilline de 100 mg/mL à -20 °C. Une fois que la DO ciblede 600 est atteinte, préparer quatre fioles de 2 L avec 1 L de milieu 2xTY en ajoutant 1 mL de 100 mg/mL d’ampicilline (dilution 1:1000).
    4. Pour inoculer, verser le contenu d’une fiole de démarrage dans une fiole de 2 L. Répéter l’opération jusqu’à ce que chaque fiole de 2 L soit inoculée. Évitez de verser le cure-dent dans le flacon pour faciliter la récolte des cellules.
    5. Placez les flacons de 2 L inoculés dans l’incubateur à agitation à 210 tr/min, 37 °C pendant 3 h avant de vérifier la première OD600.
  3. Induction avec IPTG
    1. Vérifiez l’OD600 en prélevant 1 mL de milieu d’une fiole à l’aide d’une pipette sérologique. Répétez l’opération jusqu’à ce que l’OD600 atteigne 0,8-1,0.
    2. Une fois que la DO ciblede 600 est atteinte, ajouter 1 mL de 1 M IPTG pour une concentration finale de 1 mM (décongelée à partir de -20 °C) pour induire la surexpression.
    3. Transférez les flacons de 2 L dans un incubateur à agitation à 210 tr/min, 16 °C pour une induction pendant la nuit (14-16 h).
      REMARQUE : La température plus froide ralentira la croissance des cellules E. coli , réduisant ainsi la toxicité en ralentissant la production de protéines et l’activité des nucléases.
  4. Récolter
    1. Retirez les fioles induites de l’incubateur à agitation et versez le contenu dans des flacons à centrifuger séparés de 1 L. Équilibrez les bouteilles à l’aide d’eau déminéralisée. Faites tourner les cellules à 4500 x g pendant 10 min à 4 °C.
    2. Retirer le surnageant et transférer la pastille dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une spatule. Combinez les granulés en un seul tube conique. Conserver à -80 °C jusqu’à nouvel ordre.

4. Purification Nsp15

REMARQUE : Tous les tampons et tubes doivent être conservés sur de la glace. Toutes les étapes de centrifugation doivent être effectuées à 4 °C. Le protocole suivant suppose une protéine marquée His.

FACULTATIF : Après chaque étape, des échantillons de gel peuvent être prélevés pour suivre la progression de la purification.

  1. Lyse cellulaire et clarification des lysats
    1. Remettez la pastille bactérienne en suspension en ajoutant 2 mL de tampon de lyse pour 1,2 g de pastille. Ajouter 100 μL de 1 M d’AEBSF pour 10 mL de tampon de lyse comme inhibiteur de protéase. Si vous utilisez une pastille combinée de 4 L, ajoutez 100 μL de DNase I pour une concentration finale de 200 U.
      REMARQUE : Un comprimé cocktail d’inhibiteur de protéase sans EDTA par L peut être substitué en tant qu’inhibiteur de protéase.
    2. Agitez brièvement le contenu du tube pendant 30 s pour permettre au granulé et au tampon de se mélanger. Transférez la pastille vortexée dans un broyeur de tissus Dounce. Avec un pilon lâche, homogénéisez le contenu (~10 coups).
    3. Transférez l’échantillon homogénéisé dans un bécher métallique pour la sonication.
      1. Pour s’assurer d’obtenir le maximum d’échantillons, rincez le tube contenant la pastille d’origine avec 5 mL de tampon de lyse et agitez brièvement le tube. Versez le contenu dans l’homogénéisateur Dounce, appliquez ~5 coups, puis transférez dans le bécher à sonication.
    4. Dans le bécher métallique, ajoutez 75 μL de Triton X-100 pour aider à la lyse et à la solubilisation de la membrane. Placez le bécher métallique dans un bain de glace pour vous assurer que l’échantillon reste froid pendant la sonication.
    5. Placez la sonde de sonication dans le bécher métallique et sonicez l’échantillon pendant 6 min et 30 s avec des impulsions toutes les 2 s et une amplification à 70 %.
      ATTENTION : Utilisez une protection auditive si la sonde sonicatrice n’est pas fermée.
    6. À l’aide d’une pipette sérologique, transférez le lysat dans un tube à centrifuger. Dans le même tube, ajoutez 1 M d’AEBSF à une dilution de 1:100 en tant qu’inhibiteur de protéase frais. Clarification du lysat par centrifugation à 26 915 x g pendant 50 min.
  2. Chromatographie d’affinité par filtration gravitaire
    REMARQUE : La résine de cobalt diminue considérablement les liants métalliques non spécifiques par rapport à la résine de nickel21.
    1. Pendant la sonication, obtenir 2 mL de boue de résine de cobalt et remettre en suspension avec 25 mL de tampon de lyse dans un nouveau tube conique. Centrifuger la résine remise en suspension pendant 5 min à 500 x g. Après la centrifugation, videz le surnageant en faisant attention de ne pas perdre de résine.
    2. Répéter l’opération avec deux lavages distincts de 25 mL de tampon de lyse suivis d’une centrifugation. Ne versez pas le surnageant du dernier lavage avant de pouvoir le relier par lots. Lorsque vous êtes prêt, versez le tampon de lyse du dernier lavage de résine et remettez la résine en suspension avec 10 ml de tampon de lyse frais (10 ml de tampon pour 1 ml de résine).
    3. Ajoutez la fraction soluble dans le tube et laissez la protéine 6x marquée His-marquée se lier par lots à la résine sur une bascule pendant 45 min à 4 °C.
      REMARQUE : Si le volume de liaison du lot dépasse 50 ml, effectuez cette étape dans un bécher de 250 ml avec une barre d’agitation à une vitesse très lente à 4 °C. Transférez toute la résine dans le bécher lors de l’exécution de cette étape à l’aide d’un tampon de lyse.
    4. Après la liaison du lot, versez le contenu dans une colonne de filtration par gravité et recueillez le flux dans un erlenmeyer de 125 ml. Le contenu du ballon doit être constitué de protéines qui ne se sont pas liées à la résine ; Nsp15 sera lié à la résine. À l’aide d’un flacon séparé pour le prélèvement, laver la résine avec 8 x 25 mL de tampon pour un total d’au moins 200 mL (~5x le volume d’origine) à l’aide d’une pipette sérologique.
      REMARQUE : Ajoutez lentement le tampon sur le côté de la colonne plutôt que directement au milieu pour éviter de perturber le lit de résine, ce qui peut entraîner un lavage inefficace ou inégal.
  3. élution des protéines
    1. Éluer le Nsp15 marqué par His-marqué en trois élutions avec tampon d’élution. Les élutions 1 et 2 sont des élutions de 2 ml, et l’élution 3 est une élution de 1 ml.
    2. Effectuez un test de Bradford « rapide et sale » en faisant une dilution 1:1 du réactif de Bradford dans l’eau. Transvaser 10 μL de chaque élution dans des tubes et retourner pour mélanger. La solution doit devenir bleue en présence de protéines. Évaluez le changement de couleur pour déterminer comment combiner les élutions.
      REMARQUE : Si les élutions 1 et 2 sont fortes et que l’élution 3 est faible, combinez les élutions 1 et 2 et continuez. Si tous sont faibles, combinez les trois tubes.
  4. Concentration en protéines et clivage de l’étiquette
    1. Transvaser l’échantillon d’élution combiné dans un concentrateur MWCO de 30 kD (ou de taille appropriée pour la protéine d’intérêt). Concentrer la protéine à ≤2 mL en centrifugeant à 3 000 x g pendant 10 min. Transvaser l’échantillon concentré dans un tube de microcentrifugation de 2 ml. Porter le volume final de l’échantillon à 2 mL avec un tampon de clivage si nécessaire.
    2. Préparez une colonne de dessalage jetable (p. ex., colonne-10) selon les instructions du fabricant. Ajouter l’échantillon de 2 mL à la colonne. Placer la colonne dans un tube conique propre de 50 mL et éluer par centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min.
      REMARQUE : Cette étape élimine rapidement l’imidazole, qui interfère avec le clivage de la thrombine tout en évitant l’agrégation induite par la concentration lors de l’utilisation de concentrateurs MWCO pour tamponner l’échange.
    3. Pour l’éluat, ajoutez du β-Me et du CaCl2, à une concentration finale de 2 mM chacun. Ajouter 50 μL d’un stock de thrombine de 1 U/μL. Une fois tous les composants ajoutés, placez le tube sur un agitateur vertical et laissez la réaction incuber à température ambiante pendant 4 h en secouant doucement.
      REMARQUE : Un clivage nocturne à 4 °C peut fonctionner pour certaines protéines ; de meilleurs rendements de Nsp15 ont été observés avec un clivage de 4 h à RT par rapport à un clivage de 4 °C pendant la nuit.
    4. Rééquilibrer la colonne de filtration par gravité dans le tampon de clivage (laver 3x avec 25 mL de tampon de clivage). Assurez-vous que le robinet d’arrêt est fermé et ajoutez 5 ml de tampon de décolletage pour éviter que la résine ne se dessèche. Stockez la colonne à 4 °C pendant la période de clivage.
  5. Séparation de la protéine clivée de l’His-tag clivé et de la protéine non clivée
    1. À l’aide d’une pipette sérologique, pipeter soigneusement la réaction de clivage directement sur la résine et recueillir l’éluat dans un tube conique de 15 ml.
    2. Lavez la résine avec 2 ml de tampon de décolletage et recueillez-la dans le même tube de 15 ml. Répétez l’opération pour un total de deux lavages. Une fois terminé, ajoutez de l’AEBSF dans le tube pour éteindre la thrombine afin d’obtenir une concentration finale de 10 mM.
    3. Transférez l’échantillon de repas dans un nouveau concentrateur MWCO de 30 kD. Concentrer la protéine à ≤ 500 μL par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min. Transvasez l’échantillon concentré dans un tube de microcentrifugation de 0,5 mL.
  6. Chromatographie d’exclusion stérique
    1. Exécutez une colonne analytique d’augmentation S200 (ou une autre colonne de calibrage appropriée pour la protéine d’intérêt) conformément aux spécifications du fabricant. Équilibrez dans le tampon SEC et réglez la taille de la fraction FPLC à 500 μL.
    2. Transférez les tubes de fraction sélectionnés des pics dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et ajoutez 2,5 μL de DTT 1 M (concentration finale 5 mM) à chaque fraction pour maintenir la Nsp15 purifiée réduite.
    3. Mesurez les valeurs A280 de chaque fraction à l’aide d’un nano-spectrophotomètre. Obturez l’instrument avec un tampon SEC avant de collecter les mesures. Conservez les échantillons purifiés de Nsp15 à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.
  7. Facultatif : Contrôle de purification
    1. Chauffer les tubes d’échantillon en gel sur un bloc chauffant à 95 °C pendant 10 min. Centrifugez brièvement les tubes après les avoir chauffés pour éliminer toute condensation. Chargez les échantillons sur 4-20 % de gel(s) Mini-Protean TGX sans coloration et faites-le fonctionner à 300 V pendant 17 min. Imagez le(s) gel(s) pour vérifier la pureté.

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Résultats

En raison de la toxicité de Nsp15 en tant que nucléase, un total de ~7 h était généralement nécessaire pour que les cultures de démarrage atteignent une DO600 de 0,8-1,0. Une fois inoculé, un total de ~3 à 5 h était généralement nécessaire pour la même DOoptimale de 600 de 0,8 à 1,0 pour l’induction. Dans ce cas, le temps de doublement semblait être de ~1 h. Lorsqu’un mutant catalytiquement mort de Nsp15 a été exprimé, le doublement des cellules E. coli est apparu normal (~20 min), preuve s...

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Discussion

Nous avons présenté un protocole détaillé qui aboutit à la surexpression réussie chez E. coli d’une nucléase toxique et à la purification à l’aide de la chromatographie d’affinité et d’exclusion stérique. La mise en œuvre de cultures de démarrage d’une seule colonie de 10 ml le même jour au lieu de cultures de démarrage de nuit a permis d’augmenter l’uniformité des temps de croissance et des rendements en protéines dans toutes les croissances. Nous avons choisi d’utiliser des ce...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été financé par le financement de démarrage de l’École des sciences naturelles et environnementales du Collège de Charleston, la recherche de premier cycle et les activités créatives de premier cycle du Collège de Charleston avec subvention de la faculté et la sous-bourse SC INBRE DRP de P20GM103499.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 et micro ; m PES, stérilisant, faible liaison protéique, système de filtration, 1 LCorning431098
Inhibiteur de la sérine protéase AEBSFGoldbio30827-99-7
Gélose bactériologiqueAmrescoJ637
Ä ; Système de purification KTA goCytiva29383015
Concentrateur Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa MWCOMilliporeUFC903024
Ampicilline sodiqueGoldbioA-301-25
Fioles agitées à chicanesNalgene  ;F0527
Centrifugeuse de paillasseEppendorf  ;Référence 5920R
BioPhotomètre plusEppendorfE-BP6132
Thrombine bovineBioPharm91-030
Réactif de colorant BradfordBoston BioProductsBPA-200
Bleu de bromophénolSigma-Aldrich114931
Chlorure de calciumSigma-AldrichRéf. C4901
Bain sec numériqueBio Rad1660562
Écarteurs jetables, en forme de LPartenaires MedSupply62-1014-1
Le dithiothréitolGoldbio27565-41-9
DNaseI à partir du pancre bovinSigma-AldrichD4527
Broyeur de mouchoirs Douce, 40 mLWheaton357546
Colonnes de chromagtographie à colonne économiqueBio-Rad737-1532
Pétrin à douilles Enduro minimixLabnetS0600
ÉthanolSigma-Aldrich459844
Excella E25R Inc/Réf AgitateurEppendorfNB-E25R
FastPette V2LabnetP2000
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor à angle fixeThermo Fisher Scientific096-041075
Rotor à angle fixe Fiberlite F21-8x50yThermo Fisher Scientific096-084275
Imageur Gel Doc EZBio-Rad1708270
GlycérolSigma-AlrichRéférence G5516
GlycineBio-Rad161-0718
HEPESSigma-AldrichN° H3375
Agitateur à plaque chauffanteVWR12365-346
Acide chlorhydriqueVWRBDH3028
ImidazoleGoldbioN° I-902-25
Isopropyl-ß ;-D-thiogalactioside (IPTG)GoldbioRéférence 12481C25
Cellules E. coli compétentes Lemo21(DE3)Biolabs de la Nouvelle-AngleterreRéf. C2528J
Chlorure de manganèse(II) tétrahydratéSigma-AldrichRéférence M3634
Tubes de microcentrifugation, 0,5 mLVWR87003-290
Tubes de microcentrifugation, 1,7 mLPartenaires MedSupply15-1151
Tubes de microcentrifugation, 2 mLAxygenMCT-200-C
Cellule d’électrophorèse verticale mini-PROTEAN tetraBio-Rad10025025
Gels de tris-glycine mini-protéiformes, 4-20 %Bio-Rad4568094
Mini centrfuge MyFugePartenaires MedSupplyRéf. C1008-B
Flacon de centrifugeuse super-vitesse Nalgene 1 LThermo Fisher Scientific3141-1006
Tube à centrifuger Nalgene oak ridgeThermo Fisher Scientific31139-0050
NanophotomètreImplen3769
Incubateur non secouantLabnetI 5110  ;
Surexprimer les cellules C41(DE3) chimiquement compétentesTechnologies de biorecherche60442-1
Surexprimer les cellules C41(DE3) chimiquement compétentesSigma-AldrichCMC0017Abandonné; Les cellules Biosearch C41(DE3) ou NEB Lemo21 sont une alternative
PétriPartenaires MedSupply62-1077-3
Plasmides (squelette pET-14b)RédacteurCommande personnalisée
Micro-cuvettes en plastiqueFisher Scientific14955127
PowerPacalimentation universelleBio-Rad1645070
Aiguille de glissement de précisionBecton Dixon305198
Normes de précision et non colorées de protéinesBio-Rad1610363
Milieu d’expression de récupération  ;Sigma-AldrichCMR0001K
Rotor à godets oscillants S-4x1000EppendorfEP-S4X1
Pipette sérologique, 10 mLFaclon357551
Pipette sérologique, 25 mLFaclon35725
Pipette sérologique, 5 mLFaclon35743
Pipette sérologique, 50 mLPr1maPR-Sero-50
Chlorure de sodiumSigma-AldrichRéf. S9888
Dodécylsulfate de sodiumSigma-AldrichL3771
Hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich567530
Démantravateur soniqueFisher ScientificFB505
Centrifugeuse Sorvall Lynx 4000Thermo Fisher Scientific75006580
Colonne Spephadex G-25 M-10Cytiva17085101
ß ;-MercaptoéthanolMillipore444203
Bécher Griffin en acier inoxydableVaisselle polaireRéférence 13977-010-EA
Tubes Falcon stériles, 15 mLFaucon352097
Tubes Falcon stériles, 50 mLFaucon352098
Colonne Superdex 200 10/300 GLCytiva28990944
Seringues, 1 mLAir-Tite  ;N° A1
Seringues, 3 mLBecton Dixon309657
Résine d’affinité métallique TALONTakara635503
Cure-dentsRue de la créativitéPAC3690-01
Base TrisGoldbioT-400-1
Triton X-100MP Biomédical807423
TryptoneProduits de recherche internationaleRéf. T60065
VornadoPoint de référenceBV101-G
Extrait de levureProduits de recherche internationaleY20025

Références

  1. Francis, D. M., Page, R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).
  2. Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).
  3. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).
  4. Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
  5. Kato, Y. Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production. Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).
  6. Dubendorf, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  7. Studier, F. W. Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).
  8. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  9. Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields. Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).
  10. James, J., et al. Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance. Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).
  11. Shi, Y., et al. A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11. J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).
  12. Nedialkova, D. D., et al. Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease. J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).
  13. Zhao, J., et al. Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation. J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).
  14. Joseph, J. S., et al. Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch. J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).
  15. Xie, Y., et al. Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence. Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).
  16. Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation. J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).
  17. Xu, X., et al. New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15. J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).
  18. Bhardwaj, K., et al. Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15. J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).
  19. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 12 (1), 636(2021).
  20. Kim, Y., et al. Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2. Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).
  21. Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle. Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).
  22. Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease. Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).
  23. Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification. Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).
  24. Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).
  25. Godoy, A. S., et al. Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).
  26. Otter, C. J., et al. SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).
  27. Wang, X., Zhu, B. SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).
  28. Zheng, A., et al. Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer. J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).
  29. Huang, T., et al. Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation. J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).
  30. Zhang, L., et al. Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).
  31. Jernigan, R. J., et al. Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser. Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).
  32. Ricagno, S., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus. Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).
  33. Canal, B., et al. Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease. Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).
  34. Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor. J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).
  35. De Marco, A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).

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