Article de méthode

Extraction d’histones à partir d’échantillons cliniques pour le profilage épigénétique par spectrométrie de masse

DOI :

10.3791/68584

⸱

21 novembre 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole permet une extraction efficace d’histones de divers échantillons cliniques pour une analyse ultérieure des modifications post-traductionnelles par LC-MS/MS. En facilitant la détection robuste des modifications clés des histones, il constitue un outil précieux pour un profilage épigénétique complet dans de grandes cohortes cliniques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De nombreuses preuves expérimentales soutiennent le rôle des mécanismes épigénétiques dans l’apparition, la progression et la récidive du cancer. Parmi ceux-ci, les variants des histones et leurs modifications post-traductionnelles (PTM) régulent l’organisation et la dynamique de la chromatine, ainsi que l’accessibilité du génome, influençant ainsi des processus clés basés sur l’ADN, tels que la transcription, la réplication et la réparation des dommages à l’ADN via le code dit des histones. Des schémas PTM des histones dérégulés sont fréquemment observés chez les cancers, certains marqueurs ayant démontré qu’ils servent de biomarqueurs diagnostiques et pronostiques. Ainsi, de nouvelles méthodologies permettant un profilage PTM des histones non biaisé et complet dans des échantillons cliniques sont très précieuses pour caractériser les paysages épigénétiques des tumeurs. Nous présentons ici un protocole pour l’extraction efficace des histones à partir d’échantillons cliniques, incluant les biopsies congelées instantanément, la température optimale de coupe (OCT) congelée et les biopsies intégrées à la paraffine fixée au formol (FFPE). Cette approche permet de produire des protéines d’histones en quantité et qualité suffisantes pour une analyse ascendante ultérieure par chromatographie liquide haute performance, couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS). Ce flux de travail permet la détection et la quantification robustes des modifications clés des histones, en particulier les acétylations et méthylations de la lysine, à travers des échantillons tumoraux primaires, fournissant une couche moléculaire supplémentaire pour la caractérisation du cancer.

Introduction

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Dans le noyau des cellules eucaryotes, les histones s’assemblent avec l’ADN pour former les nucléosomes, les unités structurales fondamentales de la chromatine. Chaque nucléosome est constitué d’environ 146 pb d’ADN enroulés autour d’un octamère composé de deux copies des histones du noyau H2A et H2B, ainsi que de deux dimères d’histones H3 et H4. De plus, une histone liante H1 est également présente et facilite l’organisation de la chromatine d’ordre supérieur en liant à la fois le nucléosome et l’étirement de l’ADN liant entre lesnucléosomes 1. Les histones sont décorés d’une grande variété de modifications post-traductionnelles (PTM) principalement présentes au niveau de leurs extrémités N-terminales. Ces modifications incluent la méthylation, divers types d’acylation (acétylation, propionylation, butyrylation, etc.), la phosphorylation, la SUMOylation, l’ubiquitylation, l’ADP-ribosylation et la crotonylation, parmi lesquelles la méthylation de la lysine et de l’arginine et l’acétylation de lysine sont les pluscaractérisées 2. Les types, emplacements et combinaisons spécifiques des modifications des histones créent ce que l’on appelle le code des histones. Ce code se compose de diverses modifications post-traductionnelles (PTM) sur les queues N-terminales des histones, qui sont ajoutées et retirées par des enzymes modificatrices spécifiques des histones. Ces modifications sont ensuite reconnues par les protéines effectrices, entraînant des modifications de la structure de la chromatine, telles que la compactation ou la décondensation, influençant finalement plusieurs processus biologiques, notamment la réparation des dommages à l’ADN, la réplication et en particulier la transcriptiongénique 3,4.

La méthylation de l’ADN et les PTM des histones figurent parmi les caractéristiques épigénétiques les plus étudiées chez le cancer3. Des preuves expérimentales récentes ont montré des altérations des niveaux de diverses PTM d’histones chez plusieurs types de cancer. Notamment, la perte de H4K20me3 et H4K16ac a été rapportée comme des signes distinctifs du cancer, car leur taux a été constaté diminué dans pratiquement toutes les tumeurs par rapport aux tissusnormaux 4. Notre groupe a identifié la perte de H3K14ac comme une caractéristique potentielle du cancer en quantifiant sa réduction dans plusieurs cancers par rapport aux homologues normaux utilisant des approches basées sur la spectrométrie demasse (SEP) 5. De plus, de nombreuses études ont mis en lumière la valeur pronostique des PTM des histones, montrant que les altérations de leurs niveaux globaux, principalement évaluées par immunohistochimie dans des biopsies de patients, sont corrélées à la progression du cancer, à la gradation histologique et à la réponse thérapeutique 6,7,8. Ainsi, l’analyse PTM des histones dans des échantillons de cancer est importante pour l’identification de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques, ainsi que des cibles potentielles des appelésépi-drogues 8.

Les méthodes très courantes pour l’analyse des PTM des histones dans les lignées cellulaires et les échantillons cliniques reposent sur des techniques basées sur des anticorps, telles que l’immunoblotting, l’immunohistochimie et le test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA)9. Cependant, les méthodes basées sur les anticorps présentent diverses limitations, notamment la réactivité croisée ou, inversement, le masquage del’épitope 10. La réactivité croisée se produit lorsque des anticorps se lient à des cibles non intentionnelles avec des épitopes similaires, ce qui conduit à des faux positifs potentiels, tandis que le masquage épitope fait référence à la détection manquée d’un épitope spécifique (une PTM ou variante d’une histone, dans ce cas) en raison de la présence d’autres modifications sur les résidus voisins. De plus, la quantité de tissu requise pour l’analyse de modification des histones à l’aide d’anticorps est souvent élevée, car un nombre limité de PTM peut être détecté simultanément, donc plusieurs tranches de tissu doivent être traitées pour des analysesmultiplexées 11. La spectrométrie de masse (SEP) est devenue la méthode de choix pour profiler les PTM et variants des histones, surmontant les limites des approches basées surles anticorps 5,8. La SEP repose sur la détection d’une différence de masse (Δm, delta masse) entre les masses théoriques et mesurées expérimentalement des peptides et des protéines. Il est impartial, complet et quantitatif, car il permet d’identifier et de quantifier les MTP et variantes sans nécessiter une connaissance préalable de leur site. Cela rend la SEP particulièrement précieuse pour l’analyse sensible et précise des modifications des PTM des histones dans le cancer et d’autrespathologies.

Nous décrivons ici un protocole optimisé pour l’extraction des histones à partir d’échantillons cliniques, associé au profilage basé sur la SEP des PTM des histones, appelé ensuite flux de travail épi-protéomique. Les biopsies des patients sont principalement conservées sous forme d’échantillons frais congelés (FF), d’échantillons congelés à température de coupe optimale (OCT), et d’échantillons incorporés à paraffine fixée au formol (FFPE) 12. Alors que les biopsies fraîches sont congelées instantanément dans de l’azote liquide ou de l’isopentane pré-refroidi sans ajout de milieude conservation 13, les biopsies congelées en OCT contiennent un milieu cryoprotecteur hydrosoluble, principalement composé d’alcool polyvinylique et de polyéthylène glycol, qui facilite la découpetissulaire 14. Les échantillons de FFPE, en revanche, fixés dans du formol et incorporés dans la paraffine, représentent la méthode de stockage la plus courante pour les échantillons cliniques, car ils peuvent être conservés à température ambiante pendant plusieurs années, évitant ainsi un entretien coûteux à basse ou ultra-bassetempérature 15. Exemptes d’additifs de conservation, les biopsies à gelée instantanée peuvent être directement traitées pour l’extraction des histones, tandis que les biopsies congelées par OCT et FFPE nécessitent des étapes initiales de retrait du milieu d’incorporation/fixation. Les échantillons de FFPE nécessitent également un décroisement des protéines et une récupération antigénique approfondies.

Ce protocole décrit des méthodes détaillées pour extraire les histones à partir d’échantillons cliniques fraîchement congelés, intégrés en OCT et FFPE, garantissant une quantité et une qualité suffisantes pour l’analyse en aval de la SEP en tenant compte des défis spécifiques associés à chaque type de conservation d’échantillon (étape 1). Les histones purifiées à partir d’échantillons cliniques sont séparées par électrophorèse en gel protéique en conditions de dénaturation (SDS-PAGE), suivies d’une étape de dérivation, puis digérées enzymatiquement pour générer des peptides d’une longueur appropriée (4 à 15 acides aminés) pour une analyse de spectrométrie de masseascendante 16 (étape 2). Plus précisément, les histones sont digérées selon une stratégie de type ArgC, selon laquelle la trypsine, qui coupe généralement au niveau du C-terminal des lysines (K) et arginines (R) non modifiées, est induite à ne couper qu’au niveau du C-terminal des arginines, en raison d’une acylation chimique antérieure de lysines non modifiées et monométhylées avec de l’anhydride propionique (PRO). Ensuite, les peptides d’histones digérés de type Arg-C sont acylés à leur extrémité N-terminale par l’ajout d’isocyanate de phényle (PIC). Cette dérivatisation supplémentaire augmente l’hydrophobicité peptidique et permet une meilleure séparation des peptides courts d’histones par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (RP-HPLC), améliorant l’identification et la quantification des peptidoformesisobares 17,18 (étape 3). Dans l’ensemble, les méthodes décrites ici mettent en lumière la puissance du profilage histone basé sur la SEP dans les études d’épigénétique du cancer.

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Protocole

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Des biopsies tissulaires fraîches congelées et congelées par OCT ont été obtenues sous consentement éclairé de patients opérés à l’Institut européen d’oncologie (Milan), tandis que des biopsies FFPE ont été réalisées sur des patients opérés à l’Istituto Neurologico Carlo Besta (Milan). Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut européen d’oncologie (étude UID 2550) et de l’Istituto Neurologico Carlo Besta (étude CET 39/24).

1. Extraction d’histones à partir de tissus dérivés du patient (Figure 1A)

REMARQUE : Pour analyser les histones à partir de populations tumorales représentatives et réduire la variabilité entre échantillons, il est conseillé d’utiliser des biopsies cliniques avec une cellulité tumorale d’au moins 50 % et dépourvue de zones nécrotiques et/ou d’infiltration immunitaire étendue.

  1. Enrichissement des histones à partir de tissus frais congelés (durée estimée : 60 min)
    REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées sur la glace.
    1. Décongelez le tissu sur de la glace et coupez un morceau d’environ 20 à 30 mg, correspondant généralement à environ 2mm3 de tissu.
    2. Transférez l’échantillon dans un tube de 1,5 mL et hachez le tissu en petits morceaux à l’aide de ciseaux (Table of Materials).
    3. Ajoutez 1 mL de tampon d’isolation des noyaux (Tableau 1) fraîchement complétés avec les inhibiteurs de protéase listés dans le tableau des matériaux. Mélangez bien après.
    4. Transférez l’échantillon dans un homogénéiseur de Dounce (Table of Materials).
      REMARQUE : En présence de gros morceaux de tissu, utilisez une pointe p1000 (après avoir coupé la pointe avec des ciseaux) pour mieux collecter l’échantillon.
    5. Homogénéisez le tissu en utilisant d’abord le pilon LOOSE puis le pilon SERRÉ (Table of Materials) jusqu’à ce que les morceaux de tissu deviennent invisibles à l’œil nu.
    6. Filtrez l’échantillon homogénéisé à travers un tamis cellulaire de 100 μm (Table of Materials) pour éliminer les débris tissulaires.
    7. Pipeter vigoureusement de haut en bas avec un p200 pour dissoudre la membrane plasmique et transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL.
    8. Pelletez les noyaux cellulaires par centrifugation à 2 300 x g pendant 15 minutes à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse de laboratoire (Tableau des matériaux).
    9. Écartez le surnageant et remettez les granulés nucléaires en suspension dans 50-100 μL de tampon d’isolation des noyaux, complétés par une FDS à 0,1 % pour dissoudre la membrane nucléaire (Table of Materials).
    10. Ajoutez 250 U de nucléase Benzonase pour digérer les acides nucléiques, mélangez bien, puis incubez pendant 2 minutes à 37°C (Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Si l’échantillon reste visqueux, la sonication peut également être réalisée dans un bain-marie (réglage : 10 min 30s ALLUMÉ/30s ÉTEINT ; puissance : élevée ; température : 4 °C). Après cette étape, les échantillons peuvent être stockés à -20 °C.
  2. Enrichissement des histones à partir d’échantillons OCT (durée estimée : 90 min)
    REMARQUE : Ce protocole a été optimisé pour quatre ou cinq sections OCT de 10 μm d’épaisseur correspondant à 20 à 60 mg de tissu. Cependant, le nombre de coupes de tissu dépend du type de biopsie clinique et de la surface totale du tissu. Compte tenu de la rareté des échantillons cliniques, une extraction à partir d’une quantité plus faible de tissu de départ peut être réalisée, même si cela peut entraîner une diminution de la détection des modifications des histones.
    1. Placez quatre ou cinq sections de tissu de 10 μm d’épaisseur, correspondant à environ 20 à 60 mg de tissu, dans un tube de 1,5 mL.
    2. Lavez les sections avec 1 mL d’EtOH à 70 % glacé (Tableau 1) pendant 2 minutes sur une roue rotative (Table of Materials) à 4 °C.
    3. Centrifugez à 16 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C dans une centrifugeuse de paillard.
    4. Répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 un total de 3 fois.
    5. Réhydratez les échantillons dans 1 mL d’eau double distillée (ddH2O) avec une rotation (Table of Materials) pendant 2 minutes à 4 °C.
    6. Centrifugez à 16 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C dans une centrifugeuse de laboratoire (Table of Materials).
    7. Répétez deux fois les étapes 1.2.5 et 1.2.6 avec 1x PBS (Table of Materials).
    8. Procédez à l’étape 1.1.2 du protocole d’enrichissement à partir d’échantillons frais congelés.
  3. Extraction de histones à partir d’échantillons FFPE (durée estimée : 8 h)
    REMARQUE : Le protocole décrit a été développé pour quatre sections FFPE de 10 μm d’épaisseur, correspondant à environ 20 à 60 mg de tissu. Pour la plupart des analyses MS de modifications des histones, cette quantité est excessive et constitue un point de départ sûr lorsque le matériau n’est pas limitant. Cependant, moins de matière de départ peut également être utilisée, ce qui est particulièrement pertinent compte tenu de la quantité souvent faible de tissu disponible lors de l’analyse des échantillons cliniques. L’utilisation de moins de matière de départ, bien que réalisable, réduit généralement la robustesse de la quantification pour les modifications histoniques à faible abondance (par exemple, H3K27ac, ou peptides H3K27/K36 multi-méthylés), et cet effet peut varier selon le type de tissu, ainsi que d’un échantillon à l’autre. Néanmoins, notre laboratoire a déjà démontré que le profilage PTM basé sur la SEP peut être réalisé avec succès à partir de zones de tissu microdisséquées au laser d’échantillons de FFPE (cancer du sein) correspondant à seulement 1 000 cellules18.
    1. Placez quatre sections FFPE de 10 μm d’épaisseur, correspondant à environ 20 à 60 mg de tissu, dans un tube de 1,5 mL.
    2. Ajoutez 1 mL d’agent dissoudant la paraffine à l’échantillon et au vortex (Table of Materials) à vitesse maximale pendant 30 s, jusqu’à ce que la paraffine soit complètement dissoute.
      ATTENTION : Les réactifs dissolvants par paraffine sont mutagèniques, cancérigènes et inflammables, ils doivent donc être utilisés sous une cagoule chimique.
      REMARQUE : La dissolution de la paraffine est obtenue lorsque les morceaux de paraffine ne sont plus visibles à l’œil nu, et que l’agent dissoudant la paraffine a une couleur blanchâtre et homogène.
    3. Centrifugez 16 000 x g pendant 3 minutes à la réchauffe dans une centrifugeuse de laboratoire et jetez le surnageant. Pour éviter l’aspiration d’échantillon indésirable lors du retrait du surnageant, la pompe à vide/pipettes peut être capuchée avec une pointe plus petite (par exemple, pointes p200, p10).
    4. Répétez les étapes 1.3.2 et 1.3.3 trois fois supplémentaires (4 fois au total) pour garantir un retrait complet de la paraffine. Sinon, il faut peser l’échantillon complètement déparaffiné pour obtenir une lecture indicative de la quantité de tissu traitée.
    5. Ajoutez 1 mL de solution d’EtOH à 95 % (Tableau 1) et un vortex à vitesse maximale pendant 30 s, pour assurer une resuspension complète des tissus.
    6. Centrifugez 16 000 x g pendant 3 minutes à la réchauffe dans une centrifugeuse de laboratoire et jetez le surnageant. Sinon, pesez l’échantillon déshydraté pour obtenir une mesure indicative de la quantité de tissu sec traité.
    7. Répétez les étapes 1.3.5 et 1.3.6 avec 70 %, 50 % et 20 % d’EtOH (Tableau 1) et ddH2O pour réhydrater l’échantillon.
    8. Ajoutez 200 μL de tampon d’extraction (Tableau 1).
      REMARQUE : Si de gros morceaux de tissu sont présents, coupez-les en petits morceaux avec des ciseaux. Selon la quantité de tissu, des volumes plus petits ou plus importants de tampon d’extraction peuvent être ajoutés pour assurer une lyse correcte de l’échantillon. Pour les granules particulièrement petites resuspendues dans un volume de tampon d’extraction inférieur à 100 μL, la sonication peut être réalisée à l’aide d’un dispositif de sonication (Table of Materials) (puissance de 30 s ALLUMÉE/30 secondes ÉTEINTE : élevée, 10 cycles).
    9. Homogénéisez les tissus dans le tampon d’extraction par sonication à l’aide d’un sonificateur numérique (Table of Materials) avec une micropointe de 3 mm (>15 cycles, 5s ALLUMÉ/2 min ÉTEINT, puissance : 15-30 %).
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être considérés comme correctement homogénéisés lorsqu’aucune particule tissulaire visible n’est visible dans la solution et que le tampon d’extraction présente une couleur uniforme, non trouble. Gardez les échantillons à RT pendant les cycles de sonication. La glace peut provoquer la précipitation de SDS dans le tampon d’extraction, ce qui nuit à l’homogénéisation tissulaire. Une sonication correcte est cruciale pour obtenir une lyse tissulaire complète et une extraction des protéines. Placez la micro-pointe à la bonne hauteur dans le tube d’échantillonnage (elle ne doit pas toucher le fond du tube, libérant des particules plastiques, et elle ne doit pas être à l’interface tampon d’extraction d’air, créant de la mousse et des bulles).
    10. Après homogénéisation, incubez les échantillons à 95 °C pendant 45 minutes dans un thermomélangeur. Toutes les 15 minutes, ouvrez le couvercle des tubes pour laisser s’évaporer le formaldéhyde.
    11. Incubez des échantillons à 65 °C pendant 4 heures dans un thermomélangeur. Ouvrez le couvercle toutes les 20 à 60 minutes pour laisser le formaldéhyde s’évaporer.
    12. Centrifugez 16 000 x g pendant 1 minute à la réflexion sur une centrifugeuse de paillas, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C à ce stade.

Tableau 1 : Composition des tampons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

2. Résolution des histones via SDS-PAGE et digestion en gel

  1. SDS-PAGE (Figure 1B ; durée estimée : 2 h)
    1. Pour évaluer la pureté des histones et estimer leur quantité, on charge 1/10 des extraits d’histone sur un gel de polyacrylamide à 17 % (SDS-PAGE ; Tableau 1) aux côtés de quantités connues d’histones recombinantes, comme illustré à la Figure 1B.
      REMARQUE : Au lieu de charger 1/10 d’extraits d’histones, on peut charger 15 à 50 μg de protéines, mesurées par des tests tolérant de fortes concentrations de détergents, comme le testprotéique 19 de l’acide bicinchoninique (BCA). Cependant, veuillez noter que l’enrichissement des histones sur les protéines totales peut varier considérablement entre les échantillons frais congelés, congelés en OCT et FFPE, et la quantification de la quantité d’histones ne peut être basée que sur la SDS-PAGE. 1, 0,5 et 0,25 μg d’histone recombinante H3.1 (Table of Materials) peuvent être chargés comme référence pour quantifier la quantité d’histone plus précisément.
    2. Mélangez les échantillons avec un tampon de chargement de lithium dodécyl sulfate (LDS), ou avec des tampons de chargement équivalents pour SDS-PAGE (par exemple, tampon de Laemmli) avec l’ajout de dithiothréitol (DTT ; Tableau des matériaux) à une concentration finale de 10 mM.
    3. Dénature les échantillons à 95°C pendant 5 minutes dans un thermomixeur.
    4. Après séparation des protéines sur la SDS-PAGE, colorez le gel avec une coloration Coomassie (Table of Materials).
    5. Estimer le rendement des histones par quantification visuelle ou assistée parlogiciel des bandes d’histones dans des échantillons cliniques comparées à l’histone recombinante H3 chargée en quantités connues.
  2. Digestion histone-in-gel (Figure 2; durée estimée : 2 jours)
    REMARQUE : La digestion de type ArgC est employée pour l’analyse en plaque des PTM d’histones car la digestion standard de trypsine génère des peptides excessivement courts, en raison de la fréquence élevée des acides aminés lysine et arginine dans leur séquence, ce qui entrave la détection des peptides par LC-MS et l’identification des PTM. En modifiant chimiquement les lysines, le clivage tryptique à ces sites est évité, ce qui entraîne un clivage au niveau du C-terminal uniquement des arginines, produisant des peptides plus longs (4 à 15 acides aminés) contenant des lysines modifiées dans la séquence ; dans l’ensemble, ce protocole facilite la détection et la mesure de la SEP des peptides histoniques modifiés et a été décrit en détail dans de nombreuses publications8,17,21.
    OPTIONNEL : Un standard interne (par exemple, peptides à spik-in fortement marqués, marqués synthétiquement22) peut être mélangé avec des échantillons d’histones dans un ratio 1:1 pour obtenir une quantification peptidique plus précise en MS (Figure 2B).
    1. Chargez 3 à 5 μg d’échantillon d’histones sur un gel de polyacrylamide à 17 %, en se basant sur la quantification estimée des histones réalisée à l’étape 2.1.5 (Figure 2B).
    2. Après SDS-PAGE, visualisez les protéines en colorant le gel avec la coloration de Coomassie.
      REMARQUE : Pour éviter toute contamination pouvant interférer avec l’analyse LC-MS/MS, il est conseillé d’effectuer les étapes suivantes dans un environnement sans kératine, comme une hotte dédiée, car la kératine est un contaminant fortement MS.
    3. Bandes de gel d’accise correspondant au poids moléculaire des protéines histones centrales (bande de gel entre 10 et 18 kDa, en considérant le poids moléculaire suivant pour chaque histone centrale : H3 environ 17 kDa, H2A-H2B environ 14 kDa, H4 environ 11 kDa) à l’aide d’un scalpel (Table of Materials) et des bandes découpées en morceaux d’environ 1mm 3 chacun.
    4. À l’aide du scalpel, transférez les morceaux de gel dans un tube de 1,5 mL.
      REMARQUE : Pour recouvrir complètement les morceaux de gel, les volumes indiqués ci-dessous peuvent être augmentés, en maintenant la stœchiométrie du réactif.
    5. Retirez les morceaux de gel en ajoutant une solution d’acétonitrile à 50 % (ACN) dans ddH2O (Tableau 1). Placez dans un thermomixeur réglé à 1 400 tr/min pendant 10 minutes RT et jetez ensuite le surnageant.
    6. Répétez l’étape 2.2.5 jusqu’à ce que les morceaux de gel soient complètement détachés.
    7. Déshydratez les morceaux de gel en ajoutant 100 % d’ACN (Table of Materials). Incubez en mélangeant à 1 400 tr/min pendant 10 minutes de repos et jetez le surnageant ensuite.
    8. Répétez l’étape 2.2.7 jusqu’à ce que les morceaux de gel paraissent blancs et durs, donc complètement déshydratés.
    9. Séchez les morceaux de gel pendant 5 minutes à la répression dans une centrifugeuse sous vide (Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les histones sont pauvres en cystéines (seules deux cystéines se trouvent dans l’histone H3 aux positions 96 et 110 (UniprotKB ID P68431), et une seule cystéine est trouvée dans l’histone H2B à la position 154 (UniprotKB ID B4DR52)). De plus, ces cystéines sont présentes dans des peptides non détectables lors d’une digestion de type ArgC dans la SEP ascendante, de sorte que les adducts chimiques des groupesthiol 23 ne sont pas un artefact dans l’analyse des histones par la MS, et aucune étape de réduction ou d’alkylation de la cystéine n’est réalisée dans le protocole décrit.
    10. Ajoutez 15 μL de 7,7 M de solution d’anhydride propionique (PRO) (Table of Materials) et 26 μL de 1 M d’ammonium bicarbonate (AmBic) (Table of Materials) à chaque tube et incubez les échantillons dans un thermomixeur réglé à 350 tr/min pendant 10 minutes à 37 °C.
      REMARQUE : Puisque les anhydrides dissous dans un tampon réactif ont tendance à s’évaporer, ne préparez pas un mélange maître de PRO et AmBic, mais ajoutez-les individuellement à chaque échantillon afin de maintenir constante la concentration adéquate de PRO dans chaque tube.
    11. Couvrez complètement les morceaux de gel en ajoutant 1 M AmBic (volume recommandé : 80 μL) et incubez les échantillons en mélangeant à 1 400 tr/min pendant 4 heures à 37°C dans un thermomélangeur. Enlevez tout le liquide ensuite.
      REMARQUE : 1 M d’AmBic est ajouté pour maintenir un pH de base, idéal pour catalyser la propionylation des lysines non modifiées et monométhylées par PRO.
    12. Lavez trois fois avec du ddH2O, en incubant les échantillons entre les deux à RT pendant 10 minutes tout en mélangeant dans un thermomixeur à 1 400 tr/min. Jetez le liquide après chaque lavage.
    13. Ajoutez 50 % d’ACN et incubez dans un thermomixeur à 1 400 tr/min pendant 15 minutes à la RT. Jetez ensuite le liquide.
    14. Déshydratez complètement les morceaux de gel en ajoutant 100 % d’ACN et incubez à 1 400 tr/min pendant 15 minutes en RT dans un thermomixeur. Jetez le liquide ensuite.
    15. Répétez l’étape 2.2.14 jusqu’à ce que les morceaux de gel paraissent blancs et secs.
    16. Des morceaux de gel sec 5 minutes à la réception dans une centrifugeuse sous vide.
    17. Ajoutez à chaque échantillon 4 μL de solution de trypsine (Tableau 1) et 20 μL de tampon de digestion (Tableau 1) et incubez 10 minutes sur de la glace pour permettre l’absorption de la trypsine dans les morceaux de gel.
      REMARQUE : Cette incubation – réalisée avec une solution concentrée de trypsine et un tampon de digestion (50 mM AmBic dans ddH2O, créant un pH de base idéal pour la clivage trypsynique) – permet à l’enzyme d’être absorbée par les morceaux de gel avant son activation à 37 °C.
    18. Lorsque la trypsine concentrée est complètement absorbée, couvrez soigneusement les morceaux de gel avec un tampon de digestion supplémentaire (volume indicatif : 80 μL) et incubez à 37 °C toute la nuit dans un thermomixeur.
    19. Pour extraire les peptides digérés des morceaux de gel, ajoutez 100 μL de 100 % d’ACN et incubez à 1 400 tr/min pendant 20 minutes au RT dans un thermomixeur.
    20. Récupérez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 mL.
    21. Ajoutez 80 μL de 100 % d’ACN sur des morceaux de gel et incubez à 1 400 tr/min pendant 10 minutes de RT dans un thermomixeur.
    22. Collectez du surnageant et regroupez-le avec celui recueilli à l’étape 2.2.20, puis concentrez les peptides dans une centrifugeuse sous vide à un volume compris entre 1 et 5 μL.
      REMARQUE : L’utilisation d’une centrifugeuse à vide permet l’évaporation du solvant organique (ACN). Cependant, il est recommandé de ne pas sécher complètement l’échantillon à ce stade, car cela pourrait avoir un impact négatif sur l’étape suivante de dérivation. Si l’échantillon sèche, resuspendez-le dans de l’eau ddH2Oet soniez-le dans un bain-marie pendant 5 minutes.
    23. AjouterddH 2O à chaque échantillon, pour un volume final de 15 μL, puis ajouter 2 μL de 1 M de bicarbonate de triéthylammonium (Table of Materials) et 3 μL de solution d’isocyanate de phényle (PIC) (Tableau 1) et incuber à 350 tr/min pendant 90 minutes à 37 °C dans un thermomélangeur.
      ATTENTION : La PIC est mutagène et cancérigène, il est donc recommandé de la manipuler sous un capot chimique. Comme le PIC est très réactif et volatil, il est recommandé d’éviter de préparer un mélange maître de bicarbonate de triéthylammonium et de PIC, mais il est conseillé d’ajouter chaque réactif individuellement pour garantir la présence exacte de la concentration de PIC.
    24. Ajoutez à chaque tube 8 μL d’acide trifluoroacétique à 1 % (TFA ; Tableau des matériaux) pour arrêter la dérivéisation avec PIC.
    25. Diluez chaque échantillon avec 100 μL de tampon A (Tableau 1) et chargez-les sur les embouts de l’étage C18 (préparés comme décrit dansle 24 ou achetés auprès de différents fournisseurs).
    26. Faites tourner les échantillons à 2 100 x g pendant 10 minutes à 4 °C dans une centrifugeuse à rotor oscillant afin de permettre aux peptides d’histones de se lier à la résine C18.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés sur les pointes de la scène à 4 °C pendant plusieurs mois.
    27. Ajoutez 30 μL de tampon d’élution (Tableau 1) aux pointes de l’étape C18 et placez les pointes dans un nouveau tube de 1,5 mL. Prélève des échantillons de centrifugation à 1 000 x g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse de paillasse à 4 °C pour éluer des peptides d’histones.
    28. Concentrez les échantillons à un volume compris entre 1 et 3 μL à l’aide d’une centrifugeuse à vide, puis ajoutez 1 % de TFA pour atteindre un volume final de 6 μL.
    29. Chargez 5 μL de solution peptidique dans une microplaque à 96 puits pour l’analyse de la SEP (Table of Materials) et scellez-la avec un tapis de scellement (Table of Materials).

3. HPLC-MS/MS et analyse des données (Figure 3)

REMARQUE : Les paramètres décrits par la présente conviennent à un système de chromatographie liquide ESAY-nLC 1200 connecté via une colonne de pulvérisation EASY à un spectromètre de masse Q Exactive Plus Orbitrap (Table of Materials), mais des instruments similaires ou équivalents peuvent également être utilisés, avec des paramètres ad hoc.

  1. HPLC-MS/MS (durée estimée : 90 min par échantillon)
    1. Injecter 3 μL des peptides d’histones de 5 μL de l’étape 2.2.29 (correspondant à environ 0,25-0,8 μg, basé sur la quantification des histones par SDS-PAGE) sur une nanocolonne C18 (Table of Materials) à un débit constant de 500 nl/min dans le tampon A.
    2. Appliquez un gradient linéaire de 55 minutes de 10 % à 45 % de tampon B à un débit de 250 nL/min pour séparer les peptides.
    3. Acquérir les données MS/MS en mode dépendant des données (DDA) pour basculer automatiquement entre MS1 et MS2 à l’aide des logiciels dédiés (Table of Materials).
      REMARQUE : Pour l’acquisition et les paramètres généraux, voir le Tableau 2.
  2. Analyse des données RAW MS
    REMARQUE : Dans ce protocole, la quantification des PTM des histones est réalisée à l’aide d’EpiProfile, un script ouvert (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family), convivial et adapté aux analyses standard telles que celles décrites pour les méthylations et acétylations de lysine H3 et H4. Cependant, EpiProfile peut être personnalisé pour réaliser des analyses de modifications moins standard et selon différents protocoles de préparation d’échantillons par des utilisateurs plus expérimentés. Veuillez noter qu’EpiProfile exige une licence MATLAB pour fonctionnerà 25 km.
    1. Analysez les données RAW acquises avec le logiciel EpiProfile 2.0 (version PRO-PIC)25 (Table of Materials) et quantifiez les peptides d’histones en sélectionnant les options histone_normal, lorsque l’analyse est effectuée sans marqueur, et histone_SILAC, lors de l’utilisation du spike-in SUPER-SILAC. Définir ndebug = 0.
    2. Pour chaque peptide d’histone (par exemple, H3_3-8), calculez l’abondance relative ( %RA) de chaque peptidoforme modifié (par exemple, H3_3-8 unmod, me1, me2, me3) en divisant son chromatogramme ionique extrait (XIC) calculé par EpiProfile par la somme de tous les XIC calculés pour ce peptide.
      REMARQUE : En option, les XIC calculés par EpiProfile peuvent être validés par l’inspection des spectres MS et la quantification manuelle des peptides d’histones à l’aide d’une disposition dédiée des spectres, comme décrit dans18,26.
    3. Pour chaque peptidoforme, calculez le rapport léger/lourd (L/H) en divisant le %RA de chaque peptide natif léger par le %RA du peptide lourd correspondant dérivé du mélange SUPER-SILAC, injecté dans chaque échantillon.
    4. Transformez les rapports L/H en une échelle logarithmique. Pour mettre en évidence des différences significatives d’abondance peptidoforme entre les échantillons, une analyse statistique peut être réalisée, et les rapports L/H de tous les échantillons peuvent être représentés visuellement sous forme de cartes thermiques et de diagrammes de dispersion, comme dans la Figure 4.

Tableau 2 : Liste des paramètres d’acquisition et du réglage général utilisé pour LC-MS/MS avec le système utilisé dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons réalisé l’extraction d’histones à partir d’échantillons frais congelés et OCT congelés de cancer du sein, ainsi que d’échantillons de méningiome FFPE selon le protocole mentionné ci-dessus. Comme illustré à la Figure 1A, pour les spécimens congelés, nous avons retiré l’OCT lorsqu’il était présent, et nous avons homogénéisé les échantillons dans un tampon d’isolation des noyaux contenant un détergent doux (0,1 % de Triton étape 1.1), permettant l’i...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode décrite ici offre un flux de travail simple et robuste pour isoler efficacement les histones à partir d’échantillons cliniques stockés sous forme de biopsies fraîchement congelées, congelées en OCT et FFPE pour le profilage de leurs paysages de modification par analyse en SEP. Le protocole de préparation de l’échantillon ultérieur via séparation SDS-PAGE et digestion en gel PRO-PIC avec trypsine assure une élimination efficace des détergents, sels et autres contaminants de la<...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions les chirurgiens et cliniciens de l’Institut européen d’oncologie et de l’Institut Neurologique Carlo Besta pour avoir fourni des biopsies tissulaires FF, OCT congelées et FFPE. Nous remercions Roberta Noberini pour la discussion scientifique et méthodologique lors de la préparation du manuscrit et pour nos financements : PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (grant numéro IG-2023-28767) et Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chimiques
Histolemon RS pour l’histologieCarlo Erba4549122,5 L
Acétonitrule (ACN)Carlo Erba4123411L
Bicarbonate d’ammonium (AmBasic)Sigma AldrichA6141500 g
Persulfate d’ammonium (APS)WDR1.012.010.500500 g
Inhibiteur de la protéase à l’aprotinineSigma Aldrich & nbsp ;A11535 mg
Nucléase benzonaseMerkE101425 KU
Bisacrylamide 30 % 37,5 MAppliChemAPA362610001 L
Tampon A 0,1 % d’acide formique dans ddH2OThermo Fisher Scientific10229884500 mL  ;
Tampon B 0,1 % acide formique / 80 % acétonitrile dans ddH2OThermo Fisher Scientific15431423500 mL
Résine C18Merck66883-UDiamètre de 47 mm
Coomassie Instant BlueAbcamab1192111 L
Dithiotréitol (DTT)  ;WDR441496P25 g
ÉthanolCarlo Erba4146082,5 L
Leupeptine  ; Inhibiteur de la protéaseSigma-Aldrich & nbsp ;L85115 mg
N,N,N&prime ;,N&prime ;-tétraméthylène éthylènediamine (TEMED)Sigma Aldrich1.107.320100100 mL
Tampon d’échantillon LDS NuPAGEInvitrogenNP00074x
PBS - Solution séline tamponnée phosphate & nbsp ;MicroGemTL1006500 mL
Isocyanate de phénile (PIC)Sigma Aldrich185353100 g
Inhibiteur de la protéase du phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF)Sigma Aldrich & nbsp ;P76261 g
Anhydride propionique (PRO)Sigma Aldrich24031150 g
Histone recombinant H3.1 HumainNew England BiolabsM25031 & micro ; g/& micro ; L
Trypsine de qualité séquençagePromegaV5113100 ug
Inhibiteur de la butyrate de sodium (NaBut) des histones déacétlyaseMerckB58875 g
Dodécylsulfate de sodium (SDS)Sigma AldrichL3771100 g
Bicarbonate de triéthylammoniumSigma AldrichT7408100 mL
Acide trifluoroacétique (TFA)Thermo Fisher Scientific289041x10 mL
Tris-HClSigma AldrichT3253100 g
Détergent Triton X-100Sigma-Aldrich & nbsp ;X100RS5 g
Kits / Équipement/Logiciel
Microplaques à 96 puitsCorningPCR-96-FS-CNon pyrogénique, sans Rnase/Dnase
BalanceKern19024
Centrifugeuse de laboratoireLaboratoire de Biofuge HareusPico, 23396
Dispositif de sonnation à biorupteurDiagénode
Sonifier numérique Branson 250Emerson
Filtre cellulaire 100 & micro ; mFaucon352360
Concentrateur plusEppendorf5305000509
Homogénéiseur de Dounce (par exemple & nbsp ; Dounce, Wheaton...)Dounce, WheatonBroyeur de tissu de 1 mL
EASY-nLC 1200 Chromatographie liquideThermo Fisher Scientific
Colonne HPLC C18 EASY-SprayThermo Fisher ScientificES9022 & micro ; m, 100  ; Å ;, 75 µ ; m x 25 cm
Script EpiProfile2.0https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Logiciels fidjienshttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
Moteur de recherche MaxQuanthttps://maxquant.net/maxquant/
Pestel A (en vrille)Dounce, Wheaton
Pestel B (serré)Dounce, Wheaton
Q Exactive Plus Système LC-MS/MS OrbitrapThermo Fisher Scientific
Roue rotativeThermo Fisher Scientific11496548
ScalpelKiato13010
CiseauxThermo Fisher Scientific15207266
Tapis d’étanchéitéCorningAM-96-PCR-RDCompatible avec l’automatisation
Centrifugeuse à rotor basculantBeckman coulterAllegra X-15R
Thermomélangeur compactEppendorf5350
TourbillonPBIVibromix
Logiciel XcaliburThermo Fisher ScientificOPTON-30965

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: From laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 28(2024).
  4. Fraga, M. F., et al. Loss of acetylation at lys16 and trimethylation at lys20 of histone h4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet. 37 (4), 391-400 (2005).
  5. Noberini, R., et al. Profiling of epigenetic features in clinical samples reveals novel widespread changes in cancer. Cancers (Basel). 11 (5), 723(2019).
  6. Khan, S. A., Reddy, D., Gupta, S. Global histone post-translational modifications and cancer: Biomarkers for diagnosis, prognosis and treatment. World J Biol Chem. 6 (4), 333-345 (2015).
  7. Liu, R., et al. Post-translational modifications of histones: Mechanisms, biological functions, and therapeutic targets. MedComm (2020). 4 (3), e292(2023).
  8. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: Applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  9. Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: Emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
  10. Voskuil, J. L. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 6, 161(2017).
  11. Rothbart, S. B., et al. An interactive database for the assessment of histone antibody specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  12. Gastman, B., et al. Defining best practices for tissue procurement in immuno-oncology clinical trials: Consensus statement from the society for immunotherapy of cancer surgery committee. J Immunother Cancer. 8 (2), e001583(2020).
  13. Steu, S., et al. A procedure for tissue freezing and processing applicable to both intra-operative frozen section diagnosis and tissue banking in surgical pathology. Virchows Arch. 452 (3), 305-312 (2008).
  14. Snijders, M. L. H., et al. Cryo-gel embedding compound for renal biopsy biobanking. Scientific Reports. 9, 15250(2019).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods Mol Biol. 1897, 253-268 (2019).
  16. Dupree, E. J., et al. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  17. Restellini, C., et al. Alternative digestion approaches improve histone modification mapping by mass spectrometry in clinical samples. Proteomics Clin Appl. 13 (1), e1700166(2019).
  18. Noberini, R., et al. Spatial epi-proteomics enabled by histone post-translational modification analysis from low-abundance clinical samples. Clin Epigenetics. 13 (1), 145(2021).
  19. Olson, B. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A 3A 1-A 3A 32 (2016).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Daled, S., et al. Histone sample preparation for bottom-up mass spectrometry: A roadmap to informed decisions. Proteomes. 9 (2), 17(2021).
  22. Kim, H. J., Ha, S., Lee, H. Y., Lee, K. J. Rosics: Chemistry and proteomics of cysteine modifications in redox biology. Mass Spectrom Rev. 34 (2), 184-208 (2015).
  23. Lindemann, C., et al. Strategies in relative and absolute quantitative mass spectrometry based proteomics. Biol Chem. 398 (5-6), 687-699 (2017).
  24. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  25. Yuan, Z. F., et al. Epiprofile 2.0: A computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  26. Noberini, R., Bonaldi, T. A super-silac strategy for the accurate and multiplexed profiling of histone posttranslational modifications. Meth Enzymol. 586, 311-332 (2017).
  27. Valikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A systematic evaluation of normalization methods in quantitative label-free proteomics. Brief Bioinform. 19 (1), 1-11 (2018).
  28. Noberini, R., Longhi, E., Bonaldi, T. A super-silac approach for profiling histone posttranslational modifications. Methods Mol Biol. 2603, 87-102 (2023).
  29. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (4), 933-938 (2007).
  30. Manea, M., Mezo, G., Hudecz, F., Przybylski, M. Mass spectrometric identification of the trypsin cleavage pathway in lysyl-proline containing oligotuftsin peptides. J Pept Sci. 13 (4), 227-236 (2007).
  31. Davies, V., et al. Rapid development of improved data-dependent acquisition strategies. Anal Chem. 93 (14), 5676-5683 (2021).
  32. Herwig-Carl, M. C., et al. Mass spectrometry-based profiling of histone post-translational modifications in uveal melanoma tissues, human melanocytes, and uveal melanoma cell lines - a pilot study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (2), 27(2024).
  33. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  34. Vai, A., et al. Improved mass spectrometry-based methods reveal abundant propionylation and tissue-specific histone propionylation profiles. Mol Cell Proteomics. 23 (7), 100799(2024).
  35. Chen, J., et al. In-gel nhs-propionate derivatization for histone post-translational modifications analysis in arabidopsis thaliana. Anal Chim Acta. 886, 107-113 (2015).
  36. Nshanian, M., et al. Short-chain fatty acid metabolites propionate and butyrate are unique epigenetic regulatory elements linking diet, metabolism and gene expression. Nat Metab. 7 (1), 196-211 (2025).
  37. Joseph, F. M., Young, N. L. Histone variant-specific post-translational modifications. Semin Cell Dev Biol. 135, 73-84 (2023).
  38. Amatori, S., Tavolaro, S., Gambardella, S., Fanelli, M. The dark side of histones: Genomic organization and role of oncohistones in cancer. Clin Epigenetics. 13 (1), 71(2021).
  39. Mohammad, F., Helin, K. Oncohistones: Drivers of pediatric cancers. Genes Dev. 31 (23-24), 2313-2324 (2017).
  40. Louis, D. N., et al. The 2021 who classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  41. Deshmukh, S., Ptack, A., Krug, B., Jabado, N. Oncohistones: A roadmap to stalled development. FEBS J. 289 (5), 1315-1328 (2022).
  42. Lopes, M., Lund, P. J., Garcia, B. A. Optimized and robust workflow for quantifying the canonical histone ubiquitination marks h2ak119ub and h2bk120ub by lc-ms/ms. J Proteome Res. 23 (12), 5405-5420 (2024).
  43. Turriziani, B., et al. On-beads digestion in conjunction with data-dependent mass spectrometry: A shortcut to quantitative and dynamic interaction proteomics. Biology (Basel). 3 (2), 320-332 (2014).
  44. Hamza, G. M., et al. Affi-bams: A robust targeted proteomics microarray platform to measure histone post-translational modifications. Int J Mol Sci. 24 (12), 10060(2023).
  45. Nel, A. J., Garnett, S., Blackburn, J. M., Soares, N. C. Comparative reevaluation of fasp and enhanced fasp methods by lc-ms/ms. J Proteome Res. 14 (3), 1637-1642 (2015).
  46. Ledvinova, D., et al. Filter-aided sample preparation procedure for mass spectrometric analysis of plant histones. Front Plant Sci. 9, 1373(2018).
  47. Picard, G., et al. Psaq standards for accurate ms-based quantification of proteins: From the concept to biomedical applications. J Mass Spectrom. 47 (10), 1353-1363 (2012).
  48. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The maxquant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  49. Zhang, C., Liu, Y. Retrieving quantitative information of histone ptms by mass spectrometry. Methods Enzymol. 586, 165-191 (2017).
  50. Thomas, S. P., Haws, S. A., Borth, L. E., Denu, J. M. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: Best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  51. Bauden, M., Kristl, T., Andersson, R., Marko-Varga, G., Ansari, D. Characterization of histone-related chemical modifications in formalin-fixed paraffin-embedded and fresh-frozen human pancreatic cancer xenografts using lc-ms/ms. Lab Invest. 97 (3), 279-288 (2017).
  52. Noberini, R., Uggetti, A., Pruneri, G., Minucci, S., Bonaldi, T. Pathology tissue-quantitative mass spectrometry analysis to profile histone post-translational modification patterns in patient samples. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 866-877 (2016).
  53. Sugii, N., Matsuda, M., Tsurubuchi, T., Ishikawa, E. Hemorrhagic complications after brain tumor biopsy: Risk-reduction strategies based on safer biopsy targets and techniques. World Neurosurg. 176, e254-e264 (2023).
  54. Govaert, E., et al. Extracting histones for the specific purpose of label-free ms. Proteomics. 16 (23), 2937-2944 (2016).
  55. An, Y. A., Scherer, P. E. Mouse adipose tissue protein extraction. Bio Protoc. 10 (11), e3631(2020).
  56. Vantaggiato, L., et al. Protein extraction methods suitable for muscle tissue proteomic analysis. Proteomes. 12 (4), 27(2024).
  57. Noberini, R., et al. Extensive and systematic rewiring of histone post-translational modifications in cancer model systems. Nucl Acids Res. 46 (8), 3817-3832 (2018).
  58. Chatzikyriakou, P., et al. A comprehensive characterisation of phaeochromocytoma and paraganglioma tumours through histone protein profiling, DNA methylation and transcriptomic analysis genome wide. Clin Epigenetics. 15 (1), 196(2023).
  59. Noberini, R., et al. Pat-h-ms coupled with laser microdissection to study histone post-translational modifications in selected cell populations from pathology samples. Clin Epigenetics. 9, 69(2017).
  60. Henikoff, S., et al. RNA polymerase II at histone genes predicts outcome in human cancer. Science. 387 (6735), 737-743 (2025).

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Extraction d histonesmodifications des histonesmodifications post traductionnellesorganisation de la chromatined couverte de biomarqueurschromatographie en phase liquidetissus FFPE

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