Utilisation des outils d’optogénétique LEXY et LINuS et de l’analyse automatisée d’images pour quantifier la dynamique du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes

Résumé

Ce protocole décrit comment mettre en place et effectuer efficacement des analyses automatisées de données d’imagerie de cellules vivantes obtenues à partir du suivi du transport nucléocytoplasmique via des outils optogénétiques.

Résumé

Le transport nucléocytoplasmique (TCN) est essentiel au maintien de l’homéostasie cellulaire, et sa perturbation est impliquée dans diverses maladies, notamment les troubles neurodégénératifs et la sclérose latérale amyotrophique. Cela souligne la nécessité de développer des outils pour surveiller et quantifier les NCT. Parmi ces outils, les sondes optogénétiques rapides et réversibles, LEXY (light-inducible nuclear export system) et LINuS (light-inducible nuclear localization signal), permettent de mesurer la dynamique des NCT dans les cellules vivantes.

Les publications originales décrivent la segmentation et la quantification manuelles du signal de la sonde fluorescente dans le noyau et le cytosol lors de la transfection des constructions LEXY et LINuS en imagerie de cellules vivantes. Cependant, la transfection et la segmentation manuelle limitent le nombre de cellules pouvant être analysées et sont sujettes à des imprécisions en raison d’erreurs potentielles dépendantes de l’utilisateur. Alors que la vitesse élevée et la réversibilité fournies par l’optogénétique devraient, en principe, permettre une sensibilité élevée dans la détection des changements de dynamique NCT, cela dépend des paramètres d’acquisition et de l’analyse d’un nombre suffisant de cellules.

Nous avons donc établi des vecteurs lentiviraux exprimant LEXY et LINuS pour créer des lignées cellulaires stables, testé des marqueurs d’imagerie en direct et des conditions de contrôle, et mis en œuvre un pipeline d’analyse d’images semi-automatisé qui permet d’analyser des centaines de cellules. Cette méthode d’analyse utilise le logiciel en libre accès FIJI, est accessible aux débutants en bioinformatique, et ne nécessite pas de configurations informatiques avancées. Nous fournissons ici un protocole étape par étape pour mettre en place LEXY comme exemple de ces outils optogénétiques pour surveiller l’exportation nucléaire, de la préparation des échantillons à l’acquisition d’imagerie de cellules vivantes et à l’analyse automatisée, tout en démontrant comment adapter le protocole à d’autres conditions, contrôles ou modèles dans n’importe quel laboratoire. Tous les plasmides et lignées cellulaires utilisés dans ce protocole seront mis à la disposition de la communauté scientifique, ce qui augmentera encore l’accessibilité de la méthode.

Introduction

L’importance du transport nucléocytoplasmique (TCN) pour réguler les voies cellulaires clés et maintenir l’homéostasie cellulaire a été bien étudiée au cours des dernières années¹. En conséquence, plusieurs outils ont été générés pour étudier la dynamique^du NCT ^2,3,4. Parmi ces outils, les sondes optogénétiques LINuS⁵ et LEXY⁶, publiées respectivement en 2014 et 2016, offrent un moyen puissant de surveiller les NCT dans les cellules vivantes. Ces outils, conçus pour suivre soit l’exportation inductible (LEXY), soit l’importation (LINuS) d’un rapporteur fluorescent, sont inductibles par exposition à la lumière bleue et réversibles.

En bref, ces deux petites sondes utilisent les propriétés du domaine LOV2 de la protéine phototropine-1 de la plante Avena sativa⁷. En l’absence de lumière bleue, l’hélice Jα du domaine LOV2 est photocaged et intégrée dans le noyau de la protéine. Comme l’hélice Jα peut répondre à un stimulus lumineux, l’éclairage par la lumière bleue induit un changement de conformation et le désamarrage ultérieur de l’hélice Jα du domaine LOV2. Les auteurs de LEXY et LINuS ont utilisé cette sensibilité à la lumière pour fusionner soit un signal de localisation nucléaire (NLS), soit un signal d’exportation nucléaire (NES) avec l’hélice Jα, pour LINuS et LEXY, respectivement (Figure 1). L’outil qui en résulte est une sonde qui se déplace dans le noyau (LINuS) ou le cytosol (LEXY) lors de l’éclairage par lumière bleue.

Pour suivre les sondes avec l’imagerie fluorescente, un rapporteur fluorescent mCherry a également été ajouté aux constructions. Enfin, un NES faible (pour LINuS) ou NLS (pour LEXY) a été ajouté au système pour s’assurer que les sondes n’étaient pas dans leur localisation finale avant l’éclairage par lumière bleue, ce qui empêcherait l’observation de la translocation LEXY ou LINuS entre le noyau et le cytosol.

Figure 1 : Représentation des sondes LEXY et LINuS. Les deux sondes sont constituées d’une protéine mCherry fusionnée au domaine LOV2 sensible à la lumière. La différence entre les deux outils réside dans la séquence de signalisation cachée par l’hélice Jα : une NES pour LEXY et une NLS pour LINuS. Les deux sondes possèdent également une séquence de signaux faibles pour contrôler leur localisation initiale : un NLS faible pour LEXY et un NES faible pour LINuS. L’activation des systèmes par éclairage à lumière bleue induit donc soit leur exportation pour LEXY, soit leur importation pour LINuS, permettant aux utilisateurs de suivre l’exportation ou l’importation nucléaire. Abréviations : LEXY = système d’exportation nucléaire inductible par la lumière ; LINuS = signal de localisation nucléaire inductible par la lumière ; NLS = signal de localisation nucléaire ; NES = signal d’exportation nucléaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La localisation de la fluorescence mCherry signale la navette des sondes LEXY et LINuS entre les noyaux et le cytosol, et peut donc être suivie dans l’imagerie de cellules vivantes, ce qui permet aux utilisateurs de surveiller le NCT. En plus d’être utilisés comme de simples sondes, LEXY et LINuS peuvent également être modifiés pour contrôler la localisation et étudier les protéines d’intérêt, in vitro 5,6,8,9 ou in vivo^10,11.

La méthode de quantification proposée dans les publications LEXY et LINuS permet de montrer l’intensité nucléaire relative des sondes. L’analyse suggérée est effectuée manuellement et repose sur la mesure d’une région d’intérêt (ROI) dans le noyau et le cytosol. Bien que cette méthode donne une bonne représentation du signal de la sonde dans le temps, elle est très longue et fastidieuse, surtout lorsque les expériences et les conditions sont répétées. Il est important de noter que cette méthode manque également de précision, car seule une petite partie du compartiment conçu est représentée.

Nous proposons ici un nouveau protocole pour la quantification des signaux fluorescents LEXY et LINuS. Nous avons mis en place des techniques automatisées, qui facilitent les analyses et apportent une plus grande précision. Cela facilitera le processus pour les nouveaux utilisateurs de ces outils et contribuera à augmenter le débit. Notre protocole de quantification n’utilise qu’une seule interface, le plugin open-source TrackMate¹² de FIJI. Notamment, pour améliorer la fiabilité des quantifications, nous avons utilisé un marqueur d’ADN rouge lointain compatible avec l’imagerie en direct pour effectuer la segmentation du noyau entier avec StarDist¹³, un réseau neuronal convolutif entraîné, combiné au suivi et à la mesure du signal fluorescent de la sonde avec TrackMate¹².

Les données obtenues peuvent ensuite être facilement exportées dans le tableur fourni et prêt à l’emploi (tableau supplémentaire S1) pour obtenir l’intensité nucléaire relative de chaque noyau identifié. Ce protocole explique également comment regrouper les valeurs obtenues dans un graphique en ajustant la courbe de parcours temporel obtenue à un modèle monoexponentiel, comme dans Yoo et Mitchison¹⁴ et comment calculer le taux de transport pour les différentes conditions testées. Grâce à ce protocole et à la feuille de calcul fournie pour l’analyse, les utilisateurs seront en mesure de quantifier facilement les données d’imagerie de cellules vivantes, même avec des compétences limitées en bioinformatique.

Protocole

REMARQUE : Le protocole suivant est décrit pour la surveillance des exportations nucléaires avec la sonde de LEXY. Les détails concernant les paramètres à ajuster pour LINuS sont présentés dans la section 5.

1. Culture cellulaire

REMARQUE : La procédure décrite dans cette section doit être effectuée dans une hotte de culture tissulaire. Les étapes décrites ci-dessous ont été optimisées pour la lignée cellulaire de fibroblaste^{de souris NIH} /3T3 15, en utilisant du DMEM (ou du DMEM sans rouge de phénol lorsque cela est indiqué), complété par 10 % de sérum de bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine comme milieu (voir le tableau des matériaux). Cependant, les utilisateurs peuvent adapter la procédure à d’autres types de cellules. Le protocole convient aux cellules transfectées ou aux lignées cellulaires stables. Cependant, nous recommandons de créer des lignées cellulaires stables, comme mentionné dans la section de discussion.

1. Préparez la solution d’enrobage avec 23 μg/mL de collagène et 2 μg/mL de fibronectine dans du PBS stérile 1x. Ajouter 800 μL de la solution de revêtement dans chaque boîte d’imagerie en direct (voir le tableau des matériaux) et conserver dans l’incubateur pendant 90 min.
2. Lavez le mélange d’enrobage avec du PBS stérile 1x et ensemencez 60 000 cellules sur les paraboles d’imagerie en direct dans les milieux, pour une acquisition le lendemain.
3. Si nécessaire, transfectez les cellules avec le plasmide LEXY selon la méthode de transfection qui convient le mieux au type de cellule utilisé. Pour suivre ce protocole, effectuez une co-transfection de la sonde avec un vecteur vide pour augmenter l’efficacité, dans un rapport de 1:5 pour LEXY :vecteur vide. Protégez les cellules de la lumière dans une boîte sombre ou avec du papier d’aluminium et laissez-les pousser pendant une journée.
4. Avant l’acquisition, colorez les cellules avec un marqueur d’ADN rouge lointain compatible avec l’imagerie de cellules vivantes, dans un milieu sans rouge de phénol, et assurez-vous qu’elles sont complètement protégées de la lumière jusqu’à l’acquisition.
   NOTE : Dans notre cas, nous utilisons de l’ADN-SiR¹⁶ à 1 μM, incubé pendant au moins 1 h avant les acquisitions.
5. Pour contrôler l’exportation, utiliser l’inhibiteur d’exportation nucléaire Leptomycine B¹⁷ à 0,5 nM (légère inhibition de l’exportation) et 1 nM (forte inhibition de l’exportation), appliqué sur les cellules 1 h avant les acquisitions.

2. Imagerie

REMARQUE : Les acquisitions peuvent être effectuées avec un microscope confocal compatible avec l’imagerie en direct, qui a la capacité de créer un modèle d’acquisitions choisies et un éclairage laser pulsatile de 458 nm. Notre imagerie a été réalisée dans l’obscurité dans une chambre à 37 °C (avec 5 % de CO₂) d’un microscope confocal à balayage résonant. La configuration est optimisée avec l’objectif 20x, permettant ainsi l’imagerie simultanée de plusieurs cellules dans le même champ de vision. La séquence d’imagerie est composée de trois phases, comme sur la figure 2.

1. Phase stable
   1. Effectuez une acquisition des signaux mCherry (LEXY, laser 561 nm) et rouge lointain (SiR-DNA, laser 633 nm) toutes les 15 s, et répétez-la 10x, pour une durée totale de 150 s. Assurez-vous qu’aucun blanchiment ni translocation de LEXY dans le cytosol ne sont observés à ce stade.
      ATTENTION : Un éclairage du système avec une lumière bleue à ce stade activerait LEXY, ce qui induirait immédiatement son exportation dans le cytosol.
2. Phase d’éclairage
   REMARQUE : Cette phase est composée de trois étapes, répétées 15x.
   1. Effectuez un éclairage pulsatile avec de la lumière bleue (laser 458 nm), avec des impulsions de 36 ms répétées 150x, pour une durée totale de ~5 s.
   2. Effectuez une acquisition de signaux fluorescents mCherry (LEXY, laser 561 nm) et rouge lointain (SiR-DNA, laser 633 nm).
   3. Pause de 15 s.
3. Phase de récupération
   1. Effectuez une acquisition des signaux mCherry (LEXY, laser 561 nm) et rouge lointain (SiR-DNA, laser 633 nm) toutes les 15 s, répétez 25x, pour une durée totale de 375 s.
      REMARQUE : Cette étape est facultative et peut être supprimée si les utilisateurs souhaitent uniquement observer l’exportation de la sonde et non la récupération.

Figure 2 : Configuration des trois phases de LEXY. Pour surveiller les exportations nucléaires avec LEXY, trois phases doivent être configurées sur le logiciel du microscope. La partie supérieure indique la configuration à utiliser pour les acquisitions d’imagerie de cellules vivantes de LEXY. Cette configuration se compose d’une phase stable, pour s’assurer que le signal est stable dans le noyau, d’une phase d’éclairage, pour induire la translocation de LEXY du noyau vers le cytosol, et d’une phase de récupération, pour observer le retour de LEXY vers le noyau. La partie inférieure de la figure indique les résultats attendus avec l’imagerie de cellules vivantes. En rouge, le mCherry indique la localisation de LEXY. En gris, l’ADN-SiR colore le noyau des cellules. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Analyse pour LEXY

REMARQUE : L’ensemble de l’analyse de segmentation et de suivi est effectué à l’aide de FIJI, avec TrackMate¹², un plugin Fiji open-source (version requise détaillée dans la Table des matériaux).

1. Installez FIJI, puis téléchargez les plugins StarDist¹³ et TrackMate. Pour installer les plugins, rendez-vous dans Aide | Mise à jour ... | Gérez les sites de mise à jour et cochez CSBDeep, StarDist et Trackmate-StarDist, puis cliquez sur Appliquer les modifications. Redémarrez Fidji.
2. Alors que certains microscopes peuvent prendre chaque phase d’acquisition (Stable-Illumination-Recovery) ensemble, d’autres (par exemple, le microscope confocal référencé) les enregistrent séparément. Par conséquent, une étape supplémentaire, si vous utilisez cette configuration, consiste à concaténer les phases ensemble : ouvrez les images des trois séquences, exécutez la fonction de concaténation pour compiler les trois phases time-lapse dans un seul fichier : cliquez sur Image | Piles | Outils | Concaténer....
3. Sélectionnez la phase stable Image1, la phase d’éclairage Image2 et la phase de récupération Image3. L’image résultante est une seule image pour le time-lapse des trois phases, avec les canaux mCherry (canal 1) et SiR-DNA (canal 2) fusionnés.
4. Conservez l’image obtenue pour l’étape de segmentation ultérieure et enregistrez-la : allez dans Fichier | Enregistrer sous | Tiff....
5. Divisez le canal mCherry seul pour les analyses suivantes : allez dans Image | Couleur | Divisez les canaux et enregistrez-les : allez dans Fichier | Enregistrer sous | Tiff....
6. Pour vérifier s’il y a un blanchiment éventuel lors de l’acquisition, exécutez la commande Tracer le profil de l’axe Z sur le canal mCherry : accédez à Image | Piles | Tracez le profil de l’axe Z. Sur la table générée, cliquez sur Données | Copiez le 1er ensemble de données et collez-le dans la feuille de calcul prête à l’emploi fournie avec ce protocole (tableau supplémentaire S1), sous la cellule de profil de l’axe Z.
7. Dessinez une région d’intérêt circulaire (ROI) de la taille moyenne d’un noyau et enregistrez-la : allez dans Analyser | Outils | Responsable ROI.... Ajoutez le retour sur investissement et enregistrez-le : allez dans Plus | Sauvegarder...
   REMARQUE : Le même retour sur investissement doit être utilisé pour mesurer le bruit de fond de toutes les conditions analysées.
8. Placez le retour sur investissement enregistré dans une région sans cellules pendant toute la durée du laps de temps et mesurez l’intensité moyenne au sein de ce retour sur investissement avec la fonction d’interface ROI. Tout d’abord, assurez-vous que la valeur moyenne du gris est cochée en cliquant sur Analyser | Définir les mesures. Ensuite, cliquez sur Plus | Multi mesure. Cochez Mesurer les 50 tranches et une brute par tranche, puis cliquez sur ok.
9. Copiez-collez toutes les valeurs affichées dans la feuille de calcul fournie (tableau supplémentaire S1), sous la cellule « Contexte du retour sur investissement ».
10. Aux Fidji, fermez l’image avec uniquement le canal mCherry et sélectionnez l’image précédemment enregistrée avec les canaux fusionnés mCherry et SiR-DNA.
11. Ouvrez le plugin TrackMate : allez dans Plugins | Suivi | TrackMate.
12. Vérifiez que le nombre de points temporels est correct (de 0 à 49 si les phases proposées ont été suivies) et cliquez sur Suivant.
13. Sélectionnez le détecteur StarDist et cliquez sur Suivant.
14. Sélectionnez le canal 2 (SiR-DNA) pour segmenter les noyaux et cliquez sur Suivant. Attendez quelques secondes que le processus de segmentation se termine. Vérifiez visuellement que la segmentation obtenue correspond à la bordure des noyaux et cliquez sur Suivant (Figure 3). En cas de segmentation imprécise, notez l’identifiant de noyau correspondant (SpotID) pour l’exclure de l’analyse ultérieure à l’étape 3.26.
15. Laissez les paramètres par défaut et cliquez sur Suivant dans la fenêtre de réglage initial du seuillage . Cette fenêtre donne le nombre de taches segmentées (noyaux) parmi les 50 points temporels.
16. Définir des filtres sur des spots : créer et définir des filtres :
    1. Créez deux filtres avec l’intensité moyenne ch1 comme paramètre pour supprimer les noyaux dont le signal est trop intense ou trop faible, ce qui pourrait fausser les analyses : un filtre pour sélectionner les valeurs au-dessus du seuil défini et l’autre pour sélectionner les valeurs en dessous du seuil. Définissez la valeur pour supprimer uniquement le signal très faible ou saturé.
       REMARQUE : Ces filtres peuvent ne pas être nécessaires si des lignées cellulaires stables sont utilisées. Notez ces valeurs car elles doivent être réappliquées pour toutes les conditions.
    2. Créez deux filtres Zone pour supprimer les objets indésirables (débris, cellules mourantes ou en division) des analyses : un filtre pour sélectionner les valeurs au-dessus du seuil défini et l’autre pour sélectionner les valeurs inférieures au seuil. Cliquez sur Suivant.
       REMARQUE : Réappliquez ces valeurs pour toutes les conditions.
17. Sélectionnez un tracker : choisissez Simple LAP tracker et cliquez sur Suivant.
18. Sélectionnez les paramètres de suivi. Ajustez la distance maximale de liaison (ici, 30 μm) - la distance maximale qui sera autorisée pour relier des objets entre les images. Utilisez les options Distance maximale de fermeture de l’espace (ici, 15 μm) et Écart d’image maximal de fermeture de l’espace (ici, 3) pour définir le nombre de points d’une seule piste qui peuvent être omis sans exclure cette même piste. Cliquez sur Suivant (Figure 3).
    REMARQUE : Ces paramètres proposés ont été optimisés pour notre configuration et notre modèle cellulaire à l’aide d’une approche d’essais et d’erreurs et devront peut-être être ajustés expérimentalement.
    La distance maximale de liaison doit être ajustée pour éviter les erreurs de déplacement d’un noyau à un autre, surtout si les cellules bougent beaucoup.
19. Après les calculs, cliquez sur Suivant et définissez des filtres sur les pistes. Pour ne sélectionner que les noyaux qui ont été suivis pendant toute la durée (50 points temporels avec la séquence proposée), sélectionnez le plus grand nombre de points de la trace (placez le curseur sur plus de 49 pour la séquence proposée). Cliquez sur Suivant.
    REMARQUE : Cela facilitera l’analyse, mais n’est possible que si suffisamment de noyaux ont été suivis pendant toute la durée du temps, si ce n’est pas le cas : voir discussion.
20. Options d’affichage : cochez la case Afficher les noms des points pour pouvoir retracer chaque noyau dans des analyses ultérieures. Personnalisez les fonctionnalités affichées en fonction des préférences de l’utilisateur.
21. En bas de la page, cliquez sur Pistes | Exportez au format CSV pour enregistrer le tableau avec toutes les mesures. Fermez le tableau et cliquez sur Suivant.
22. Si vous le souhaitez, tracez les entités de la piste avec T (temps) comme axe X et l’intensité moyenne du ch1 pour l’axe Y. Cliquez sur Tracer les entités. Fermez le graphique et cliquez sur Suivant.
    REMARQUE : Cela donnera aux utilisateurs une idée de la tendance générale de l’exportation. À ce stade, il n’est pas normalisé par rapport au fond et à l’intensité initiale.
23. Cliquez sur Capturer la superposition en tant qu’action et sur Exécuter | D’accord. L’image générée sera utilisée pour identifier les noyaux quantifiés. Enregistrer : allez dans Fichier | Enregistrer sous | Tiff....
24. Dans un fichier de tableur, importez le fichier CSV obtenu avec TrackMate : sous l’onglet Données , dans le groupe Obtenir et transformer les données , cliquez sur À partir de texte/CSV et Importer.
25. Sélectionnez l’ensemble des quatre colonnes suivantes en cliquant sur la lettre correspondante et copiez-collez-les en haut de la feuille de calcul fournie (tableau supplémentaire S1), colonnes A à D, avec l’arrière-plan : Spot ID (B), Track ID (C), Frame (I), Mean intensity ch1 (M).
    REMARQUE : Assurez-vous que le début des mesures collées commence à la rangée 6 du tableau supplémentaire S1. Si ce n’est pas le cas, les mesures pourraient être décalées d’une ou plusieurs cellules et donc être incorrectes. Reportez-vous à la feuille de calcul du tableau supplémentaire S2 pour avoir un exemple de la disposition prévue.
26. Triez les résultats par ordre alphabétique en commençant par TrackID (noyau individuel) en cliquant sur la flèche dans la cellule B5 et Frame (point temporel) en cliquant sur la flèche dans la cellule C5.
27. Pour éliminer le bruit de fond, soustrayez les valeurs obtenues à l’étape 3.8 de chaque valeur obtenue dans l’intensité moyenne ch1 (précalculée dans la feuille de calcul fournie, voir le tableau supplémentaire S1).
28. Pour normaliser le signal de LEXY, calculez l’intensité moyenne du signal fluorescent mCherry dans la phase stable (trames 0 à 9). Ensuite, divisez tous les résultats obtenus dans l’intensité moyenne ch1 par l’intensité moyenne de la phase stable (précalculée dans le tableur fourni, voir le tableau supplémentaire S1).
    REMARQUE : Le nombre obtenu est l’intensité moyenne de la fluorescence nucléaire de LEXY. Toutes les mesures sont déjà affichées par noyaux à partir de la colonne L et peuvent être tracées dans un graphique.

Figure 3 : Analyse TrackMate à l’aide de FIJI. En haut, représentation schématique des analyses TrackMate, en bas, images obtenues à partir des analyses FIJI. La première représentation à gauche montre la coloration non segmentée de l’ADN-SiR, un marqueur du noyau, en gris. Le deuxième panneau représente la segmentation automatique effectuée avec le canal SiR-DNA par Stardist. Les noyaux sont colorés en fonction de l’intensité du canal mCherry, pour faciliter la visualisation et l’étape finale. Le troisième panneau montre les traces obtenues en suivant la coloration de l’ADN SiR dans les points temporels de l’ensemble de la séquence d’imagerie de cellules vivantes. Le dernier panneau à droite montre le signal fluorescent de LEXY, en rouge, dans la zone définie par la segmentation, qui sera mesurée pour chaque point temporel. Barre d’échelle = 50 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

4. Taux de transport, statistiques et chiffres

1. Tracez le graphique de l’intensité nucléaire relative.
   1. Ouvrez GraphPadPrism et créez une feuille : cliquez sur Entrer ou importer des données dans une nouvelle table, et dans les options, sélectionnez les temps écoulés pour X et le nombre maximum de noyaux segmentés pour les valeurs répliquées dans des sous-colonnes côte à côte pour Y. Cliquez sur Créer et collez les données obtenues dans le tableau.
   2. Pour les valeurs X (temps), si les paramètres d’acquisition ont été conservés comme suggéré, copiez et collez la colonne sous 'temps' dans la feuille de calcul fournie. Sinon, ajustez les valeurs en fonction des paramètres utilisés.
   3. Pour créer le graphique de l’intensité nucléaire relative, allez dans la section Graphiques. Sélectionnez XY comme famille de graphiques et Points et ligne de connexion avec barres d’erreur comme type de graphique.
   4. Dans la section Tracé , sélectionnez Moyenne, Erreur et MEB et cliquez sur OK pour afficher les graphiques. Modifiez les échelles et les visuels en fonction des paramètres choisis.
2. Ajustez l’intensité nucléaire relative à un modèle monoexponentiel.
   1. Dans la section Table de données , cliquez sur Nouvelle table de données.
      1. Sélectionnez Entrer les valeurs X en tant que X et Entrez et tracez une seule valeur Y pour chaque point en tant que Y, puis cliquez sur Créer.
      2. Dans la colonne X , indiquez les temps en décimales uniquement pour les phases d’écurie et d’éclairage ; si les paramètres d’acquisition suggérés ont été conservés, copiez et collez la colonne sous « Temps décimal » dans la feuille de calcul fournie, tableau supplémentaire S1.
      3. Collez les valeurs obtenues en tant qu’intensité nucléaire relative dans le tableau, uniquement pour les phases stable et d’éclairage.
      4. Dans la section Résultats, sélectionnez l’analyse suivante : Analyses XY | Exponentielle | Régression non linéaire (ajustement de courbe) et cliquez sur OK.
      5. Dans les paramètres, sélectionnez Plateau suivi d’une décroissance de phase comme Modèle, et dans les paramètres de contrainte, sélectionnez une constante égale à 2,25 comme X0 (le temps de début de l’éclairage), une constante égale à 1 comme Y0 (intensité nucléaire relative au début de l’éclairage), une constante égale à 0 pour le plateau (les valeurs vers lesquelles l’intensité nucléaire relative doit pencher), et indiquer que K (le taux d’exportation) doit être supérieur à 0. Laissez les autres paramètres par défaut. Cliquez sur OK.
      6. Dans la section Résultats , la ligne K indique tous les taux d’exportation pour les noyaux de la condition testée.
      7. Répétez les étapes 4.2.1 à 4.2.1.5 pour les autres conditions si nécessaire.
3. Créez le graphique du taux d’exportation.
   1. Créez une nouvelle table : sélectionnez Entrer les valeurs X comme X et Entrez et tracez une seule valeur Y pour chaque point comme Y, puis cliquez sur créer.
   2. Pour chaque condition (en colonnes), collez et transposez les valeurs K obtenues à l’étape précédente.
   3. Pour créer le graphique du taux d’exportation, allez dans la section Graphiques , sélectionnez la colonne comme famille de graphiques, et dans la section Boîte et violon , sélectionnez Tracé du violon comme type de graphique, avec Tracé du violon. Affichez tous les points sous forme de graphique. Cliquez sur OK pour voir le graphique. Personnalisez la façon de représenter les données si nécessaire.
   4. Pour exécuter un test statistique du taux d’exportation, effectuez un test de Welch t bilatéral, comme décrit dans Yoo et Mitchison¹⁴, en suivant les étapes suivantes :
      1. Dans le tableau contenant les taux d’exportation de toutes les conditions, cliquez sur Analyser | Comparaison de groupe | T-Test (et les tests non paramétriques), sélectionnez les conditions à tester, puis cliquez sur OK. Cochez la case Non apparié, Oui utiliser le test paramétrique et Test t non apparié avec correction de Welch. Ne supposez pas que les écarts-types sont égaux et cliquez sur OK.
   5. Observez les résultats de l’analyse dans le tableau de la section Résultats et rapportez-en sur le graphique des taux d’exportation si nécessaire.

5. Adaptations pour LINuS

REMARQUE : Le protocole décrit ci-dessus peut facilement être adapté pour surveiller l’importation nucléaire avec LINuS en appliquant les modifications suivantes.

1. Culture cellulaire
   1. Au lieu de la leptomycine B à l’étape 1.5, utilisez l’importazole¹⁸ comme inhibiteur nucléaire, à une concentration de 10 μM pendant 1 h avant l’acquisition.
2. Imagerie
   1. Pour avoir une importation optimale du système, remplacez les 150 répétitions d’impulsions d’éclairage de 36 ms par le laser 458 nm à l’étape 2.2.1 par 250 répétitions pour une durée totale de ~9 s.
      REMARQUE : le calage de la séquence peut dépendre du type de cellule, et les paramètres des deux sondes peuvent nécessiter un ajustement pour être optimaux, car les systèmes dépendent de la reconnaissance de NLS et NES, qui sont spécifiques au type de cellule^19,20.
3. Taux de transport, statistiques et chiffres
   1. Au lieu d’ajuster une courbe à un plateau suivi d’une décroissance de phase à l’étape 4.2.1.5, sélectionnez le plateau suivi d’une analyse d’association de phase .
   2. Contraindre X0 à 2,25, Y0 à 1 et K (le taux d’importation dans le cas de LINuS) supérieur à 0.
      REMARQUE : Les analyses de LINuS avec TrackMate sont identiques à celles de LEXY. L’intensité nucléaire relative est toujours la valeur mesurée et analysée, mais au lieu d’observer une diminution due à l’exportation de la sonde, il faut observer un enrichissement du signal fluorescent dans le noyau après l’éclairage par lumière bleue.

Résultats

Le protocole mentionné ci-dessus devrait permettre aux utilisateurs de visualiser la localisation et la translocation de la sonde lors de l’acquisition en imagerie de cellules vivantes. La figure 4 montre un exemple des images attendues acquises pour visualiser l’exportation nucléaire avec LEXY. Une diminution rapide du signal du noyau et un enrichissement du cytosol doivent être observés après quelques cycles d’éclairage à lumière bleue. Une récupération progressive du signal de la sonde peut être visible après l’arrêt des cycles d’éclairage. Pour contrôler le système, la leptomycine B, un inhibiteur d’exportation, atteste qu’un changement d’exportation peut être visualisé avec les analyses, puisqu’elle empêche LEXY d’être exporté lors d’un éclairage en lumière bleue (Figure 4).

Figure 4 : Visualisation du signal de LEXY dans le temps. Capture de points temporels représentatifs des phases d’étable, d’illumination et de récupération, acquis avec l’imagerie de cellules vivantes. La condition du méthanol représente la condition de contrôle. Lors de l’allumage de la lumière bleue pulsatile, en rouge, le signal fluorescent mCherry, rapporteur de la position de LEXY, est transloqué du noyau au cytosol. Après l’arrêt de l’éclairage, le signal est récupéré dans le noyau. Le traitement avec l’inhibiteur d’exportation Leptomycine B à 1 nM ou 0,5 nM montre l’absence ou la diminution de l’exportation de LEXY lorsque l’exportation est bloquée. Barre d’échelle = 30 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

En ce qui concerne les analyses, alors que les valeurs de la courbe d’intensité nucléaire relative pendant la phase stable devraient être autour de 1, après activation de la lumière bleue, elles devraient afficher une lente diminution jusqu’à atteindre un plateau à la fin de la phase d’éclairage (Figure 5A). Si la diminution est trop rapide ou trop lente, les paramètres d’acquisition peuvent être optimisés (voir discussion). Le traitement à la leptomycine B à des concentrations suffisantes peut également confirmer que les analyses et la technique sont suffisamment sensibles pour montrer que l’exportation nucléaire est complètement bloquée, avec des valeurs d’intensité nucléaire relative stables autour de 1 pour l’ensemble de l’expérience. Les concentrations intermédiaires de leptomycine B devraient toutefois présenter une légère exportation nucléaire (figure 5A). Ces observations visuelles devraient être confirmées quantitativement par l’obtention du taux d’exportation (figure 5B).

Figure 5 : Intensité nucléaire relative attendue de LEXY et taux de transport. (A) Le graphique représente l’intensité nucléaire relative du signal fluorescent de LEXY au cours du temps, normalisée à l’intensité moyenne de mCherry de la phase stable. L’intensité nucléaire relative de la condition méthanol (contrôle, rouge) diminue de moitié après l’éclairage, contrairement aux cellules traitées avec l’inhibiteur d’exportation Leptomycine B, à une concentration de 0,5 nM (bleu clair) ou 1 nM (bleu foncé). (B) Taux d’exportation des conditions de contrôle et de leptomycine B, obtenu en ajustant la courbe à un modèle monoexponentiel. Les valeurs obtenues lorsque l’exportation est bloquée par la leptomycine B sont significativement inférieures à la condition de contrôle. N = 18 cellules pour le méthanol (rouge), 19 cellules pour la leptomycine B 0,5 nM (bleu clair) et 15 cellules pour la leptomycine B 1 nM (bleu foncé). Les valeurs P ont été calculées par un test t de Welch bilatéral. : P < 1×¹⁰⁻⁴, **** : P < 1×10⁻⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire S1 : Tableur avec calculs prédéfinis. Cette feuille de calcul est fournie pour faciliter l’analyse. Les valeurs d’intensité obtenues avec TrackMate peuvent être directement copiées et collées dans la feuille de calcul pour obtenir les valeurs d’intensité nucléaire relatives normalisées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S2 : Exemple des résultats attendus pour une condition de contrôle de l’analyse de LEXY. La feuille de calcul représente un exemple des valeurs obtenues pour une condition de contrôle de la lignée cellulaire stable de LEXY. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Comme mentionné dans le protocole, la création de lignées cellulaires stables améliore considérablement la qualité des analyses. Tout d’abord, le fait d’avoir 100 % des cellules exprimant les sondes augmente le nombre de noyaux suivis et analysés, ce qui renforce la robustesse des analyses. Deuxièmement, il réduit la mort cellulaire induite par la surexpression des sondes et la toxicité des réactifs de transfection utilisés. Et enfin, il réduit la forte hétérogénéité des signaux fluorescents entre les cellules. Ce paramètre est important car un signal saturé ne permettra pas une détection correcte du changement d’intensité après l’éclairage. La même conclusion est vraie pour les signaux faibles, qui peuvent blanchir ou ne pas permettre de quantifier les différences. Par conséquent, nous vous recommandons de tester d’abord les sondes par transfection pour vous assurer qu’elles fonctionnent correctement, en définissant les paramètres d’acquisition, puis en créant rapidement des lignées cellulaires stables. Nous avons créé des vecteurs de lentivirus pour les sondes LEXY et LINuS, qui peuvent être partagées sur demande, ainsi que pour les lignées stables NIH/3T3 LEXY ou LINuS créées avec ces lentivirus.

Si les sondes sont transfectées ou si les cellules sont clairsemées, les paramètres suggérés diminueront probablement le nombre de traces détectées et les analyses seront moins robustes. Si c’est le cas, les utilisateurs peuvent être plus permissifs avec les spots omis dans le tracking en diminuant le filtre Nombre de spots dans les tracks (nous suggérons de garder au moins 45 spots sur 50). Attention : si ce filtre est diminué, le fichier Excel fourni (Tableau supplémentaire S1) doit être ajusté manuellement : en effet, les valeurs collées à partir du CSV importé ne prendront pas en compte les écarts. L’utilisateur doit trouver où se trouvent les points manquants avec le numéro TrackID et les corréler avec le numéro du noyau, ce qui prend généralement quelques tours de copier-coller.

Un paramètre critique pour garantir le succès de l’expérience est de garder les cellules dans l’obscurité. Comme les sondes réagissent à la lumière bleue, les utilisateurs doivent assurer le transport des cellules dans l’obscurité pendant au moins 30 min avant l’acquisition. Une petite boîte fermée ou en utilisant de l’aluminium pour couvrir le plat suffit. De même, il est nécessaire d’être très prudent de n’utiliser la lumière mCherry que pour rechercher les cellules au microscope, car l’éclairage à la lumière bleue active les cellules. Si une illumination éventuelle se produit au microscope, recherchez un autre champ éloigné pour l’acquisition. Le tracé du profil de l’axe Z à l’étape 3.6 aidera à savoir si les cellules ont été affectées par un éclairage, si la courbe diminue au lieu d’être un plateau.

La séquence d’imagerie est configurée pour se composer de trois phases. D’abord, la phase stable, pour évaluer un éventuel blanchissement mais aussi pour s’assurer que la localisation de LEXY est stable sans activation (1). Deuxièmement, la phase d’activation, consistant en des cycles d’éclairage pulsatile en lumière bleue, pour induire la translocation de LEXY du noyau vers le cytosol (2). Enfin, la phase optionnelle de récupération, où le signal revient progressivement à sa position initiale dans le noyau (3).

La séquence décrite pour les acquisitions peut être spécifique au type de cellule^19,20. Pour la première expérience, l’utilisateur doit tester et modifier la puissance et les synchronisations du laser pour voir le système se déplacer progressivement entre le noyau et le cytosol. Il est important de noter qu’une puissance laser trop forte, ou une pause trop courte, pourrait empêcher de voir une translocation progressive, mais plutôt une baisse/enrichissement brutal (en fonction de la sonde utilisée) de l’intensité de mCherry après l’éclairage.

Si l’optimisation de la séquence ne résout pas le problème, il est probable que la NES et/ou la NLS ne soient pas adaptées au type de cellule utilisé. Les utilisateurs peuvent se référer à l’article⁸ de la méthode LINuS pour concevoir et modifier les sondes. Les utilisateurs peuvent également consulter cet article pour l’imagerie de LINuS avec un microscope à épifluorescence.

La segmentation des noyaux est une étape critique de l’analyse. Un marqueur nucléaire robuste et fiable doit être utilisé pour l’imagerie des cellules vivantes des sondes. Étant donné que l’éclairage par la lumière bleue active la translocation de la sonde, et parce que les sondes sont surveillées avec la protéine fluorescente mCherry, ce marqueur doit être visible dans le spectre rouge lointain ou à proximité. Dans notre cas, nous utilisons de l’ADN-SiR qui colore les cellules pendant 1 à ~24 h d’incubation, mais l’utilisation de l’ADN-SPY 650 est également une option (voir la Table des matériaux pour les références).

Enfin, si la segmentation avec StarDist combinée au suivi filtré de TrackMate prouve son efficacité, il est important de noter que l’utilisateur doit toujours vérifier visuellement les résultats de la segmentation et de la quantification. Une cellule en division ou en mort peut être incluse dans la quantification, alors qu’elle ne devrait pas l’être. Pour réduire les risques d’analyse de tels événements, la feuille Excel fournie attribue un code couleur à l’intensité nucléaire relative (bleu = valeurs faibles, rouge = valeurs élevées). En inspectant les couleurs avant de tracer les valeurs dans GraphPad Prism, l’utilisateur devrait être en mesure de remarquer toutes les valeurs inhabituelles. Par exemple, les intensités nucléaires relatives de LEXY doivent varier de élevées (rouge, fortes quantités de la sonde dans les noyaux) pendant la phase stable à faibles (bleu, quantités réduites de la sonde dans les noyaux) à la fin de la phase d’éclairage, avant de revenir à des valeurs élevées (rouge), lors de la phase de récupération (comme indiqué dans le tableau supplémentaire S2).

Ce protocole présente divers avantages par rapport aux méthodes précédemment proposées ^5,6. Le pipeline semi-automatique facilite l’analyse du transport nucléocytoplasmique de LEXY et LINuS, et offre plus de précision que la quantification manuelle proposée précédemment ^5,6. L’utilisation de notre protocole permettra aux débutants dans le domaine d’effectuer des analyses efficaces, mais fournira également un nouvel outil pour les utilisateurs expérimentés, qui n’auront besoin que d’une seule interface en libre accès pour effectuer des analyses semi-automatisées du transport nucléocytoplasmique.

Cette méthode peut être utilisée pour d’autres applications que l’étude du taux de transport nucléocytoplasmique global dans les lignées cellulaires NIH3T3. En effet, avec quelques étapes d’optimisation, il peut être adapté pour étudier le taux de transport de la sonde dans divers types de cellules ou d’animaux^vivants8. De plus, en fusionnant une protéine d’intérêt à LEXY ou à LINuS, il est également possible d’étudier son taux de transport ou les effets en aval de sa translocation induite par la lumière dans ou hors du noyau. Par exemple, il est possible de séquestrer une protéine dans le cytoplasme avec LEXY, ou de forcer sa localisation dans le noyau avec LINuS 5,6,21,22,23. Enfin, les analyses décrites peuvent également être étendues à d’autres applications que LEXY et LINuS, pour suivre tout signal qui se déplace entre des compartiments subcellulaires pouvant être segmentés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagène	Sigma-Aldrich	08-115
Microscope confocal	LEICA	SP8
DMEM	Gibco	31966021
Exceller	Microsoft
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
Fibronectine	Sigma-Aldrich	Réf. F1141
Logiciel FIJI	FIDJI		ImageJ 2.16.0/1,54p ; Java1.8.0_322
Boîtes fluorescentes	Dutscher	Réf. FD3510-100	Alternative : Chambre Attofluor (Invitrogen #A7816)
GraphPad Prism 10.4.1	GraphPad Software, Inc.
Importazole	Sigma-Aldrich	SML0341
Leptomycine B	Sigma-Aldrich	L2913
Plasmide LEXY	Addgene	72655	pDN122
Plasmide LINuS	Addgene	61347	pDN77
Crayonline-Streptomycine	Gibco	15140-122
DMEM sans rouge de phénol	Gibco	21063-029
ADN-SiR	Spirochrome	SC007	Alternative : SPY-DNA650 (Spirochrome #SC501)
Plugin Stardist 2D	StarDist		StarDist_0.3.0
Plug-in TrackMate	TrackMate		TrackMate-7.14.0