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Article de méthode

Méthodologie pour l’étude de l’apprentissage et de la mémoire chez des rats juvéniles à l’aide de l’anesthésie au sévoflurane pour évaluer l’expression du p-CREB et du c-fos de l’hippocampe

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DOI :

10.3791/68591

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19 septembre 2025

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1Department of Anesthesiology and SICU, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Cette étude examine comment le sévoflurane altère la rétention de la mémoire et réduit l’expression de p-CREB et c-fos dans les neurones de l’hippocampe via la voie NMDAR/p-CREB/c-fos chez les rats juvéniles. Les résultats montrent que le sévoflurane provoque des déficits de mémoire à court terme et régule à la baisse les marqueurs de plasticité synaptiques, avec des effets réversibles après 3 jours, indépendamment de la fréquence de dosage.

Résumé

L’étude des troubles cognitifs au cours du développement cérébral se heurte à des défis en raison de la nature dynamique du neurodéveloppement, des contraintes méthodologiques et des barrières contextuelles. Cette étude a examiné une approche méthodologique intégrée pour étudier les déficiences cognitives dans le cerveau en développement causées par le sévoflurane sur la base de la mémoire et de l’expression de p-CREB et c-fos dans les neurones de l’hippocampe par la voie de signalisation NMDAR/p-CREB/c-fos chez les rats juvéniles. Soixante-quatre rats mâles SD âgés de 21 jours (poids corporel <80 g) ont été divisés en cinq groupes : normal (n = 8), 60 % O2 (n = 16), entraînement simulé (n = 8), sévoflurane à dose unique (n = 16) et sévoflurane à doses multiples (n = 16). Les deux groupes de sévoflurane ont été subregroupés en sacrifice : 1 jour (groupes sev1a et sev1b) et 30 jours (groupes sev30a et sev30b) après l’entraînement (n=8/sous-groupe) ; Tous les autres rats ont été sacrifiés 1 h après l’entraînement. Le test du labyrinthe en Y a été utilisé pour évaluer l’apprentissage et la rétention de la mémoire. L’immunohistochimie a été utilisée pour déterminer le nombre de neurones p-CREB- et c-fos-positifs dans les échantillons d’hippocampe. Par rapport au groupe O2 à 60 % (rétention de la mémoire de 86,33 % ± 17,52 %), la mémoire des rats dans les groupes sev1a et sev1b a montré une diminution significative (sev1a : 44,29 % ± 11,26 % ; sev1b : 62,42 % ± 7,27 % ; tous P<0,05), tandis que les groupes sev1b et sev30b n’ont montré aucune différence significative (sev30a : 84,41 % ± 14,15 % ; sev30b : 85,21 % ± 11,61 % ; tous P>0,05). Par rapport au groupe O2 à 60 % (c-fos : 92,83 ± 7,88 ; p-CREB : 72,22 ± 8,89), l’expression de p-CREB et c-fos dans les neurones de l’hippocampe a diminué dans le groupe sev1a (c-fos : 23,13 ± 3,28 ; p-CREB : 22,88 ± 5,18) et le groupe sev30 (c-fos : 23,22 ± 3,13 ; p-CREB : 25,58 ± 2,26) (tous P<0,05), tandis que les groupes sev30a et sev30b n’ont montré aucune différence significative (tous P>0,05). Le sévoflurane a un effet stimulant négatif à court terme sur la capacité de maintien de la mémoire des rats juvéniles sans impact basé sur la fréquence de dosage. Le sévoflurane diminue l’expression de p-CREB et c-fos dans les neurones de l’hippocampe de rats juvéniles.

Introduction

L’étude des troubles cognitifs au cours du développement cérébral se heurte à des défis importants en raison de la nature dynamique du neurodéveloppement, des contraintes méthodologiques et des barrières contextuelles. Le développement du cerveau implique des changements rapides et non linéaires, ce qui complique l’identification des déficiences pendant les fenêtres critiques 1,2. Dans les milieux à faibles ressources, des obstacles tels que la littératie des aidants, la diversité linguistique et l’accès limité à des outils spécialisés (p. ex., l’IRM) entravent le dépistage précoce1. La variabilité individuelle de la maturation cérébrale rend difficile la distinction entre les écarts pathologiques et le développement typique 2,3. Des affections telles que le syndrome de Down présentent un développement cortical altéré, mais la petite taille des échantillons et les données histologiques limitées limitent les connaissances mécanistes4. Les troubles neurodéveloppementaux (p. ex., TSA, TDAH) coexistent souvent avec l’anxiété ou la dépression, ce qui fausse les évaluations cognitives5. De graves déficits de communication dans certaines populations limitent l’utilisation des tests standardisés6. Ces caractéristiques soulèvent plusieurs problèmes de conception de recherche. En effet, la plupart des études utilisent des plans transversaux, sans parvenir à modéliser les changements au sein de l’individu au fil du temps. Il y a une dépendance excessive à l’égard des populations occidentales éduquées (échantillons « WEIRD »)7. La recherche sur le syndrome de Down souffre de petits échantillons de cerveau post-mortem et de contrôles inadéquats selon l’âge4. Les outils d’évaluation momentanée écologique peinent à tenir compte des variables contextuelles affectant les performances cognitives quotidiennes5.

Les fonctions les plus importantes du cerveau animal et humain comprennent l’apprentissage et la mémoire, qui sont au cœur du développement humain et de la vie en général8. Le cerveau des nourrissons est en phase de développement et est vulnérable aux facteurs externes tels que les médicaments et l’anesthésie 9,10. Les dommages causés par les anesthésiques à la fonction de mémoire des nourrissons sont un sujet de recherche clinique crucial et peuvent même retarder les traitements optimaux pour les patients pédiatriques en raison de l’incapacité à effectuer une anesthésie11. Les dysfonctionnements cognitifs liés à l’anesthésie (ou dysfonctionnement cognitif postopératoire, POCD) peuvent avoir des conséquences à long terme pour les nourrissons12. L’inhalation de sévoflurane peut affecter les fonctions de mémoire chez les nourrissons13,14, mais l’anesthésiologie traditionnelle croit que les lésions cérébrales chez les nourrissons sont principalement causées par l’hypoxie cérébrale pendant l’anesthésie, en particulier dans l’anesthésie générale10. Par conséquent, tant qu’il n’y a pas d’hypoxie à court ou à long terme dans le cerveau, le risque de lésion du système nerveux central chez les nourrissons devrait être réduit11. Pourtant, la compréhension du POCD reste sous-optimale. Les nourrissons nécessitant une intervention chirurgicale auront besoin d’une anesthésie, et une meilleure connaissance des voies impliquées pourrait aider à concevoir des stratégies d’anesthésie qui minimiseraient le risque de POCD.

Une étude portant sur des patients âgés ayant subi des chirurgies non cardiaques a révélé que près de 25 % des patients présentaient des POCD dans la semaine suivant la chirurgie, et que la proportion diminuait à moins de 10 % après 3 mois, tandis que le groupe témoin présentait des taux de POCD de 3,4 % et 2,8 %15. L’étude a également indiqué que la plupart des cas de POCD étaient réversibles, seul un petit nombre de patients présentant une POCD15 prolongée ou permanente. Dans le système nerveux central, le glutamate est l’acide aminé excitateur le plus courant16. Le récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) est crucial pour l’induction et le maintien de la potentialisation à long terme (LTP) et de la dépression à long terme (LTD)17. Des recherches sur des souris ont montré que la plasticité synaptique excitatrice affecte directement le développement des fonctions cérébrales18, l’activation de NMDAR et l’afflux de calcium étant particulièrement importants19,20. L’augmentation de l’activité NMDAR a des implications significatives pour l’induction de la croissance synaptique et de la plasticité19,20. Par conséquent, un degré plus élevé de blocage du NMDAR par les antagonistes du NMDAR (par exemple, le sévoflurane) devrait entraîner une diminution des capacités d’apprentissage et de mémoire21. Bien que les effets du sévoflurane sur l’apprentissage et la mémoire dans le cerveau adulte n’aient pas atteint une conclusion claire22,23, le sévoflurane est couramment utilisé pour l’anesthésie dans les chirurgies pédiatriques14. En tant qu’antagoniste non compétitif du NMDAR, le sévoflurane peut affecter de manière significative les fonctions d’apprentissage et de mémoire du cerveau 11,13,14,23,24. Néanmoins, outre le NMDAR, d’autres voies et protéines sont impliquées dans l’apprentissage et la mémoire, et les mécanismes de régulation de la mémoire impliquant la protéine de liaison à l’élément de réponse à l’AMPc phosphorylée (p-CREB) et le gène c-fos précoce immédiat deviennent plus clairs 25,26,27, mais nécessitent encore une meilleure compréhension pour une administration optimale de l’anesthésie chez les nourrissons et les enfants.

Sur la base de ces cadres théoriques, la présente étude a examiné une approche méthodologique intégrée qui pourrait être utilisée pour étudier les déficiences cognitives dans le cerveau en développement causées par le sévoflurane basées sur la mémoire et l’expression de p-CREB et c-fos dans les neurones de l’hippocampe par la voie de signalisation NMDAR/p-CREB/c-fos chez les rats juvéniles. Les résultats pourraient aider à améliorer notre compréhension du POCD et des troubles de la mémoire après une anesthésie générale. Cette étude a porté sur des rats âgés de 21 jours parce qu’ils venaient d’être sevrés et avaient un poids corporel et un état physiologique très uniformes, correspondant au début de l’adolescence chez l’homme. En raison de leur neuroplasticité accrue et de leur vulnérabilité au cours de cette période critique de développement, ils peuvent modéliser efficacement les troubles cognitifs causés par la chirurgie ou l’anesthésie sur le cerveau immature28,29. Cela les rend particulièrement adaptés à l’étude des risques neurocognitifs associés à la chirurgie pédiatrique et à l’exploration de stratégies d’intervention potentielles. Le labyrinthe en Y est une méthode couramment utilisée pour évaluer l’apprentissage et la mémoire30. L’immunohistochimie est couramment utilisée pour étudier les neurones et diverses protéines neuronales.

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Protocole

Tous les protocoles de cette étude ont été examinés et approuvés par le Comité d’éthique de l’hôpital Xinhua de la faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (approbation n° 100). XHEC-C-2016-023-2).

1. Vue d’ensemble expérimentale des animaux et des regroupements

  1. Obtenez 64 rats SD mâles de 21 jours (poids corporel inférieur à 80 g).
  2. Répartissez les rats en cinq groupes : le groupe normal (n = 8), le groupe O2 à 60 % (n = 16), le groupe d’entraînement simulé (n = 8), le groupe sevoflurane à dose unique (n = 16) et le groupe sevoflurane à doses multiples (n = 16) (voir le tableau 1).
  3. Hébergez les rats dans une animalerie à 20-24 °C avec 50 à 60 % d’humidité et de lumière naturelle.
  4. Fournir suffisamment de nourriture et d’eau.
  5. S’assurer que tous les protocoles sont examinés et approuvés par le comité d’éthique.
  6. Préparez la chambre d’inhalation (voir la figure supplémentaire S1, détaillée au point 2.1).
  7. Groupe normal
    1. Exposez les rats à 60 % d’air pendant 2 h (voir section 2.2).
    2. Effectuez le test du labyrinthe en Y 1 jour après l’exposition (détaillé dans la section 4).
    3. Prélever des tissus après des tests comportementaux (détaillés dans la section 5).
  8. 60 % groupe O2
    1. Exposez les rats à 60 % d’air pendant 2 h (voir section 2.2).
    2. Effectuez des tests de labyrinthe en Y 30 jours après l’exposition (détaillés à la section 4).
    3. Prélever des tissus après des tests comportementaux (détaillés dans la section 5).
  9. Groupe d’entraînement simulé
    1. Exposez les rats à 60 % d’air pendant 2 h (voir section 2.2).
    2. Effectuer des tests de labyrinthe en Y 1 jour après l’exposition sans entraînement structuré (les lumières et les zones de choc variaient de manière aléatoire), utilisé pour contrôler les effets de la lumière et des stimuli électriques sur l’apprentissage et la mémoire (détaillé dans la section 4).
    3. Prélever des tissus après des tests comportementaux (détaillés dans la section 5).
  10. Groupe sévoflurane à dose unique (groupe sev1a)
    1. Exposer les rats à 60 % d’air + 3 % de sévoflurane pendant 2 h (voir section 2.2).
    2. Effectuez le test du labyrinthe en Y 1 jour après l’exposition (détaillé dans la section 4).
    3. Prélever des tissus après des tests comportementaux (détaillés dans la section 5).
  11. Groupe sévoflurane à dose unique (groupe sev30a)
    1. Exposer les rats à 60 % d’air + 3 % de sévoflurane pendant 2 h (voir section 2.2).
    2. Effectuez des tests de labyrinthe en Y 30 jours après l’exposition (détaillés à la section 4).
    3. Prélever des tissus après des tests comportementaux (détaillés dans la section 5).
  12. Groupe sévoflurane à doses répétées (groupe sev1b)
    1. Exposer les rats à 60 % d’air + 3 % de sévoflurane pendant 2 h par jour, pendant 7 jours consécutifs (voir section 2.2).
    2. Effectuez le test du labyrinthe en Y 1 jour après l’exposition (détaillé dans la section 4).
    3. Prélever des tissus après des tests comportementaux (détaillés dans la section 5).
  13. Groupe sévoflurane à doses répétées (groupe sev30b)
    1. Exposer les rats à 60 % d’air + 3 % de sévoflurane pendant 2 h par jour, pendant 7 jours consécutifs (voir section 2.2).
    2. Effectuez des tests de labyrinthe en Y 30 jours après l’exposition (détaillés à la section 4).
    3. Prélever des tissus après des tests comportementaux (détaillés dans la section 5).

2. Inhalation de sévoflurane

  1. Préparation de la chambre (voir figure supplémentaire S1)
    1. Connectez le trou à gauche de la boîte à 60 % O2/40 % N2.
    2. Connectez l’alimentation en oxygène au vaporisateur de sévoflurane.
    3. Connectez le trou à droite de la boîte à l’analyseur de gaz d’un appareil d’anesthésie.
    4. Connectez le trou sur le dessus de la chambre aux déchets de gaz.
    5. Placez de la chaux sous le grillage au fond de la chambre et ajoutez du coton.
    6. Placez l’installation dans une hotte.
    7. Placez un coussin chauffant sous la chambre.
  2. Inhalation
    1. Allumez l’alimentation en oxygène et le vaporisateur de sévoflurane.
    2. Ajustez le débit d’oxygène à 2 L/min.
    3. Lorsque la concentration de sévoflurane atteint 3,0 %, maintenez le débit pendant 30 min pour stabiliser l’atmosphère dans la chambre.
    4. Placez un rat sur le côté coton de la chambre.
    5. Maintenez le rat là selon le groupement (voir étape 1.2).
    6. Surveillez la couleur de la peau, la fréquence respiratoire, la fréquence cardiaque et l’oxymétrie de pouls.
    7. Retirez le rat.
    8. Laissez le rat se réveiller naturellement.
    9. Remettez le rat dans sa cage.

3. Réactifs et instruments expérimentaux

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparez 250 ml de sévoflurane disponible dans le commerce pour l’administration de l’anesthésie.
    2. Préparez la solution de travail de l’anticorps p-CREB en diluant l’anticorps stock 1:350.
    3. Préparez la solution de travail de l’anticorps c-fos en diluant l’anticorps stock 1:200.
    4. Assemblez le kit de coloration immunohistochimique.
    5. Préparez 4 % de paraformaldéhyde.
      1. Dissoudre 40 g de paraformaldéhyde soluble (PFA) dans un récipient en verre avec 500 ml d’eau de haute pureté, chauffer continuellement et agiter magnétiquement à 60-65 °C jusqu’à ce qu’il forme une suspension laiteuse.
      2. Ajouter des gouttes de 1,0 mol/L de NaOH jusqu’à ce que la solution devienne claire (pH = 7,0).
      3. Ajouter environ 500 ml de PBS et bien mélanger dans un bain de glace ou un bain d’eau froide.
      4. Vérifiez à nouveau le pH, filtrez et augmentez le volume jusqu’à 1000 ml.
      5. Conserver à 4 °C pour une utilisation future.
  2. Configuration de l’équipement
    1. Positionnez le labyrinthe en Y dans la zone de test comportemental (voir figure supplémentaire S2).
    2. Calibrez le microscope avec un système d’imagerie intégré pour l’analyse histologique.
  3. Installez le microtome avec des lames fraîches pour la section des tissus.
  4. Programmez la machine de déshydratation avec le protocole standard de traitement des tissus.
  5. Préparez la machine à colorer avec les bains de coloration séquentiels selon les instructions du fabricant de la machine.
  6. Installez l’appareil de perfusion.
    1. Utilisez deux bouteilles de solution saline emballées en plastique, égouttez la solution saline par l’ouverture inférieure et remplissez-les de PBS et de fixateur de paraformaldéhyde à 4 %.
    2. Accrochez les flacons, connectez-les avec des dispositifs de perfusion et fixez un robinet d’arrêt à trois voies à l’extrémité épaisse de l’aiguille du dispositif de perfusion.

4. Labyrinthe en Y et tests d’apprentissage/mémoire

  1. Assembler le Y-Maze
    1. Installez le labyrinthe en Y avec trois bras rectangulaires étiquetés I, II et III, reliés par une jonction triangulaire (voir la figure supplémentaire S2).
    2. Placez une grille électrique espacée de 1 cm au fond du labyrinthe.
    3. Fixez de fines bandes de cuivre de 2 cm sur les parois du labyrinthe pour simuler les zones dangereuses et installez des feux de stimulus.
  2. Définir les zones dangereuses et sûres
    1. Électrifier les régions I, II et III à 16 000 V/m pour indiquer les zones dangereuses (le feu de signalisation s’allume lorsqu’il est électrifié).
    2. Marquez les régions non électrifiées par un feu rouge pour indiquer les zones sûres.
    3. Définissez la jonction entre les bras comme une zone non sûre où le rat peut recevoir un choc électrique.
  3. Procédure de formation
    1. Au début de l’expérience, considérez la zone où se trouve le rat comme la zone de sécurité.
    2. Après 2 à 4 minutes, appliquez de l’électricité sur la zone de sécurité, en encourageant le rat à se déplacer vers la zone de sécurité.
    3. Si le rat se déplace de la zone de sécurité vers une zone dangereuse, il retournera dans la zone de sécurité sous l’effet d’un choc électrique, affichant une réponse d’évitement passif.
  4. Développer la réponse d’évitement actif
    1. Après plusieurs séances d’entraînement, allumez la lumière dans la zone de sécurité sans appliquer de chocs électriques.
    2. Observez le mouvement du rat vers la zone de sécurité éclairée, formant un réflexe de discrimination conditionné entre la lumière et l’obscurité (réponse d’évitement active).
  5. Placez le labyrinthe en Y dans un endroit faiblement éclairé et calme pour minimiser les distractions externes.
  6. Organisez la formation tous les jours entre 9h00 et 11h00 et entre 14h00 et 16h00.
  7. Laissez les rats se déplacer librement dans le labyrinthe pendant 5 minutes avant l’expérience pour les aider à s’adapter à l’environnement du labyrinthe.
  8. Ajuster les paramètres du stimulus
    1. Ajustez la tension de stimulus (16 000 V/m) pendant le test pour vous assurer que les rats s’échappent dans les 10 secondes suivant l’émission d’un choc électrique.
    2. Laissez le voyant de sécurité allumé pendant 15 s, puis éteignez-le.
    3. Commencer la prochaine série d’expériences de choc après un intervalle de 45 secondes.
  9. Séquence de feux de signalisation et réponse correcte
    1. Réglez la séquence d’allumage du feu de signalisation comme I → II → III → I, dans un cycle.
    2. Définissez une réponse correcte lorsque le rat s’échappe de la zone de départ directement vers la zone de sécurité éclairée dans les 10 s suivant la réception d’un choc électrique.
  10. Considérez que le rat a atteint la norme d’apprentissage s’il fait la bonne réponse d’évasion dans 8 essais consécutifs sur 10.
  11. Enregistrez toute fuite vers un bras sans lumière comme une réponse incorrecte.
  12. Plusieurs sessions de formation et de test
    1. Effectuez plusieurs sessions d’entraînement et de test pour évaluer l’apprentissage et la mémoire.
    2. Enregistrez le nombre de réponses correctes et incorrectes au cours d’un nombre fixe d’essais.
    3. Modifiez la zone de départ pour augmenter la complexité des tâches.
  13. Évaluer la rétention de la mémoire à intervalles réguliers (p. ex., 24 ou 48 h après l’entraînement) pour évaluer la capacité de rétention de la mémoire des rats.

5. Immunohistochimie

  1. Anesthésier les rats
    1. Administrer une injection intrapéritonéale d’hydrate de chloral à 10 % (0,4 mL/100 g) 1 h après l’entraînement pour anesthésier les rats. Éliminez la solution d’hydrate de chloral conformément aux réglementations locales.
    2. Effectuer une thoracotomie pour exposer complètement le cœur31.
  2. Perfuser des rats anesthésiés avec une solution physiologique
    1. Insérez une aiguille contenant du PBS dans le ventricule gauche en direction de l’aorte, fixez l’aiguille avec une pince hémostatique et ouvrez immédiatement l’oreillette droite de la souris pour libérer le sang veineux.
    2. Injectez rapidement du PBS jusqu’à ce que l’effluent soit clair et que le foie et les poumons apparaissent blancs.
    3. Poursuivez avec une perfusion rapide puis lente de 500 ml de solution de formol à 10 % jusqu’à ce que le corps de l’animal se raidisse, réalisant ainsi la fixation du formol.
    4. Jetez la solution de formol conformément aux réglementations locales.
  3. Retirer le cerveau
    1. Ouvrez rapidement le crâne32.
    2. Retirez tout le cerveau en le soulevant doucement du crâne et en coupant les vaisseaux sanguins et la moelle épinière à la base, sans endommager les hémisphères (comme le montre la figure supplémentaire S3).
  4. Disséquer l’hippocampe
    1. Disséquez l’hippocampe bilatéral.
      1. Au niveau du foramen occipital de la souris, sectionnez tout le cerveau avec des ciseaux.
      2. Insérez soigneusement des ciseaux en diagonale dans le foramen magnum pour couper l’os pariétal.
      3. Séparez les deux côtés de l’os pariétal à l’aide d’une pince hémostatique.
      4. Utilisez des ciseaux pour couper le nerf optique d’un côté et sondez jusqu’à la base du crâne.
    2. Placez l’hippocampe dans une solution de formol à 10 % pendant 12 h.
    3. Immerger l’échantillon dans du formol contenant un gradient de saccharose (10 %, 20 %, 30 %).
    4. Conserver toute la nuit à 4 °C jusqu’à ce que le tissu de l’échantillon coule au fond.
  5. Enfoncer et sectionner l’éprouvette
    1. Incorporez l’échantillon dans de la paraffine. Jetez la solution de formol conformément aux réglementations locales.
    2. Sectionnez l’échantillon encastré à 4 μm.
  6. Déparaffiniser et réhydrater les sections
    1. Faire tremper les sections dans 50 mL de xylène trois fois pour la déparaffinisation, chaque fois pendant 15 min.
    2. Immergez séquentiellement dans 50 ml d’éthanol 100 %, 90 %, 70 % et 50 % pendant 10 minutes chacun.
    3. Rincer trois fois avec 50 ml de PBS 0,01 mM pendant 3 minutes chacun.
  7. Récupération d’antigènes
    1. Placez les sections dans 50 mL de tampon de citrate (PBS, pH 6,0).
    2. Chauffer les sections dans un autocuiseur en acier inoxydable à 120 °C. Placez les sections sur une grille, complètement immergées dans le tampon. Fermez l’autocuiseur, chauffez et maintenez sous haute pression pendant 3 min.
    3. Retirez l’autocuiseur du feu et laissez-le refroidir naturellement à température ambiante avant d’ouvrir le couvercle.
    4. Rincez les sections au PBS (pH 7,2) pendant 2 min, en répétant 3 fois.
    5. Appliquer environ 100 à 200 μL de 3 % H2O2 pour couvrir la section sur la lame et incuber à température ambiante pendant 5 à 10 minutes pour éliminer l’activité endogène de la peroxydase.
    6. Rincer au PBS pendant 2 min, 3 fois.
  8. Incubation primaire de l’anticorps
    1. Ajouter 200 μL d’anticorps primaires (dilués 1:150 dans 0,01 mol/L de PBS) dans les sections.
    2. Incuber une nuit à 4°C.
  9. Incubation secondaire d’anticorps
    1. Rincez les sections au PBS pendant 3 min, 3 fois.
    2. Incuber les sections avec environ 100 à 200 μL de Polymer Helper pour couvrir la section sur la lame et incuber à 37 °C pendant 20 min.
    3. Rincez les sections à 0,1 mol/L de PBS pendant 2 min, 3 fois.
    4. Ajouter environ 100 à 200 μL d’IgG anti-polyperoxydase-souris/lapin et incuber à 37 °C pendant 20 min.
    5. Rincez les sections au PBS pendant 3 min, 3 fois.
  10. Développement des couleurs
    1. Ajoutez environ 100 à 200 μL de solution de diaminobenzidine (DAB) (suffisamment pour couvrir la section de la lame) pour le développement de la couleur.
    2. Laissez-le réagir pendant environ 3 min.
  11. Contre-coloration et montage
    1. Effectuez une contre-coloration en ajoutant environ 100 à 200 μL d’hématoxyline goutte à goutte pour couvrir complètement la section de chaque lame.
  12. Déshydrater et monter les sections
    1. Déshydrater les sections dans 50 mL d’éthanol à 50 %, 70 %, 90 % et 100 % pendant 10 min chacune, puis 50 mL de xylène pendant 10 min.
    2. Nettoyez et montez les sections à l’aide des procédures standard.
  13. Examen microscopique
    1. Comptez le nombre de neurones p-CREB- et c-fos-positifs dans l’hippocampe de chaque groupe33,34.
    2. Examinez les sections au microscope à un grossissement de 400x.
    3. Enregistrez le nombre moyen de neurones positifs dans chaque coupe, en fonction du dénombrement de trois sections par animal sans chevauchement.
      REMARQUE : Toutes les données ont été compilées dans une feuille de calcul informatique. Toutes les analyses ont été effectuées à l’aide d’un logiciel statistique. Les résultats ont été présentés sous forme de moyennes ±erreur type de la moyenne (SEM) et analysés à l’aide d’une ANOVA à un facteur avec les tests post-hoc SNK-q et Dunnett T335. Le test SNK-q est couramment utilisé pour les études exploratoires et convient aux comparaisons par paires entre plusieurs moyennes d’échantillons. Il ne repose pas sur des hypothèses prédéfinies, ce qui le rend idéal pour comparer toutes les moyennes de groupe36. Le test Dunnett T3 est généralement utilisé pour les études de confirmation avec des hypothèses prédéfinies. Il convient de comparer plusieurs groupes de traitement avec un groupe témoin ou de comparer des moyens ayant une signification professionnelle particulière35,37. Lorsque la valeur P du test ANOVA était ≤ 0,05, les tests post-hoc par paires ont été effectués pour déterminer quels groupes étaient significativement différents des autres. Les valeurs P bilatérales < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

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Résultats

En utilisant les données de cette étude comme exemples illustratifs, nous avons présenté les types de résultats qui peuvent être générés avec ce cadre méthodologique, y compris des images représentatives d’immunomarquage ainsi que des données comportementales et moléculaires de différents groupes. L’accent est mis sur la présentation des résultats typiques ou attendus produits par cette approche, plutôt que sur la fourniture d’une interprétation de leur signification biologique.

Résult...

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Discussion

Cette étude a examiné comment le sévoflurane affecte la mémoire et module l’expression de p-CREB et c-fos dans les neurones de l’hippocampe par le biais de la voie de signalisation NMDAR/p-CREB/c-fos chez les rats juvéniles. Les résultats suggèrent que le sévoflurane a eu un effet stimulant négatif à court terme (1 heure après l’entraînement, pas après 3 jours) sur la capacité de maintien de la mémoire des rats juvéniles, sans impact basé sur la fréquence des doses (dose unique ou sept d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs signalent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Remerciements

Ye Jiang et Guohui Li ont conçu l’étude. Ye Jiang et Lai Jiang ont collecté et analysé les données et rédigé le manuscrit. Ye Jiang et Guohui Li ont révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé la version finale du manuscrit pour soumission. Ce travail est soutenu par des subventions accordées à Guohui Li dans le cadre du programme Shanghai Pujiang (subvention n° 23PJD057).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Animaux d’expérimentation
Sprague-Dawley (SD) RatsCharles River Laboratories (Pékin, Chine)N/AMâle de 21 jours
Standard Rat ChowKeao Xieli Feed (Pékin, Chine)N/ARégime alimentaire standard pour animaux de laboratoire
Produits chimiques et réactifs
Chloral HydrateRéactif chimique Sinopharm (Shanghai, Chine)80113818Anesthésique pour la perfusion terminale
Tampon de citrate (10x)ZSGB-BIO (Pékin, Chine)ZLI-9064Solution de récupération d’antigène, pH 6,0
Éthanol (100 %)Réactif chimique Sinopharm (Shanghai, Chine)100092683Agent de déshydratation pour l’histologie
Solution de coloration à l’hématoxylineBaso Diagnostics Inc. (Zhuhai, Chine)BA-4041Contre-coloration pour IHC
Peroxyde d’hydrogène (H2O2)Réactif chimique Sinopharm (Shanghai, Chine)10011218Solution à 3 % pour bloquer la peroxydase endogène
Baume neutreSolarbio (Pékin, Chine)Référence G8590Support de montage pour glissières
Azote (N2)Shanghai Medical Gas Co. (Shanghai, Chine)N/AHaute pureté, pour mélange de gaz
Oxygène (O2)Shanghai Medical Gas Co. (Shanghai, Chine)N/AQualité médicale, pour mélange de gaz
ParaffineLeica Biosystems (Nussloch, Allemagne)39601006Milieu d’enrobage tissulaire
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis)158127Fixateur pour la perfusion et la fixation tissulaire
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco (Waltham, MA, États-Unis)7001104410x solution mère, pH 7,4
SévofluraneAbbVie Inc. (North Chicago, IL, États-Unis)N/AAgent anesthésique par inhalation
Citron vert sodaW. R. Grace and Co. (Columbia, MD, États-Unis)22-01-0010Absorbant de CO2 pour chambre d’inhalation
Hydroxyde de sodium (NaOH)Réactif chimique Sinopharm (Shanghai, Chine)10019818Utilisé pour l’ajustement du pH d’une solution de PFA
SaccharoseSangon Biotech (Shanghai, Chine)A502693Utilisé pour la cryoprotection du tissu cérébral
XylèneRéactif chimique Sinopharm (Shanghai, Chine)10023418Agent nettoyant pour l’histologie
anticorps et kits
Anticorps c-FosAbcam (Cambridge, Royaume-Uni)AB190289Lapin anti-souris, anticorps primaire
DAB Chromogen KitZSGB-BIO (Pékin, Chine)ZLI-9018Substrat pour le développement de la couleur HRP
Anticorps p-CREB (Ser133)Technologie de signalisation cellulaire (Danvers, MA, États-Unis)9198Lapin anti-souris, anticorps primaire
Kit de détection HRP en polymèreZSGB-BIO (Pékin, Chine)PV-9000Anticorps secondaires et système de détection pour IHC
équipement
Appareil d’anesthésieRWD Life Science (Shenzhen, Chine)R500Pour une distribution contrôlée du mélange de gaz
Processeur de tissu automatiséLeica Biosystems (Nussloch, Allemagne)ASP6025Pour la déshydratation et l’élimination automatisées
Cryostat/MicrotomeLeica Biosystems (Nussloch, Allemagne)CM1950Pour la section de tissus cérébraux congelés/encastrés
Système de microscopeOlympus (Tokyo, Japon)BX53Pour l’imagerie de lames IHC
Pompe à perfusionLonger Precision Pump Co. (Baoding, Chine)BT100-2JPompe péristaltique pour la perfusion transcardique
Vaporisateur de sévofluraneRWD Life Science (Shenzhen, Chine)R510PSPour un contrôle précis de la concentration de sévoflurane
Appareil Y-MazeMed Associates Inc. (St. Albans, VT, États-Unis)MED-VFC-S-YAvec grille électrique et lumières pour l’évitement actif
Software
Prisme GraphPadGraphPad Software (San Diego, CA, États-Unis)Édition 9Analyse statistique et visualisation des données
ImageJInstituts nationaux de la santé (Bethesda, MD, États-Unis)Édition 1.53Logiciel d’analyse d’images pour le comptage de cellules
Microsoft ExcelMicrosoft Corporation (Redmond, WA, États-Unis)Bureau 365Tableur pour la compilation des données

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