Microscopie à expansion : imagerie fluorescente haute résolution avec un microscope conventionnel

Résumé

Ici, nous présentons un protocole détaillé combinant des méthodes de cryofixation et de microscopie d’expansion (Cryo-ExM), permettant une imagerie haute résolution avec une préservation structurelle adaptée à divers échantillons biologiques. Les échantillons biologiques sont congelés, intégrés dans un polymère gonflable, dénaturés, étendus et immunomarqués, permettant une imagerie à super-résolution avec des microscopes optiques standards.

Résumé

La microscopie à expansion (ExM) est une technique innovante de microscopie à fluorescence à super-résolution qui agrandit physiquement les échantillons biologiques, permettant l’imagerie au-delà de la limite de diffraction à l’aide de systèmes conventionnels tels que les microscopes confocaux. En incorporant les échantillons dans une matrice hydrogel gonflable, l’ExM permet une expansion isotrope de l’échantillon, améliorant la résolution spatiale sans nécessiter d’équipements spécialisés de nanoscopie. Des variantes avancées, telles que la microscopie d’expansion ultrastructurée (U-ExM), préservent des détails cellulaires fins, y compris les organites et les assemblages macromoléculaires.

L’observation de structures cellulaires ou d’organites spécifiques dépend de manière significative de la méthode de fixation appliquée à l’échantillon, notamment par l’utilisation de réticulants chimiques à base d’aldéhyde et la précipitation des protéines avec du méthanol froid. Récemment, l’intégration de la cryofixation — une technique de fixation standard — avec la méthode U-ExM a permis des observations à l’échelle nanométrique d’un large éventail d’échantillons biologiques, allant de cellules de mammifères cultivées à des organismes entiers, dans leur état quasi natif. La microscopie d’expansion est un outil puissant pour étudier les structures biologiques à différentes échelles, allant des organites isolés aux tissus entiers. Combiné à la cryofixation, il offre des perspectives sans précédent sur l’architecture cellulaire et les processus dynamiques tout en minimisant les artefacts associés aux méthodes traditionnelles de fixation. Ces développements positionnent ExM comme un cadre polyvalent pour l’imagerie biologique à haute résolution et quasi native.

La présente étude présente un protocole détaillé pour la cryofixation couplé à la microscopie d’expansion d’échantillons provenant de diverses origines. Ce protocole met en lumière les étapes cruciales, notamment la fixation de l’échantillon, la formation du polymère, l’expansion, l’immunocoloration et l’imagerie, fournissant les conseils nécessaires pour mettre en œuvre cette méthode dans tout laboratoire.

Introduction

La microscopie joue un rôle crucial dans la recherche biologique, nous permettant de visualiser l’ultrastructure et l’organisation à travers les systèmes vivants à des échelles sans précédent, des organismes entiers aux molécules individuelles. Le domaine de la microscopie englobe deux systèmes distincts : la microscopie électronique (EM), hautement résoluve mais avec une capacité limitée pour le marquage spécifique, et la microscopie optique, permettant une visualisation précise et précise de la structure subcellulaire mais avec une résolution limitée en raison de la limite de diffraction de la lumière. Bien que la microscopie à fluorescence à super-résolution (SRM) ait évolué comme une méthode puissante pour l’imagerie à fluorescence à résolution sub-diffraction des cellules, visualiser les détails ultrastructurels des assemblages macromoléculaires, tels que des organismes entiers, reste^{un défi 1}. De plus, les techniques SRM, atteignant des résolutions allant de 10 à 120 nm, dépendent de microscopes avancés et d’algorithmes de reconstruction d’images et nécessitent une expertise et des microscopes spécialisés, limitant leur accessibilité à de nombreux laboratoires de biologie. Une méthode émergente de super-résolution, la microscopie d’expansion (ExM), a surmonté ces limites. Développée dans le laboratoire d’Edward S. Boyden il y a dix ans, l’ExM est une technique innovante de microscopie photonique désormais considérée comme une microscopie à super-résolution qui permet l’imagerie sans avoir besoin de microscopes^{spécialisés 2}. Plutôt que de s’appuyer sur des technologies d’imagerie sophistiquées, l’ExM consiste à intégrer des échantillons biologiques dans un polymère gonflable qui se dilate isotropement. Cette expansion physique augmente la taille de l’échantillon d’un facteur quatre ou plus, améliorant la résolution et permettant l’observation à l’aide de microscopes optiques conventionnels. Initialement développés dans les tranches cérébrales, les protocoles ExM ont évolué pour améliorer la résolution et simplifier les procédures. Cette technique a été adaptée avec succès pour divers échantillons biologiques, notamment des cellules eucaryotes, des organismes unicellulaires, des parasites, des tissus et des organismes entiers, démontrant sa polyvalence 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14^{, 15}.

Actuellement, deux grandes catégories de protocoles existent : pré-expansion ^2,16 et^{post-expansion 17,18}, qui font référence au moment de la coloration biologique de l’échantillon, soit avant, soit après la procédure d’expansion. Cet article se concentrera spécifiquement sur le protocole post-expansion, dans lequel un immunomarquage est effectué après la dénaturation et l’expansion de l’échantillon.

Dans ce protocole, les échantillons biologiques sont fixés par cryothérapie ou chimique et incubés avec des agents chimiques, permettant l’ancrage des protéines au futur polymère. Les échantillons sont ensuite intégrés dans un polymère gonflable composé d’acrylamide/bis-acrylamide (couramment utilisée dans les gels d’électrophorèse) et d’acrylate de sodium (permettant l’expansion). L’ajout d’eau déclenche l’expansion du gel, augmentant la distance entre les protéines proportionnellement à l’expansion du gel. Les protéines d’intérêt sont ensuite marquées directement à l’intérieur du gel à l’aide d’anticorps spécifiques (Figure 1).

Toutes les techniques d’imagerie mentionnées précédemment, y compris la microscopie électronique, la microscopie photonique, la microscopie à super-résolution et l’ExM, nécessitent une fixation biologique de l’échantillon. La fixation à base d’aldéhyde crée un entrelacement entre protéines, maintenant l’organisation cellulaire lors des traitements nécessaires à la microscopie photonique ou électronique. Cependant, la fixation peut aussi entraîner des artefacts et des changements morphologiques dans la cellule, qui peuvent être subtils en microscopie optique classique mais sont devenus de plus en plus évidents avec l’avancement et le développement de la SRM, poussant les scientifiques à reconsidérer les conséquences des méthodes^{de fixation 19}. Une façon de contourner les artefacts liés à la fixation est d’utiliser la microscopie en direct, qui permet la visualisation dynamique des structures cellulaires dans leur état quasi natif. Cependant, la microscopie en direct présente plusieurs inconvénients, notamment la nécessité d’expression des transgènes, qui peut potentiellement impacter la physiologie cellulaire et modifier le comportement des protéines par rapport aux homologues endogènes. De plus, la microscopie en direct offre généralement une résolution inférieure à la microscopie fixe et dispose d’options d’étiquetage limitées, car les balises fluorescentes doivent être non toxiques et stables en conditions réelles, limitant ainsi les marqueurs disponibles. Le domaine de la microscopie électronique, grâce à sa haute résolution, a considérablement contribué au développement de méthodes optimales pour fixer les structures subcellulaires ou macromoléculaires tout en préservant leur état natif. Il y a des décennies, la cryofixation a été développée par les laboratoires Dubochet, Frank et Henderson, impliquant la fixation rapide de la cellule dans de l’eau vitrée et démontrant qu’il s’agissait de la seule méthode pour préserver l’ultrastructure native^20,21. Alors que les molécules purifiées peuvent être observées directement dans la glace vitrée à l’aide de la cryomicroscopie électronique, les cellules doivent être intégrées dans la résine et sectionnées avant observation. Pour encore stabiliser les échantillons dans l’état le plus natif possible, les échantillons sont soumis à une substitution par congélation. Dans ce processus, lorsque les molécules de glace reviennent à l’état liquide, elles sont instantanément remplacées par de l’acétone, qui a un coefficient de diffusion plus élevé que l’eau. Lors de l’élimination de l’eau, les molécules d’intérêt peuvent s’agréger et s’effondrer, de manière similaire à ce qui se produit lors de la fixation chimique par réticulation. Pour limiter cette agrégation, la substitution par gel est effectuée à basse température, réduisant l’agrégation en augmentant la viscosité^{intracellulaire 22}. Cette approche contrôlée limite la formation de gros agrégats et préserve l’ultrastructure cellulaire plus proche de son état d’origine.

En 2022, des preuves croissantes que la fixation chimique introduit des artefacts, combinées aux avancées en microscopie d’expansion, ont conduit le laboratoire Guichard/Hamel à développer une méthode intégrant la cryofixation avec la microscopie d’expansion, connue sous le nom de « Cryo-ExM ». Cette approche exploite les forces des deux techniques en préservant les structures biologiques avec un minimum de distorsion. Les échantillons sont cryo-congelés par congélation haute pression ou plongée manuelle, nécessitant tous deux un équipement spécialisé couramment trouvé dans les laboratoires de microscopie électronique ou les installations de crottage.

Cet article présente un protocole étape par étape pour effectuer la cryofixation suivie d’une microscopie d’expansion et présente des résultats représentatifs de deux modèles expérimentaux : les cellules cultivées par l’humain et le parasite unicellulaire Trypanosoma brucei, l’agent causal de la maladie du sommeil. Nous mettrons l’accent sur les améliorations offertes par la cryofixation par rapport aux méthodes conventionnelles et mettrons en lumière les pièges et artefacts de fixation les plus courants associés à cette technique.

Protocole

REMARQUE : Les réactifs utilisés dans ce protocole sont listés dans le Tableau des matériaux. Ce protocole est adapté, avec de légères modifications, pour l’observation de divers processus cellulaires dans différents échantillons biologiques (y compris la levure^24,25, Toxoplasma gondii²⁶, l’espèce animale proche^{parent 27}, les algues^{vertes 28,29}, les eucaryotes^{microbiens 30}, ainsi que les échantillons^{de souris 23} et humains 23,31,32,33)). Les modifications pour adapter le protocole à ces différents échantillons ne sont pas mentionnées dans cet article, car elles peuvent être retrouvées dans les publications originales. Ici, les cellules RPE1 et Trypanosoma brucei sont utilisées comme substituts des cellules et parasites des mammifères. Ce protocole met l’accent sur les étapes de fixation et d’expansion des échantillons biologiques ; Par conséquent, les informations concernant la culture de l’échantillon ne sont pas présentées dans cet article.

1. Préparation de la solution de stock

1. Solution de polylysine
   1. Resuspendez de l’hydrobromure de poly-L ou de poly-D-lysine (Table of Materials) dans de l’eau pour obtenir une solution standard de polylysine à 1 mg/mL. Conservez cette solution d’origine à -20 °C et diluez-la dans de l’eau à 0,2 mg/mL pour revêtir les toits (Tableau 1, Tableau des matériaux).
2. Solution d’ancrage
   1. Préparer une solution fraîche d’acrylamide/formaldéhyde (sous la cagoule chimique) en mélangeant 38 μL de formaldéhyde (36,5 %-38 % ; Tableau des matériaux) et 50 μL d’acrylamide (40 %, Table of Materials) dans 912 μL de PBS pour obtenir 1 mL de solution.
3. Solution de gélification sans APS (initiateur)
   1. Préparez une solution de mélange en ajoutant 500 μL d’acrylate de sodium à 38 % (19 % final), 250 μL d’acrylamide à 40 % (10 % final), 50 μL de bis-acrylamide à 2 % (0,1 % final), 50 μL de TEMED (0,5 % final) et 100 μL de 10 PBS (1 % final). Aliquotes en volume adaptées à 2 gels maximum (80-90 μL) et conservées à -20 °C pendant au moins 12 heures avant utilisation (voir Tableau 1 pour la conservation à long terme).
      REMARQUE : Veuillez noter que le volume indiqué pour préparer le mélange de solution gélifiante est calculé pour obtenir un volume final de 1 mL, mais le volume réel de la solution est de 950 μL, car l’APS, qui représente 1/20 du volume total chacun, est ajouté de manière improvisée. Le temps de stockage initial de la solution^{de gélification 17} a été prolongé après avoir observé qu’elle pouvait être conservée jusqu’à 1 mois à -20 °C sans compromettre la solidité du gel ni l’efficacité de l’expansion.
4. TEMED et APS
   1. APS 10 % en va-et-vient : Diluer la poudre d’APS dans de l’eau, aliquote et conserver à -20 °C.
   2. TEMED 10 % v/v : diluer TEMED dans l’eau, aliquote et conserver à -20 °C.
5. Acrylate de sodium (SA) 38 %
   1. Préparez 38 % d’SA à partir de SA purifié (AK scientific ou Sigma ; Tableau des matériaux)
      1. Résuspendez 38 g d’acrylate de sodium dans 100 mL d’eau sous un brassage constant (important). Incorporez progressivement l’AC pour éviter les granulats et remuez la nuit à 4 °C pour assurer une resuspension complète. Assurez-vous que la solution soit translucide, incolore ou légèrement jaune. Aliquot et conserver à 4 °C jusqu’à 1 an.
   2. Préparez 38 % d’acide acide acrylique (Sigma ; Tableau des matériaux)
      1. Préparez 90 mL d’acrylate de sodium à 38 % en neutralisant l’acide acrylique avec du NaOH sous une hotte chimique.
      2. Mélangez 29 mL d’eau avec 25 mL d’acide acrylique pendant que vous remuez.
         REMARQUE : À partir de cette étape, la réaction doit être réalisée sur la glace avec un contrôle constant du pH et de la température, car la réaction est exothermique.
      3. Ajoutez 10 N de NaOH goutte par goutte en utilisant une pipette Pasteur.
         REMARQUE : Assurez-vous que la température ne dépasse pas 25 °C (si c’est le cas, arrêtez d’ajouter du NaOH et attendez que la température se calme).
      4. Continuez la neutralisation jusqu’à ce que le pH atteigne 7-8 et agitez pendant 1 heure sur la glace.
         REMARQUE : Si le pH dépasse soudainement 10, ajoutez de l’acide acrylique jusqu’à ce que le pH tombe à 7-8.
      5. Conservez la solution dans un contenant fermé toute la nuit. Si la solution a précipité, centrifugez à 1 000 × g pendant 10 minutes. Collectez le surnageant, l’aliquote, et conservez-les à -20 °C.
6. Solution de dénaturation
   1. TrisBase 1 M : Diluer 121,14 g de TrisBase dans 1 L d’eau, ajuster le pH avec HCl à 9, et conserver à la température de la réinsertion.
   2. Tampon de dénaturation : Mélangez 200 mM de Dodécyle Sulfate de Sodiu (SDS), 200 mM de NaCl, 50 mM de TrisBase dans l’eau. Pour une solution de 200 mL, ajoutez 10 mL de Tris-BASE 1 M (pH 9) dans 124,9 mL de_{ddH 2}O, ajoutez 57,1 mL de SDS (20 %/700 mM) et 8 mL de NaCl (5 M) en remuant. À conserver à RT (Tableau 1).

2. Procédure de cryofixation et d’expansion

1. Préparation de l’échantillon et cryofixation
   REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour les échantillons cultivés/chargés sur des couvercles de 12 mm. Merci de réviser le volume de la solution pour d’autres supports.
   1. Préparation de l’échantillon
      1. Faire croître l’échantillon dans une condition adaptée à l’échantillon biologique, soit directement sur des couvre-manteaux de 12 mm (cellules adhérentes de mammifères), soit en suspension (T. brucei).
      2. Chargez l’échantillon sur la gaine de couverture (T. brucei) pré-enduit de poly-lysine comme suit : en bref, incubez des gaines de 12 mm en poly-lysine (0,2 mg/mL) pendant 1 heure à 37 °C, puis lavez rapidement et séchez à l’air.
      3. Centrifugez les parasites à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante (RT). Resuspendre dans le PBS complété avec 10 % de milieu de culture et charger sur les couches de couverture 5 à 10 minutes avant la cryofixation.
   2. Installation en plongée (Figure 2A-C)
      ATTENTION : Travailler sous une capuche chimique avec des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation de l’acétone. Utilisez une blouse de laboratoire et des lunettes de protection chaque fois que vous manipulez de l’azote liquide et de l’éthane liquide.
      1. Sous une hotte chimique, remplir 5 mL de tubes (1 cache-tube/cache-tube) avec 1 mL d’acétone extra-sèche à l’aide d’une seringue et d’une aiguille pour éviter la contamination de l’air.
         REMARQUE : Pour une meilleure conservation biologique des membranes, l’ajout de paraformaldéhyde (PFA)/glutaraldéhyde (GA) (0,1/0,02 %) est nécessaire. Adaptez le tube selon le diamètre de la gaine de couverture (les gaines de > 12 mm ne rentrent pas dans des tubes de 5 mL).
      2. Congelez les tubes dans de l’azote liquide à l’aide d’un support en plastique ou en métal résistant au froid pour les maintenir debout.
      3. Remplissez la moitié d’une boîte en polystyrène (30 cm x 30 cm / parois épaisses) avec de la glace sèche.
      4. Remplissez le dewar de type Vitrobot avec de l’azote liquide jusqu’à ce qu’il cesse d’évaporer, et attendez 10 à 15 minutes pour que la température se stabilise. L’utilisation de l’araignée est nécessaire pour faciliter le refroidissement du système (Figure 2B, astérisque). Renouvelez si nécessaire.
      5. Retirez l’araignée et remplissez la chambre métallique de plongée avec de l’éthane liquide.
      6. Attendez 10 minutes que l’éthane soit équilibré.
         REMARQUE : Remplissez le système de plongée avec de l’éthane liquide pendant l’expérience si nécessaire (n’utilisez plus l’araignée à ce stade). La transition de l’éthane gazeux à l’éthane liquide est difficile. L’utilisation d’une pression appropriée est cruciale pour la formation de l’éthane liquide. La haute pression empêchera la formation de liquide par débordement constant de gaz dans la chambre métallique, tandis que la basse pression formera de l’éthane solide dans la chambre métallique et le tube de remplissage. Éviter la formation de glace est essentiel pour l’expérience. Maintenir la pointe de remplissage à l’interface liquide/air aide à prévenir la formation d’éthane solide.
   3. Plongeon (Figure 2A-C)
      ATTENTION : Utilisez une blouse de laboratoire et des lunettes de protection chaque fois que vous manipulez de l’azote liquide et de l’éthane liquide.
      1. Prends une housse de 12 mm avec une pince à épiler.
      2. Absorbez tout excès de médium avec du papier de soie.
      3. Maintenez la housse à mi-chemin avec la pince à épiler, à l’aide d’un anneau de serrage adapté à la ventouse cryogénique.
      4. Placez la pince tenant la housse dans le support du piston cryogénique. Tapez tout excédent restant de médium avec du papier Whatman.
      5. Activez le cryo-plunger pour plonger la gaine de couverture dans la solution d’éthane de la chambre métallique.
      6. Transférez rapidement la gaine de couverture dans le tube contenant de l’acétone congelée (1 cache-cache/tube).
         REMARQUE : N’utilisez pas la même pince à épiler pour collecter les échantillons et pour plonger afin d’éviter toute contamination avec le milieu de culture. Soyez particulièrement prudent si vous utilisez des gaines de couverture > 12 mm (15 ou 18 mm de diamètre s’adaptent au porte-avions mais peuvent être plus difficiles à plonger). Lors de cette étape, il est possible d’immerger la couche de couverture dans de l’azote liquide après plongée pour faciliter le transfert dans l’Eppendorf tout en maintenant l’échantillon congelé. Comme l’acétone gèle à -96 °C, il est nécessaire de placer les cache-couvercles sur de l’acétone congelée pour la substitution par congélation.
   4. Substitution par congélation et réhydratation
      ATTENTION : Travailler sous le capot lors de la manipulation des échantillons lors de la substitution par congélation. La montée de la température crée une pression à l’intérieur du tube, ce qui peut déclencher une explosion du tube.
      1. Incubez les tubes dans de la glace sèche avec un angle d’inclinaison (environ 45°).
      2. Agitez toute la nuit sur un shaker orbital. Placez la boîte fermée sur un shaker à 4 °C ou RT pour laisser la température passer de -180 °C à -80 °C.
      3. Retirez la majorité de la glace carbonique de la boîte (gardez-en juste quelques-unes au fond), relâchez la pression dans les tubes en les ouvrant et fermant rapidement, puis continuez à agiter pendant 45 minutes sur le shaker orbital pour continuer à faire monter la température de -80 °C à -20 °C.
      4. Transférez les caches sur une plaque à 12 puits (ou tout contenant pratique) contenant une solution d’éthanol pur pré-refroidi (100 %). Incubez pendant 5 minutes et procédez à une réhydratation progressive comme suit : EtOH 100 % (5 min) - EtOH 95 % (3 min) - EtOH 95 % (3 min) - EtOH 70 % (3 min) - EtOH 50 % (3 min) - EtOH 25 % (3 min) - H₂O 100 %.
      5. Transférez les couvertures dans PBS et orientez-les au microscope (en grattant la surface avec une pointe) pour qu’elles soient toutes orientées vers le haut.
         REMARQUE : EtOH 100 % et 95 % sont stockés à -20 °C, EtOH 70 % et EtOH 50 % à 4 °C, et EtOH 25 % et ddH₂O à RT pour continuer à augmenter la température jusqu’à RT. Pour le marquage membranaire, l’ajout de PFA/GA (0,1 %/0,02 %) est nécessaire dans l’acétone et les solutions de réhydratation, sauf pour le_ddH2O.
2. Expansion
   1. Ancrage des protéines
      1. Préparez une solution fraîche de formaldéhyde à 1,4 % / 2 % d’acrylamide (FA/AA) dans PBS 1x.
      2. Placez les cache-toits dans une plaque de puits 4/12 remplie de 0,5/1 mL d’AA/FA.
      3. Incubez pendant 3 à 5 heures à 37 °C sans agitation.
         REMARQUE : Le formaldéhyde relie les groupes amines libres des protéines à l’acrylamide. L’excès d’acrylamide aide à limiter la réticulation des protéines normalement induite par le formaldéhyde et ancre les protéines au futur polymère d’expansion. Une élongation par étapes d’ancrage protéique jusqu’à la nuit peut être nécessaire selon l’échantillon biologique. Dans tous les cas, une incubation plus longue n’impactera aucune des étapes suivantes. Remplissez les puits libres d’eau ou placez-les dans une chambre humide pour éviter l’évaporation.
   2. Gélification
      1. Dégel, APS (10 %) et solution de gélification (acrylate de sodium 19 %, acrylamide 10 %, bis-acrylamide 0,1 %, TEMED 0,5 % dilué dans 10 PBS) sur de la glace 10 minutes avant la gélification.
      2. Préparez une chambre humide avec une fine couche de papier humide et de parafilm, puis conservez-la à 4 °C pendant 10 minutes.
      3. Placez la chambre humide sur de la glace.
      4. Retirez les engourdies de la solution d’ancrage protéique et retirez l’excès de solution avec un papier de soie (deux fois d’affilée).
      5. Ajoutez de l’APS (concentration finale 0,5 %) dans la solution de gélatine, utilisez un vortex pendant 2 à 3 secondes, puis chargez 2 gouttes de 35 μL sur le parafilm de la chambre humide.
      6. Couvrez chaque goutte avec la couche de revêtement, les cellules faisant face à la solution gélifiante.
      7. Incubez sur la glace pendant 5 minutes pour permettre la pénétration du gel.
      8. Incubez à 37 °C pendant 30 à 60 minutes.
   3. Dénaturation
      1. Perforez le gel avec un outil de biopsie (0,4 cm de diamètre, Figure 2D) et agitez pendant 10/15 minutes dans une plaque à 6 puits remplie de 1 mL de tampon de dénaturation jusqu’à ce que les gels se détachent des caches de revêtement.
      2. Transférez le gel dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL rempli d’un tampon de dénaturation frais.
      3. Couver pendant 1 h 30 à 95 °C.
      4. Transférez le gel dans le ddH₂O pendant 10 minutes, puis répétez 3 fois pour bien laver le tampon de dénaturation.
      5. Mesurez le gel avec du papier millimétrique ou un étrier pour évaluer le facteur d’expansion du gel.
      6. Transférez le gel dans PBS pour l’immunocoloration.
      7. Sinon, conservez les gels dans PBS-azide 0,02 % à 4 °C pendant une courte période (Tableau 1) ou à -20°C pour un stockage plus long (Tableau 1). Pour un stockage prolongé, les gels doivent être incubés dans plusieurs bains d’eau : solution de glycérol à 50 % pendant 2-3 heures sous agitation et placés à -20 °C dans un volume suffisant de solution, qui doit être adapté à la taille du gel.
         REMARQUE : Le gel peut être conservé entier si préférable (Figure 2D, E) (étape 2.2.3.1). Jusqu’à 5 poinçons (équivalent à un gel entier) peuvent être rassemblés dans un seul tube (étape 2.2.3.2). La température et le temps de dénaturation doivent être respectés (étape 2.2.3.3). Une chaleur élevée peut déclencher l’ouverture du tube, entraînant l’évaporation du tampon de dénaturation et/ou l’expulsion du gel. Assurez-vous d’utiliser des tubes à verrouillage sécurisé ou de les couvrir. Le lavage du gel après la dénaturation doit être effectué dans de l’eau distillée car le PBS déclenchera la précipitation SDS, affectant l’efficacité des lavages. Cette étape déclenchera une légère expansion du gel qui n’a aucune conséquence sur les étapes suivantes du protocole (étape 2.2.3.4). Le glycérol peut être dilué dans du PBS pour économiser de la place en cas de gros gels. Pour le punch de 0,4 mm, les gels sont idéalement stockés dans une plaque à 12 puits remplie de 3 mL d’eau : glycérol.

3. Immunocoloration et expansion finale

1. Changez le bain de PBS pour une incubation supplémentaire de 15 minutes.
2. Coupez le gel entier en 4 morceaux égaux.
3. Transférez les morceaux/punches de gel dans un support adapté (Figure 2D, E) et incubez avec des anticorps primaires dilués dans PBS-BSA à 2 % pendant 3 heures à toute la nuit avec agitation (voir Tableau 2 et Tableau 3 pour les conditions détaillées).
4. Gel lavage 3 fois avec PBS+Tween 0,1 % pendant 10 minutes RT avec agitation.
5. Incubez le gel en anticorps secondaires et Hoechst dans PBS-BSA 2 % pendant 3 h à toute la nuit avec agitation (voir les Tableaux 2 et 3 pour les conditions détaillées).
6. Gel lavage 3 fois avec PBS+Tween 0,1 % pendant 10 minutes RT avec agitation.
7. Optionnel : Effectuez un marquage panique de l’ensemble du protéome en incubant un gel avec un ester NHS (voir Tableau 2 pour plus de détails) en PBS pendant 1h30 à RT sous agitation, puis laver 3 fois dans PBS+Tween 0,1 % pendant 10 minutes.
8. Transférez le gel sur un support adapté et procédez à l’expansion du gel par incubation dans de l’eau distillée (ddH₂O).
   REMARQUE : La concentration et le type de détergent (Tween, Triton-X100, Saponine) utilisés pour les douches anticorps peuvent être adaptés à des échantillons biologiques. Remplacer l’eau plusieurs fois est crucial pour éliminer les traces de sel, qui empêchent la dilatation complète.

4. Montage et imagerie

1. Le recouvrement de la couche de polylysine (voir section 1.1) en recouvrant les cache-couches d’environ 200 μL de polylysine, incube 1 h à la RT, puis lave 3 fois dans ddH_2Opour éliminer l’excès de polylysine. Laissez sécher les bâtons et conservez-les à 4°C jusqu’à utilisation.
2. Placez les gels expansés sur des cache-tobe non recouvertes dans la chambre d’imagerie pour vérifier l’orientation des échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence.
3. Une fois orienté, séchez les gels sur un papier sans peluches pour éliminer l’excès d’eau et montez sur des gaines de couverture recouvertes de polylysine (voir étape 1.1 pour le protocole).
4. Observez les échantillons avec un microscope inversé.

Résultats

Cet article met en lumière les résultats de la combinaison de la cryofixation avec de la microscopie d’expansion sur deux types d’échantillons différents : les cellules de mammifères cultivées et les parasites de T. brucei . Les deux échantillons étaient soit cryofixés, soit chimiquement fixés à 4 % de PFA avant expansion et immunocoloration. Notez que d’autres fixations chimiques pourraient être plus adaptées à des organites spécifiques (comme le méthanol ou le glutaraldéhyde) et que seule la PFA, une fixation chimique courante, a été choisie pour la comparaison avec la cryofixation pour simplifier.

Les RPE1 humaines (cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes) ont été colorées pour αβ-tubuline, ATP5a et Hoechst afin de visualiser respectivement les microtubules, les mitochondries et les noyaux. De plus, les gels ont été incubés avec du négomme fluorescent NHS avant l’expansion, un colorant réagissant avec les groupes amine libres et colorant ainsi l’ensemble du protéome cellulaire. Nous avons pu observer plusieurs avantages de la cryofixation par rapport à la fixation chimique, comme déjà^{démontré 23}. La caractéristique la plus frappante était que la cryofixation préservait parfaitement le réseau mitochondrial, visible à la fois via le NHS-ester et des anticorps spécifiques contre la sous-unité alpha de l’ATP synthase (ATP5a) (Figure 3A,B). De plus, comme l’ATP5a est localisé dans la membrane mitochondriale interne, nous pourrions résoudre les cristes mitochondriales par cryofixation (Figure 3B). Au contraire, la fixation du PFA ne permettait pas de préserver le réseau mitochondrial et, par conséquent, les cristes mitochondriales n’étaient pas visibles dans cet état (Figure 3C). Nous avons également coloré les microtubules dans les deux conditions et démontré que la cryofixation préservait de meilleurs microtubules dynamiques tels que les microtubules cytoplasmiques ou astraux (Figure 3B-E). Cependant, des microtubules stables, tels que dans les centrioles et les cilles, organites non membraneux composés de triplets/doublets de microtubules à 9 parties, étaient également conservés, voire meilleurs, dans les cellules fixées au PFA comparées aux cellules cryofixées (Figure 3B', C'). Il est important de noter que la cryofixation, en tant que préservation de l’intégralité des protéines cellulaires, pourrait être moins applicable à des structures très denses telles que les centrioles ou les cils. Cette observation a également été faite sur des structures rigides telles que les pores nucléaires où la fixation chimique déclenche un lavage des protéines cytoplasmiques, permettant une meilleure observation des structures des pores^{nucléaires 23,32}. Enfin, nous avons pu démontrer que la cryofixation contourne également l’effet de réticulation de la fixation chimique, qui impacte négativement la capacité d’expansion comme montré sur les fuseaux mitotiques, qui étaient presque deux fois plus étendus en condition cryofixée comparé à la PFA (Figure 3D,E).

Les cellules de Trypanosoma brucei ont été colorées pour TDH³⁴ (Figure 4A-D) afin de visualiser la mitochondrie unique et pour^{BiP 35} (Figure 4E,F) afin de mettre en évidence le réticulum endoplasmique. De plus, les gels étaient colorés avec du néo-ester fluorescent NHS. Comme observé dans les cellules humaines, la cryofixation combinée à l’expansion préserve mieux l’architecture cellulaire globale (Figure 4B,E), en particulier ces deux structures membraneuses, comparé à la fixation de la PFA (Figure 4C,D,F). Le cytosquelette microtubulaire de T. brucei est plus rigide et stable que celui des cellules humaines ; par conséquent, aucune différence significative n’a été observée entre la PFA et la cryofixation. De plus, la limite de résolution de la technique U-ExM nous empêche de distinguer les microtubules individuels (non montrés).

Dans l’ensemble, la cryofixation répond aux limites de la fixation chimique classique, telles que la préservation des organites membraneux (mitochondries, réticule endoplasmique) et des éléments dynamiques du cytosquelette (microtubules cytoplasmiques ou astraux). De plus, comme la cryofixation ne crée aucun lien croisé entre les protéines, elle préserve pleinement la capacité d’expansion, notamment sur des structures rigides et denses.

Contrôler la qualité de la cryofixation et de l’expansion est essentiel pour préserver l’ultrastructure cellulaire des échantillons biologiques. Plusieurs erreurs peuvent entraîner une mauvaise fixation et créer des artefacts dans les échantillons biologiques. Ici, nous mettons en lumière les inconvénients et conséquences les plus courants de la cryofixation et des conséquences d’une mauvaise fixation. L’artefact le plus évident créé par la cryofixation est l’apparition de fissures à l’intérieur de l’échantillon biologique (Figure 5A), également courantes en cryomicroscopie électronique. Bien que ces fissures ne modifient pas l’ultra-structure intrinsèque des organites, comme le montre la Figure 5A (en recadré) pour les mitochondries et les microtubules, elles peuvent entraîner une mauvaise interprétation de la pertinence biologique de ces fissures et doivent être considérées avec prudence. Il n’y a pas de corrélation spécifique entre les problèmes de manipulation et l’apparence/l’abondance de ces fissures.

Une caractéristique spécifique indiquant une mauvaise fixation est l’apparition de « structures en forme de bulles » dans le cytoplasme cellulaire, indiquant la présence de cristaux de glace. Ces structures sont particulièrement visibles avec la coloration NHS-ester (Figure 5B). Ils s’accompagnent généralement d’une conservation limitée des éléments du cytosquelette, tels que les microtubules ondulés (Figure 5B), et d’une très mauvaise conservation des organites membraneux (mitochondries dans la Figure 5B). Ces caractéristiques présentent d’importants problèmes de fixation, qui peuvent être causés par (i) un volume et/ou une température d’éthane inappropriés (étapes 2.2.4-2.2.6 du protocole), (ii) un échauffement non progressif de l’échantillon biologique (étapes 2.3 et 2.4 du protocole), et (iii) la présence d’impuretés dans la solution de substitution par gel (étape 2.2.1 du protocole). Des images représentatives de solutions d’acrylate de sodium mettant en valeur l’aspect attendu d’un acrylate de sodium à 38 % utilisable (incolore et translucide [1]) ou légèrement jaune et translucide [2]), ou non utilisable pour l’expansion (jaune/orange et trouble [3]) sont montrées à la Figure 5C.

Figure 1 Flux de travail Cryo-ExM. (A) Les cellules vivantes (cellules humaines ou T. brucei) sont cryofixées en plongeant dans de l’éthane liquide à -180 °C et incubées dans de l’acétone congelée sur de la glace sèche. La substitution par gel s’effectue par une montée constante et lente de la température de -180 °C à -80 °C par incubation sur de la glace sèche, ce qui déclenche la liquéfaction de l’acétone (-96 °C), puis de -80 °C à -20 °C par incubation sans glace sèche. La réhydratation est effectuée par des bains successifs d’éthanol mélangés à une concentration croissante d’eau distillée, accompagnés d’une augmentation constante de la température de -20 °C à température ambiante. (B) Les échantillons réhydratés sont ensuite poursuivis pour l’expansion comme suit : Les échantillons sont incubés dans un mélange d’acrylamide : formaldéhyde (AA/FA) à 37 °C, permettant l’ancrage des protéines au polymère gonflable composé d’acrylamide, de bis-acrylamide et d’acrylate de sodium (AA/BIS/SA), ce dernier conférant la propriété d’expansion au gel. Les échantillons sont incubés dans NaCl/SDS à 95 °C pour effectuer une déstabilisation des interactions protéine-protéine et une dénaturation douce. Cette étape est essentielle pour l’expansion isotrope. Les échantillons sont ensuite immunocolorés à l’aide d’anticorps primaires et secondaires classiques, puis enfin développés dans de l’eau distillée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2. Cryo-plongée et installation d’expansion. (A) Cryo-plunger en position armée (panneau supérieur) et en position baissée (panneau inférieur). La flèche indique le bouton POUSSER pour activer la plongée. (B) Installation de cryo-plongée prête à plongée montrant le niveau d’azote liquide (N₂) adapté à la cryofixation, indiqué par la hauteur de la mousse entourant le dewar (pointe de flèche rouge). L’araignée amovible est indiquée par des astérisques. (C) Illustration des étapes clés du cryo-plongeage depuis la tenue de la gaine de couverture (en haut à gauche), la position des couches de couverture dans l’éthane liquide (en bas à gauche), et du tube de collecte pour la substitution par gel (à droite). (D) Illustration de la méthode de « punching gel » pour l’immunocoloration sur des échantillons humains. Le gel polymérisé sur les gaines (1) est découpé à l’aide d’un punch de biopsie spécifique (P), formant un gel punch de 0,4 cm de diamètre (2), qui peut être coloré dans une plaque de silicone (panneaux droits) pour réduire la quantité d’anticorps. (E) Illustration de la méthode de « découpe en gel » pour l’immunocoloration sur des échantillons humains et de T. brucei . Les gels polymérisés et dénaturés (1) sont découpés en 4 morceaux égaux (2), permettant leur incubation dans une plaque à 12 puits avec des anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3. Comparaison de la cryofixation et de la fixation PFA dans les cellules humaines. (A) Image du disque tournant des cellules RPE1 cryofixées et étendues colorées pour αβ-tubulines (cyan), sous-unité 5a (ATP5a, jaune) et NHS-ester (rouge/gris) montrant l’excellente préservation des organites membranaires et des éléments du cytosquelette, y compris les centrioles et les cils (pointe de flèche). Barre d’échelle : 10 μm. (B, C) Image du disque tournant de cellules RPE1 cryofixées (B) et fixées PFA (C) colorées pour αβ-tubulines (cyan), ATP5a mitochondrial (jaune) et Hoechst (magenta) en mettant l’accent sur le cilium primaire (flèches, B', C') et les mitochondries (B », C »). Si la cryofixation et la fixation du PFA préservent également les centrioles et les cils primaires, la cryofixation dépasse largement la PFA concernant la préservation de la structure mitochondriale (B », les pointes rouges du C indiquent des cristes mitochondriales visibles uniquement dans des conditions cryofixées). Barres d’échelle : respectivement 1, 1 et 2,5 μm. (D,E) Image du disque tournant de cellules RPE1 cryofixées (D) et fixées en PFA (E) colorées pour αβ-tubulines jaune/gris), ATP5a mitochondrial (magenta) et Hoechst (bleu BOP) montrent que la cryofixation permet une meilleure expansion du fuseau mitotique (pointes de flèches rouges) et préserve de meilleurs microtubules du fuseau mitotique (flèches rouges). Mesures de la longueur de la fusée mitotique : respectivement 12 μm et 7 μm pour la cryofixation et la fixation PFA. Barres d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4. Comparaison de la cryofixation et de la fixation PFA chez Trypanosoma brucei. (A, B) Images confocales de cellules procycliques T . brucei cryofixées et élargies, colorées pour la thréonine mitochondriale déshydrogénase (TDH, jaune) et l’ester NHS (rouge/gris), montrant l’excellente préservation de la mitochondrie unique et de l’architecture générale de la cellule. Barres d’échelle : 5 μm. (C, D) Image confocale de cellules procycliques T . brucei fixées et élargies en PFA, colorées pour TDH (jaune) et NHS-ester (rouge/gris). En comparant la préservation de la structure mitochondriale et le réseau, la cryofixation surpasse la fixation PFA. Barres d’échelle : 5 μm. (E, F) Images confocales de cellules procycliques cryo-fixées (E) et PFA-fixées (F) ainsi que de cellules procycliques élargies de T. brucei colorées pour les marqueurs du réticulum endoplasmique BiP et NHS-ester (gris), montrant que la cryofixation permet une meilleure expansion et conservation du réticulum endoplasmique. Barres d’échelle : 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5. Problèmes de cryofixation. (A,B) Images de disques tournants de RPE1 cryofixée et étendue colorées pour αβ-tubulines (cyan), sous-unité 5a (ATP5a, jaune) et NHS-ester (rouge) montrant les effets classiques de la cryofixation : fissures (A, flèches) et bulles (B, flèche). Bien que les fissures n’affectent pas les ultrastructures d’organites (A), la présence de bulles dans le cytoplasme (B) indique une mauvaise fixation et modifie significativement la préservation des organites subcellulaires (mitochondries et microtubules, inserts). Barres d’échelle : 5 μm et 2 μm (encastrés). (C) Image montrant différentes solutions d’acrylate de sodium mettant en évidence l’aspect attendu d’un acrylate de sodium à 38 % utilisable (incolore et translucide (1) ou légèrement jaune et translucide (2), ou non utilisable pour l’expansion (jaune/orange et trouble (3)). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Conditions de stockage de la solution Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Liste des anticorps Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Conditions d’immunocoloration Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé qui intègre la cryofixation à la microscopie d’expansion (Cryo-ExM), offrant une approche robuste pour visualiser les compartiments subcellulaires tout en évitant des artefacts couramment associés à la fixation chimique, tels que la distorsion structurelle et la perte d’antigènes. En préservant l’architecture cellulaire dans un état proche de la nativité, Cryo-ExM élimine le besoin d’une optimisation de fixation étendue, permettant une localisation des protéines plus précise.

Bien que le protocole soit généralement simple, plusieurs étapes critiques nécessitent une attention particulière pour garantir des résultats réussis. L’étape de cryo-plongée est particulièrement sensible, car elle exige à la fois des matériaux spécifiques (voir Tableau des matériaux) et un certain niveau de dextérité, notamment lors de la manipulation du remplissage liquide à l’éthane, qui représente un piège potentiel. Une connaissance préalable des techniques de cryofixation est avantageuse ; nous recommandons de consulter un spécialiste de cryo-EM ou un responsable d’installation de microscopie électronique lors de l’adoption initiale de cette méthode. Pendant la phase d’expansion, il est essentiel de respecter strictement les conditions de dénaturation, car les écarts peuvent compromettre à la fois la préservation de l’échantillon et l’efficacité de l’expansion. Enfin, maintenir des conditions de stockage appropriées pour tous les réactifs (voir Tableau 1) est crucial pour garantir la reproductibilité et une qualité d’imagerie cohérente dans le temps.

Cet article met en lumière plusieurs avantages clés du protocole Cryo-ExM. Notamment, la cryofixation minimise la perte de protéines solubles, une limitation courante des méthodes de fixation conventionnelles, et préserve mieux l’intégrité des membranes, améliorant ainsi la fidélité de l’imagerie cellulaire. Une force majeure de cette technique réside dans sa compatibilité avec les microscopes grand champ et confocaux standards. Contrairement à de nombreuses autres méthodes de super-résolution qui nécessitent un équipement spécialisé et souvent coûteux, l’ExM peut être réalisé à l’aide de microscopes à fluorescence conventionnels. Un autre avantage significatif d’ExM est sa polyvalence. La technique a été appliquée avec succès à un large éventail d’échantillons biologiques – des cellules individuelles aux tissus complexes – démontrant ainsi sa large applicabilité dans divers domaines de recherche. Cet article met particulièrement l’accent sur la compatibilité de ce protocole avec deux systèmes modèles très différents : T. brucei et cellules humaines, mais il faut noter qu’un échantillon plus grand ou plus complexe nécessiterait une fixation par congélation à haute pression, car la plongée manuelle n’est pas suffisante pour préserver l’ensemble^{de l’échantillon 24,25,30}. La microscopie d’expansion a révolutionné la capacité à visualiser des structures cellulaires à l’échelle nanométrique qui étaient auparavant difficiles voire impossibles à résoudre, permettant des avancées dans des domaines tels que la biologie cellulaire, la biologie du développement et^{les neurosciences 36}. En particulier, la méthode a été transformatrice en parasitologie, un domaine où la microscopie optique conventionnelle échoue souvent. Pour de nombreux parasites, la microscopie d’expansion ultrastructurale (U-ExM) s’est avérée un véritable tournant, permettant l’imagerie haute résolution d’organites complexes tels que l’apicoplaste, le conoïde et les éléments du cytosquelet, avec une clarté sans précédent ^6,37,38. Ces avancées démontrent la puissance de l’U-ExM pour révéler des détails structurels auparavant inaccessibles, ouvrant de nouvelles voies de découverte en biologie cellulaire, neurosciences et biologie parasitaire, et facilitant la recherche de cibles thérapeutiques potentielles. De plus, ExM reste compatible avec les anticorps immunofluorescences couramment utilisés, ce qui facilite son intégration dans les flux de travail existants. Dans la plupart des cas, les anticorps couramment utilisés pour la microscopie à fluorescence ou le western blotting fonctionnent efficacement sur des échantillons étendus, éliminant ainsi le besoin de réactifs spécialisés. Cette accessibilité fait de Cryo-ExM une option attrayante pour de nombreux laboratoires de recherche biologique, offrant une imagerie haute résolution sans le coût ni la complexité habituellement associés aux systèmes d’imagerie avancés.

Malgré ses avantages, ExM présente certaines limites. Un inconvénient majeur est la consommation importante d’anticorps, qui peut être coûteuse ou problématique, surtout pour les anticorps maison disponibles en quantités limitées. Voici pourquoi nous proposons cette stratégie protocolaire pour réduire le volume d’anticorps utilisés pour l’immunocoloration (Figure 2D,E). Le processus d’expansion augmente également l’épaisseur de l’échantillon, ce qui peut affecter la capacité à visualiser des structures plus profondes en raison des limites de distance de travail des objectifs de microscope standards. Cette limitation peut être particulièrement difficile lors de l’étude d’échantillons plus grands et plus épais, où les régions plus profondes ne peuvent pas être efficacement imagées avec des microscopes conventionnels. De plus, l’expansion tissulaire peut parfois introduire des distorsions mécaniques, nécessitant des étapes minutieuses de validation et de correction pour garantir des représentations spatiales précises. Enfin, l’ExM classique dépend strictement de la fixation de l’échantillon, qui peut varier selon les échantillons biologiques ou la structure subcellulaire à observer. Bien que les centrioles et les cils soient suffisamment stables pour être dilatés sans préfixation, les organites cellulaires nécessitent différents types de fixation chimique (PFA, méthanol, glutaraldéhyde), ce qui peut créer des artefacts et empêcher l’observation de plusieurs structures cellulaires ensemble. Enfin, puisque l’ExM est compatible avec diverses modalités d’imagerie à super-résolution telles que la microscopie à illumination structurée (SIM)³⁹, la microscopie à éplétion par émission stimulée (STED⁾⁴⁰, la microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)⁴¹ et, plus récemment, la microscopie à feuilles^{lumineuses 42}, l’approche décrite dans cette étude offre un outil polyvalent pour étudier les structures cellulaires avec une grande précision. Une étude récente a combiné la cryofixation avec la microscopie d’expansion^{itérative 32}, repoussant encore les limites de la résolution tout en préservant autant que possible l’état naturel de la cellule grâce à la cryofixation.

En permettant à ces techniques d’imagerie avancées de capturer les cellules à leur état natif, Cryo-ExM ouvre la voie à de futures études sur des processus cellulaires complexes avec une clarté sans précédent. Cette approche ouvre également de nouvelles possibilités pour la microscopie lumineuse et électronique corrélative (CLEM), renforçant encore son potentiel pour l’imagerie multimodale.

En conclusion, l’ExM représente un outil puissant pour l’imagerie à super-résolution, avec une large applicabilité à divers échantillons biologiques. Sa compatibilité avec les microscopes standards, sa polyvalence dans les types d’échantillons et sa mise en œuvre relativement simple en font un choix attrayant pour de nombreux laboratoires. Avec les progrès continus de la technique, nous attendons de nouvelles améliorations en termes de résolution, d’utilisation des anticorps et de manipulation des échantillons, qui renforceront ses capacités et la rendront encore plus accessible pour un large éventail d’applications biologiques. Cryo-ExM, en particulier, représente une avancée prometteuse, offrant un moyen d’étudier les structures cellulaires avec un niveau de détail exceptionnel tout en préservant leur intégrité naturelle, repoussant finalement les limites de la microscopie moderne.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Porte-tube métallique de 5 ml	Dominique Dutscher	QB-E5	Étape de substitution par gel
Cryo-plunger manuel 620	RHOST	https://rhost-em.com/	Étape de cryofixation
Acétone 99,8 % AcroSeal	Acros Organics	chat. n° 67-64-1  ;	Étape de substitution par gel
Acrylamyde 40 % (AA)	Sigma-Aldrich	A4058	Procédure d’expansion   ; (ancrage)
Acide acrylique & nbsp ;	Sigma-Aldrich	8.00181  ;	Procédure d’expansion (polymère)
Persulfate d’ammonium (APS)	Thermo Fisher	17874	Procédure d’expansion (polymère)
Poinçon de biopsie	Dominique Dutscher	PUK-40	Nécessaire pour couper le gel avant la dénaturation   ;
BSA	Sigma-Aldrich	P1379	Immunocoloration & nbsp ;
Chambre cellulaire Attofluor	Invitrogen	A7816	Chambre d’imagerie adaptée aux gaines de couverture 24 mm pour l’imagerie
Chambre cellulaire	Service d’Imagerie de la Vie	10900	Chambre d’imagerie adaptée aux gaines de couverture 18 mm pour l’imagerie
Enveloppes 12 mm & nbsp ;	Dominique Dutscher	100040	Croissance des cellules / attachement de T. brucei
Enveloppes 24 mm   ;	Dominique Dutscher	900547	Imagerie & nbsp ;
Coverslips 18mm	VWR	631-0153	Imagerie & nbsp ;
Gaz  d’éthane ;	Linde Gaz	88888DE	Nécessaire pour la cryofixation
Formaldéhyde 36.5&ndash ; 38 % (FA)	Sigma-Aldrich	; F8775	Procédure d’expansion   ; (ancrage)
Glutaraldhéhyde 25 % (GA)	Sigma-Aldrich	; G5882	Étape de substitution par gel
Glycérol   ;	Euromedex  ;	EU3550	Stockage à long terme du gel & nbsp ;
Azote liquide   ;	Linde Gaz	2200975	Nécessaire pour la cryofixation (refroidissement du système)
Microtube clear-lock 5 ml  ;	Dominique Dutscher	390932A	Nécessaire pour la substitution par gel
Aiguille 18G	Dominique Dutscher	050123B	Besoin de collecter de l’acétone
N,N-méthylbisacrylamide 2 % (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533, SIGMA	Procédure d’expansion (polymère)
Paraformoldéhyde 16 % (PFA)	EMS	chat. n° 15710	Étape de substitution par gel
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P1024	Enveloppes de revêtement pour échantillons / imagerie   ;
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1274	Enveloppes de revêtement pour échantillons / imagerie   ;
Réducteur de pression   ;	Linde Gaz	CPLH0SJ-LIN224	Réducateur de pression permettant la dissolution de l’éthane (cryofixation)
Seringe Terumo 10 ml	Dominique Dutscher	50132	Besoin de collecter de l’acétone
Kit d’élastomère en silicone	Dow	4001834	Kit pour la préparation de plaques à puits silionés (immunocoloration) & nbsp ;
Acrylate de sodium 97-99 % (SA)	Sigma-Aldrich	408220	Procédure d’expansion (polymère)
AK Scientific	R624	Procédure d’expansion (polymère)
Dodécyle sulfate de sodium	Euromedex	EU0660	Procédure d’expansion (dénaturation)
Tétraméthyléthylendiamine (TEMED)	Thermo Fisher	17919	Procédure d’expansion (polymère)
Tubulatures & nbsp ;	Thermo Scientific	8060-0060	Tubes pour la discuration de l’éthane (cryofixation)
Préadolescent-20	Euromedex	1005-7	Immunocoloration & nbsp ;
Pinces à épiler Dumont n° ; 5  ;	FineScienceTools	11255-20	Manipulation des pages de couverture   ;