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Article de méthode

Un test microscopique de chlorure de 2,3,5-triphényltérazolium pour une analyse précise et fiable des lésions myocardiques

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DOI :

10.3791/68596

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28 novembre 2025

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1Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 3Shanghai Key Laboratory of Anesthesiology and Brain Functional Modulation, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 4Clinical Research Center for Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 5Translational Research Institute of Brain and Brain-Like Intelligence, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le test actuel de 2,3,5-Triphényltétrazolium (TTC) introduit un protocole de coloration affiné de la TTC qui permet l’analyse des lésions du myocarde à la résolution microscopique, produisant des images de haute qualité permettant une évaluation précise et fiable de la taille de l’infarctus et de la viabilité des cardiomyocytes au niveau cellulaire.

Résumé

Dans ce protocole, nous présentons une méthode affinée basée sur le chlorure de 2,3,5-triphényltérazolium (TTC) pour une analyse précise et fiable de l’infarctus du myocarde (IM) à la résolution cellulaire. Ce protocole consiste en une coloration TTC en deux étapes réalisée sur des cœurs infarctus 24 h-MI : perfusion, où une solution TTC à 1 % est perfusée rétrogradivement à travers le vasculaire coronarien via une canule aortique, et immersion, où le cœur est ensuite incubé dans une solution TTC à 4 °C pendant la nuit. Après la coloration, le cœur est intégré dans un composé OCT et cryosectionné transversalement en tranches de 50 μm d’épaisseur à intervalles de 100 μm. Après un processus de fixation de 24 heures avec le fixateur de Zamboni, une frontière nette et distincte entre un myocarde viable (rouge profond) et un tissu nécrotique (jaune) devient discernable à l’examen microscopique. Notamment, ce test microscopique de TTC permet la détection d’infarctus non seulement dans la phase aiguë (24 heures post-IM) mais aussi sur une fenêtre de temps étendue au-delà de 7 jours. Parce que le test microscopique TTC génère des images à plusieurs couches (80 tranches par cœur), nous avons développé un algorithme robuste semi-automatisé basé sur la couleur qui permet une analyse rapide et efficace de grands ensembles de données d’images et quantifie la taille globale de l’infarctus en quelques minutes. Grâce à ces améliorations, l’approche actuelle affine considérablement le processus de coloration de la TTC et offre un outil largement applicable et précieux pour les laboratoires investiguant les lésions ischémiques cardiaques.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, la cardioprotection a continué d’être poursuivie comme une stratégie clé pour préserver les cardiomyocytes après de graves atteintes ischémiques aucœur 1. Tant en contexte expérimental que clinique, l’étendue finale de la lésion myocardique est un critère crucial pour évaluer l’efficacité des interventionscardioprotectrices 2. Ainsi, une évaluation fiable et précise de la taille de l’infarctus est très souhaitable et fondamentalement importante.

Dans les modèles de rongeurs, le protocole standard pour évaluer la taille de l’infarctus post-mortem reposait principalement sur l’activité de la déshydrogénase mitochondriale, qui convertit enzymatiquement le composé incolore 2,3,5-triphényltétrazolium chlorure (TTC) en un précipité rouge dans les cellules viables, tandis qu’il reste gris clair dans le tissunécrotique 3. Bien que la coloration basée sur la TTC soit simple et rentable, elle présente plusieurs défis méthodologiques et limitations intrinsèques. Cela inclut des tranches cardiaques subissant une contracture en solution de tentative de conception, ce qui déforme fortement le tissu et empêche les tranches de rester à plat pour la planimétrie ; épaisseur inégale de tranche lors du traitement de l’échantillon ; et une mauvaise qualité d’image qui entrave la délimitation précise de la frontière de l’infarctus. Ces dernières années, plusieurs modifications techniques ont été introduites dans le processus de préparation de l’échantillon, telles que l’utilisation de matrices cœuracryliques 4 ou le semi-gel du cœur pour faciliter ledécoupage 3. Bien que ces modifications aient considérablement amélioré la praticité du découpage tissulaire, l’approche conventionnelle continue de s’appuyer sur l’imagerie globale de sections épaisses du cœur, produisant souvent une qualité d’image variable etsous-optimale 5, avec un contraste de couleur insuffisant pouvant introduire une subjectivité substantielle à la mesure de l’infarctus6. De plus, la méthode conventionnelle nécessite l’utilisation de tissu cœur entier, ce qui empêche des analyses polyvalentes sur les mêmes échantillons de tissu, telles que la co-coloration immunitaire des protéines régulatrices pour identifier les cascades de signalisation clés impliquées dans la survie cardiaque. En conséquence, un nombre important d’animaux est souvent nécessaire pour répondre de manière adéquate à diverses questions de recherche.

Pour surmonter ceslimites 5, nous avons développé un protocole adapté à l’imagerie microscopique de la coloration TTC. Cette méthode combine des étapes de coloration « perfusion + immersion » avec la cryosectionnement du tissu cardiaque en fines tranches optimisées pour l’imagerie au microscope optique. Bien que cette méthode ait été récemmentrapportée 7, nous pensons que fournir des procédures expérimentales détaillées en améliore la praticité et l’accessibilité. De plus, comme la méthode microscopique TTC génère des images haute résolution comprenant plusieurs couches de coupes de cœur, nous avons développé un algorithme semi-automatique robuste basé sur la couleur pour répondre à la nature chronophage de l’analyse de grands ensembles de données d’images. La méthode actuelle permet la détection rapide des régions d’infarctus et la quantification de la taille globale de l’infarctus en quelques minutes.

Dans l’ensemble, le protocole présenté ici constitue un outil précieux, permettant aux chercheurs de mettre en œuvre cette méthode de manière efficace et facile et précise.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par la LANUV de Rhénanie-du-Nord-Westphalie, en Allemagne, et menées conformément aux directives ARRIVE et au NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Tout l’équipement et les produits chimiques nécessaires sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Mise en place d’un système de rétro-perfusion Langendorff

REMARQUE : Le système se compose d’un robinet d’arrêt à deux bandes et trois voies, relié à une canule aortique fabriquée à partir d’une aiguille émoussée de calibre 20 et de deux orifices d’infusion, l’un pour la solution de lavage (orifice SAL tamponné au phosphate) et l’autre pour l’infusion TTC (port TTC). En alternant la direction du robinet d’arrêt à trois voies, le perfusé peut être délivré au cœur de manière interchangeable.

  1. Fixez l’appareil horizontalement sur une boîte de Petri de 150 mm à l’aide d’un morceau de ruban adhésif pour éviter les mouvements indésirables lors des étapes ultérieures.
  2. Ajustez la pointe de la canule à 1 mm au-dessus du bas, en l’alignant au niveau de la racine aortique lorsque le cœur est placé à plat.
  3. Pré-remplissez le système avec du PBS bien froid à l’aide d’une seringue de 10 mL via le port PBS.
  4. Préparer une nouvelle solution de coloration (1 % de TTC dissous dans des PBS) ; un volume minimal de 6 mL est requis pour chaque cœur.
    ATTENTION : Essayer d’avoir une enfant est généralement considérée comme dangereuse et nécessite une manipulation soignée car elle peut provoquer une légère irritation cutanée, une irritation sévère des yeux, et est dangereuse si elle est inhalée. Éliminer les déchets et résidus conformément aux exigences des autorités locales.
  5. Utilisez une seringue de 3 mL pour préremplir le port TTC avec la solution de coloration.
  6. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air involontaires dans le système, car elles pourraient provoquer des embolies d’air qui pourraient gêner les taches ultérieures. Dans la plupart des cas, des bulles d’air sont visibles dans le système ; lorsqu’elles sont présentes, retirez-les en retirant et en remplissant à nouveau le PBS tout en tapotant doucement le robinet d’arrêt à trois voies en position verticale de la canule.
  7. Formez un nœud lâche en demi-carré à l’aide d’une suture en soie 6-0 et placez-le à l’extrémité distale de la canule pour fixer plus tard la racine aortique.

2. Préparation de l’échantillon cardiaque

REMARQUE : Des souris C57BL/6J (20-25 g) ont été utilisées dans cette étude. Un infarctus expérimental du myocarde (IM) a été provoqué par une ligature chirurgicale de l’artère descendante antérieure gauche (LAD) pendant 30 à 60 minutes, comme décrit ci-dessous. La méthodologie d’induction de l’EM a déjà été rapportée8 et n’est pas détaillée dans ce manuscrit. Sauf indication contraire, des échantillons cardiaques ont été prélevés 24 heures après l’infarctus.

  1. Sortez la souris MI de la cage et euthanasiez-la par luxation cervicale sous anesthésie profonde à l’isoflurane (3 %, v/v).
    REMARQUE : Toutes les procédures d’euthanasie doivent être correctement documentées et rapportées, y compris la raison de l’euthanasie et la méthode utilisée, conformément à la réglementation locale.
  2. Transférez l’animal euthanasié sur la table d’opération et fixez les quatre extrémités avec du ruban adhésif.
  3. Retirez la fourrure du milieu de l’abdomen à la région de la patte avant à l’aide de pinces et de ciseaux micro-disséquables.
  4. Réaliser une incision transversale de 2 cm dans la paroi musculaire abdominale, juste sous le diaphragme, pour permettre une thoracotomie ultérieure.
  5. Écartez le diaphragme avec des ciseaux fins pour exposer le cœur, puis effectuez des incisions bilatérales à travers la peau, les muscles et les côtes pour ouvrir la cavité thoracique.
  6. Coupez le diaphragme bilatéralement et exposez complètement le cœur en soulevant le sternum.
  7. Versez immédiatement 20 mL de PBS glacé sur la surface du cœur pour arrêter le battement du cœur.
  8. On excise le cœur ainsi que les tissus environnants (poumons et œsophage) et on transfère la masse tissulaire dans un bécher de 50 mL contenant du PBS glacé pendant environ 1 minute pour permettre au rythme cardiaque de s’apaiser.
  9. Transférez le cœur sur une boîte de Petri de 150 mm et découpez la racine aortique sans tissu conjonctif sous un microscope binoculaire à l’aide de pinces fines et de ciseaux.
  10. Retirez doucement le thymus et exposez l’aorte ascendante.
  11. Taillez la racine aortique en disséquant le tissu conjonctif.
  12. Prenez le moignon aortique avec une pince fine et montez-le sur la canule déjà reliée à un appareil de perfusion prérempli de PBS et de solution de coloration TTC. Utilisez une pince fine pour stabiliser la paroi radiculaire aortique lors de l’insertion.
  13. Fixez l’aorte à l’aide du nœud lâche préformé sur la canule. Inspectez attentivement la canule et le cœur pendant qu’elle est rétro-perfusée avec du PBS. Le remplissage du cœur peut être confirmé visuellement par le bombement du ventricule à mesure que le volume de PBS entre dans le cœur augmente.
  14. Laissez les tissus extracardiaques (poumons et œsophage) en place pour soutenir le cœur dans une position naturelle et appropriée.

3. Coloration TTC

  1. Couvrez le cœur de papier mouchoir humide une fois la canulation sécurisée.
  2. Commencez à rincer le cœur avec une seringue préconnectée de 10 mL remplie de PBS bien froide à un rythme de 2 à 3 mL/min pendant 3 minutes, jusqu’à ce que l’éluat cardiaque s’évacue. Cela garantit qu’une quantité minimale de sang reste dans le cœur et les coronaires. Pendant cette étape, évitez une pression excessive pendant la perfusion car cela peut entraîner la rupture du ventricule infarcté.
  3. Inspectez le cœur au microscope binoculaire pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuite à la racine aortique et qu’il se gonfle correctement sous pression de perfusion.
  4. Tournez le robinet d’arrêt à trois voies vers la solution TTC et infusez lentement 1 mL de solution colorante à travers le port TTC sur 30 s.
  5. Réinjectez 1 mL de solution pour essayer d’avoir un enfant 5 minutes plus tard, puis répétez cette étape après 5 minutes supplémentaires (10 minutes après la première perfusion pour essayer d’avoir un bébé). Un total de 3 mL de solution en tentant d’avoir un enfant est nécessaire pour une perfusion 3 fois sur 15 minutes.
  6. Inspectez la surface du cœur au microscope binoculaire. À ce stade, une distinction claire entre le myocarde viable (rouge profond) et le tissu nécrotique (gris clair) devrait déjà être visible.
  7. Retirez tous les tissus non cardiaques à l’aide de ciseaux fins et transférez le cœur taché dans un tube conique de 15 mL contenant 3 mL de solution pour essayer de cerveau.
  8. Placez le tube conique à 4 °C toute la nuit pour une seconde teinture par immersion.

4. Préparation des blocs tissulaires

  1. Retirez le cœur du tube conique et séchez-le soigneusement avec du papier de soie. À ce stade, la coloration dans le myocarde viable devient plus prononcée, et le myocarde non perfusé (régions épicardique et potentiellement endocardique) présente également une coloration rouge pâle.
  2. Remplissez une canule émoussée et courbe de calibre 20 avec un composé à température de coupe optimale (OCT) à l’aide d’une seringue de 1 mL.
  3. Retirez la valve tricuspide avec des ciseaux fins et insérez la canule dans le ventricule droit.
  4. Remplir la cavité avec un composé OCT (environ 50-80 μL) et arrêter l’infusion lorsqu’un reflux est observé.
  5. Exposez la valve mitrale et insérez la canule par l’oreillette gauche et la valve mitrale dans le ventricule gauche.
  6. Infusez doucement la cavité avec un composé OCT (environ 80 μL) et arrêtez l’infusion lorsqu’un écoulement de l’aorte est observé.
  7. Préparez une petite capsule cylindrique (de 1 cm de diamètre) en feuille d’aluminium et remplissez-la de 300 μL de composé OCT.
  8. Placez soigneusement le cœur dans la capsule en position apex-vers le bas et ajustez-le en position verticale. Vue de dessus, l’apex ne doit pas dépasser excessivement de chaque côté.
  9. Immergez la capsule dans une solution de 2-méthylbutane pré-refroidie à -30 °C à -40 °C.
  10. Laissez l’échantillon rester dans la solution pendant 5 à 10 minutes avant de former un bloc tissulaire.
  11. Marquez le bloc tissulaire et stockez-le à -80 °C pour une analyse histologique approfondie.

5. Cryosectionnement et fixation

  1. Montez le bloc tissulaire sur un mandrin de cryostat à l’aide d’un composé OCT.
  2. Placez le mandrin dans le cryostat et réglez la température à environ -24 °C.
  3. Tranchez le bloc tissulaire jusqu’à ce que l’apex soit visible.
  4. Réglez l’épaisseur de la section à 50 μm et collectez chaque deuxième tranche, ce qui donne des intervalles de 100 μm entre les tranches.
    REMARQUE : Évitez le repliement des tissus lors de la cryosection. Cela est largement minimisé en remplissant les cavités ventriculaires vides avec un composé OCT (voir étapes 4.4-4.6).
  5. Alignez les tranches séquentiellement sur des lames de microscope en verre, en plaçant huit morceaux par lame. Au total, 80 sections, c’est-à-dire 10 diapositives, sont attendues par cœur.
  6. Séchez les lames avec un sèche-cheveux au réglage le plus bas en utilisant un flux d’air à température ambiante (sans chauffage nécessaire) pendant environ 10 minutes.
  7. Immergez les lames dans une chambre de coloration remplie de solution de Zamboni (un fixateur contenant 2 % de paraformoldéhyde et 0,4 % d’acide picrique, w/v).
    ATTENTION : Le fixateur de Zamboni peut provoquer une réaction allergique cutanée et est suspecté de provoquer des défauts génétiques et des cancergènes. Éliminer les déchets et résidus conformément à la réglementation des autorités locales.
  8. Fixez le tissu cardiaque à 4 °C pendant la nuit. Cette fixation à long terme garantit que la surface du tissu cardiaque reste exempte des bulles d’air formées lors du processus de fixation.
  9. Après fixation, retirez les lames du fixateur et rincez-les trois fois avec du PBS.
  10. Montez les glissières avec un support de montage et couvrez les sections avec des coulisses. Après cette étape, les diapositives en forme de cœur sont prêtes pour l’acquisition d’images.
  11. Conservez les échantillons dans une boîte à lames à température ambiante.
    REMARQUE : Comme les précipités de formazan sont insolubles dans l’eau, la coloration peut être conservée pendant des années sans perte d’intensité.

6. Imagerie et traitement

  1. Installez un microscope optique avec un objectif 1,25x et utilisez le logiciel CellSens pour l’imagerie.
  2. Placez la section du cœur au centre du champ de vision.
  3. Ajustez le temps d’exposition, la mise au point et la balance des blancs de l’appareil si nécessaire.
  4. Capturez les images de chaque section et enregistrez toutes les images du même cœur dans un dossier dédié.
  5. Copiez le script R (Fichier Supplémentaire 1) sur la plateforme RStudio et exécutez un algorithme automatisé basé sur R pour évaluer l’IM. L’algorithme calcule la taille planimétrique des infarctus pour chaque tranche et calcule le volume total d’infarctus pour l’ensemble du cœur.
  6. Exportez le jeu de données dans un fichier Excel et analysez les données selon les besoins.
  7. Importez toutes les images de chaque cœur dans la plateforme ImageJ pour une reconstruction 3D ultérieure.
  8. Empilez toutes les images dans un ordre cohérent et séquentiel à l’aide du menu contextuel de la plateforme ImageJ.
  9. Créez une construction 3D en utilisant la fonction de graphiage de surface.
  10. Ouvrez la fenêtre du Volume Viewer et ajustez tous les paramètres pour la projection 3D.
    REMARQUE : La méthodologie pour l’immunohistochimie9 et les vidéos pour la coloration conventionnelle TTC 4,5 ont déjà été rapportées et ne sont pas incluses dans ce manuscrit.

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Résultats

Les étapes clés impliquées dans la coloration microscopique TTC sont illustrées à la Figure 1. Après deux cycles de coloration TTC, un motif perforé distinct est apparu à la surface du cœur. La coupe en série de l’ensemble du cœur à des intervalles de 100 μm a donné environ 80 sections tissulaires, le site de ligature étant situé autour de la60e tranche. Dans chaque section, la coloration rouge profond des cardiomy...

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Discussion

L’infarctus du myocarde (IM), résultant d’une ischémie myocardique prolongée, reste une préoccupation majeure pour la santé mondiale, car la lésion ischémique altère souvent la fonction contractile du cœur nécessaire à une circulation sanguine efficace. Au cours des dernières décennies, des efforts importants ont été consacrés à l’identification d’interventions ou de composés qui renforcent la résistance cardiaque au stressischémique 1. Bien que des critères alter...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Cette étude a été financée par FoKo 23/2013 et par l’Institut de Recherche Cardiovasculaire de Düsseldorf (CARID).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Objectif 1,25xOlympePlanApo 1.25X/0.04Imagerie
Seringues de 10 mLB.Braum4617100VRétro-perfusion
2,3,5-triphényltétrazolium chlorureMilipore1.08380.0100Produits chimiques
Canule 20 GBD305895Rétro-perfusion
3  ; mL SeringuesB.Braum4617022VRétro-perfusion
Robinet d’arrêt à 3 voiesB.Braum16494CRétro-perfusion
Aquamount & nbsp ;BDH362262HCyrosection
ÉquilibreOhausN/APesée des produits chimiques
Microscope binoculaireLeicaMZ6Canulation
C57BL/6JJanvierN/AAnimaux
CaméraOlympeUC30Imagerie
Cartes de couvertureEprediaBB02400500A113MN20Cyrosection
CryostatLeicaM850Cyrosection
Eau double distilléeMIliporeN/AProduits chimiques de dissolution
Ciseaux fins à disséquerAESCULAPBC702RInstruments chirurgicaux
Pinces micro-disséquées fines   ;AESCULAPFM001RInstruments chirurgicaux
Lames de microscope en verreEngelbrecht11102Cyrosection
ImageJNIH1,54gTraitement de l’imagerie
IsofluranePiramal14150097146754Produits chimiques
IsopropanolRoth  ; 0733.1Produits chimiques
Microscope optiqueOlympeBX61Imagerie
Micro-dissection des pinces & nbsp ;F.S.T11152-10Instruments chirurgicaux
Composé OCTSakura4583Produits chimiques
Boîte de PetriTherno Scientific172931Rétro-perfusion
Solution physiologique tamponnée au phosphateRoth9143.1Produits chimiques
RstudioLogiciel Posit2024.09.0Traitement de l’imagerie
Suture de soieF.S.T18020-60Rétro-perfusion
LogicielsOlympeCellSens V3.2Imagerie
Ciseaux à disséquer en acier inoxydableAESCULAPBC257RInstruments chirurgicaux
Solution de ZamboniMorphisto12773.0050Produits chimiques

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Coloration au TTCInfarctus du myocardeCryosectionnementImagerie microscopiqueIsch mie cardiaqueQuantification de la taille de l infarctusPerfusion coronaireReconstruction 3DAnalyse du tissu cardiaque
Un test microscopique de chlorure de 2,3,5-triphényltérazolium pour une analyse précise et fiable des lésions myocardiques
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