Article de méthode

Lactylomé basé sur la spectrométrie de masse et confirmation des protéines lactylées

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DOI :

10.3791/68597

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24 avril 2026

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1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode utilisant des lignées cellulaires de carcinome squameux œsophagien comme exemple pour analyser la lactylation des protéines. Le processus consiste à analyser la lactylation des protéines à partir de culture cellulaire jusqu’à la confirmation des candidats, incluant l’analyse par spectrométrie de masse basée sur la lactylation et la confirmation par immunoprécipitation.

Résumé

Identifiée pour la première fois en 2019, la lactylation, une nouvelle modification post-traductionnelle (PTM) sur les résidus de lysine, s’est depuis révélée intéressante dans de multiples pathologies et contextes physiologiques. Elle possède deux isomères (L- et D-lactylation) et est connue pour modifier la formation de complexes, la localisation cellulaire ou la stabilité des protéines cibles. Ce protocole décrit une méthode d’analyse de la lactylation à partir de culture cellulaire jusqu’à la confirmation de cibles lactylées potentielles, en prenant comme exemple la lignée cellulaire TE11 du carcinome épidermoïde œsophagien. Le protocole suivant fournira des détails sur l’identification des protéines lactylées par immunoprécipitation (IP) spécifique à L-lactyllysine (KL-LA) des peptides pour l’analyse par spectrométrie de masse (MS) : (1) extraction des protéines, (2) réduction des protéines, alkylation et digestion, (3) purification des protéines et concentration des peptides, (4) IP utilisant des billes de KL-LA et (5) concentration de peptides de KL-LA . Suite à ces étapes, des analyses des données brutes de la SEP seront effectuées pour identifier les sites lactylés, et la confirmation de ces protéines lactylées présumées par IP sera décrite. Grâce à cette méthode, une gamme de 100 à 500 peptides peut être identifiée, et des protéines lactylées d’intérêt peuvent être confirmées. En conclusion, l’étude des protéines lactylées a le potentiel d’améliorer notre compréhension de la signalisation cellulaire générée par PTM dans des conditions normales et pathologiques.

Introduction

La lactylation est une modification post-traductionnelle (PTM) sur les résidus de lysine utilisant des métabolites dérivés de la glycolyse. La L-lactyl-CoA et la lactoylglutathion sont des substrats de la L-lactylation (KL-LA) et de la D-lactylation (KD-LA), respectivement 1,2. La L-lactylation est un processus enzymatique impliquant des enzymes telles que l’acétyltransférase 3,4. Au contraire, la D-lactylation est un processus non enzymatique par substitution nucléophile entre la lactoylglutathion et un résidude lysine 5. En tant que processus dynamique, des déacétylases telles que HDAC1-3 ont été impliquées comme effaceurs de lalactylation 6. Depuis sa découverte en 20193, il a été démontré qu’elle suscite un intérêt dans de multiples pathologies et contextesphysiologiques 2. Cette PTM a été identifiée pour la première fois sur les histones par l’observation d’un décalage de masse de 72,021 Da à l’aide d’analyses de chromatographie liquide haute performance (HPLC)-spectrométrie de masse tandem (MS/MS) 3. Depuis, la lactylation a été détectée sur d’autres protéines que les histones et a été démontré qu’elle affecte la diversité fonctionnelle, la localisation ou la stabilité des protéines modifiées selon le contexte 7,8,9,10.

Étant donné que les PTM sont fréquemment en faible abondance11 et font partie d’un processus dynamique ettransitoire 12, un enrichissement du PTM étudié par immunoprécipitation (IP) est nécessaire. Par la suite, la SEP est fréquemment utilisée pour décrire le protéome lié à la PTM sur des peptides digérés, tels que le phosphoprotéome ou le profilage d’ubiquitination11. Comme c’est le cas pour ces autres PTM, lactylomes ou peptides enrichis lactylés, la protéomique basée sur la SEP est la méthode de référence pour identifier de nouveaux sites de lactylation.

Ce protocole décrit l’identification de peptides enrichis en KL-LA par protéomique basée sur la SEP, suivie de la confirmation de protéines lactylées par immunoprécipitation. En prenant comme exemple des lignées cellulaires du carcinome épidermoïde œsophagien (ESCC), nous décrivons un protocole pour retirer des protéines lactylées afin d’identifier les cibles lactylées à base de SEP et leur confirmation ultérieure par IP.

Protocole

Comme les MTP sont un processus dynamique et transitoire, il est important de préétablir la confluence à laquelle le niveau total de lactylation est optimal en utilisant la cytométrie en flux ou le Western blotting avec un anticorps anti-KL-LA . Par exemple, une confluence de 70 % à 80 % est préférable dans les lignées cellulaires ESCC pour les expériences lactylome et IP, car le niveau total de lactylation est au plus élevé. Les réactifs et équipements utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Culture cellulaire

  1. Cultivez les cellules dans des boîtes de Petri de 100 mm jusqu’à atteindre la confluence requise, comme indiqué précédemment.
    REMARQUE : Faites pousser suffisamment de cellules pour obtenir entre 0,5 et 1 mg de protéines pour les lactylomes ou plus de 2 mg pour les IP.
  2. Rincez les cellules avec 5 mL de solution physiologique pré-refroidie 1x tamponnée au phosphate (PBS).
  3. Ajoutez 500 μL de PBS pré-refroidi et récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules. Transférez dans un microtube à faible liaison de 1 mL.
  4. Centrifugez les cellules à 2 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante (RT) et jetez le surnageant transparent. Les granulés cellulaires peuvent être stockés à -80 °C.

2. Lactylome

REMARQUE : Utilisez toujours des gants pour éviter la contamination des échantillons. Utilisez toujours des embouts filtrés, des microtubes à faible liaison et de l’eau de qualité MS.
REMARQUE : Les réplications biologiques (3 à 5 selon notre expérience) doivent toujours être réalisées afin de garantir que les modifications identifiées soient reproductibles.

  1. Extraction des protéines
    REMARQUE : Travailler sur glace.
    1. Préparez le tampon de lyse du lactylome (Tableau 1) et conservez à 4 °C avant utilisation. Ajoutez des inhibiteurs de protéase juste avant utilisation.
    2. Extraire les protéines à l’aide du volume approprié de tampon de lyse.
    3. Sonicez sur glace 12 cycles de 5 s d’impulsion + 5 s d’arrêt à une intensité de 20 % à 25 %.
    4. Centrifugez à 16 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Transférez le surnageant transparent contenant les protéines dans un nouveau microtube à faible liaison.
    5. Quantifiez les protéines à l’aide d’un kit d’acide bicinchoninique (BCA) selon les recommandations du fabricant.
      REMARQUE : Le kit BCA est compatible avec un maximum de 3 M d’urée. Ainsi, les échantillons doivent être dilués en conséquence.
    6. Transférer 500 μg à 1 mg de protéines vers de nouveaux microtubes à faible liaison. Utiliser la même quantité de protéines pour chaque échantillon. Compléter le volume de tous les échantillons avec le tampon de lyse du lactylome jusqu’au même volume final.
  2. Réduction, alkylation et digestion enzymatique
    1. Ajoutez du dithiothréitol à une concentration finale de 5 mM. Incubez à 95 °C pendant 2 minutes.
    2. Incuber pendant 30 minutes en temps de repos.
    3. Ajoutez la chloroacétamide à une concentration finale de 7,5 mM. Incubez en RT pendant 20 minutes dans le noir.
    4. Ajoutez 3 fois le volume d’échantillon (de l’étape 2.1.6) de 1 M (NH4)2CO3 pour réduire l’urée de 8 M à 2 M.
      REMARQUE : Si le volume total dépasse la capacité des microtubes, séparez-le en deux microtubes.
    5. Ajoutez 1 μg de trypsine de qualité EM pour 100 μg de protéines. Incubez toute la nuit à 30 °C. Procédez à la purification de l’échantillon.
  3. Purification et concentration peptidique
    REMARQUE : Travaille chez RT.
    1. Acidifiez l’échantillon en ajoutant de l’acide trifluoroacétique (TFA) à une concentration finale de 0,2 %.
    2. Préparez les solutions suivantes dans de l’eau de qualité EM fraîchement : 0,1 % TFA, 1 % acide formique (FA) et 1 % de FA/50 % d’acétonitrile.
    3. Utilisez des colonnes de 100 mg de C18 pour procéder à la purification.
      REMARQUE : Pour utiliser cette colonne, utilisez deux pointes de pipette : chargez la colonne avec une et coupez la pointe de l’autre pour éjecter le liquide de la colonne. Assurez-vous que la colonne reste constamment humide. Utilisez une colonne par échantillon.
    4. Chargez la colonne avec 1 mL d’acétonitrile à 100 %, la solution mouillante, puis éjectez. Répétez deux fois.
    5. Équilibrez la colonne en chargeant 1 mL de 0,1 % de TFA et éjectez. Répétez deux fois.
    6. Chargez la colonne avec 1 mL de l’échantillon acidifié. Procédez à 10 cycles de charge/éjection de l’échantillon. Répétez si un échantillon reste encore.
    7. Lavez la colonne en chargeant 1 mL de 0,1 % de TFA et éjectez. Répétez deux fois.
    8. Pour l’élution, procéder à 10 cycles charge/éjection en utilisant 750 μL de 1 % d’ACA/50 % d’acétonitrile. Collecter dans un nouveau microtube à faible liaison. Répéter avec 750 μL supplémentaires d’acétonitrile à 1 %/50 % pour un total de 1,5 mL de peptides purifiés.
      REMARQUE : Identifiez le microtube sur le côté plutôt que sur le bouchon afin d’éviter de contaminer les échantillons en perceant des trous dans le bouchon.
    9. Percer 1 à 3 trous dans le bouchon des microtubes avec une aiguille pour l’évaporation.
    10. À l’aide d’un concentrateur sous vide, concentrez les échantillons à 60 °C aussi longtemps que nécessaire (pour des échantillons dans un volume final de 1,5 mL, cela peut prendre au moins 4 heures). Ensuite, procéder à l’immunoprécipitation des peptides.
  4. Immunoprécipitation à l’aide de billes KL-LA
    1. Préparez le tampon de lavage et le tampon IP de lactylomé (Tableau 2).
    2. Sur la glace, ajoutez 200 μL de tampon IP aux peptides concentrés, en mélangeant soigneusement jusqu’à ce qu’ils soient dissous. Certains précipités sont encore visibles.
    3. Centrifugez à 12 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour éliminer les précipités.
      REMARQUE : Après centrifugation, l’échantillon peut être dosé en tant qu’étape de contrôle en ajoutant, par exemple, un spectrophotomètre pour quantifier la concentration du peptide à 205 nm.
    4. Lavez les billes conjuguées àl’agarose K-LA 3 fois avec 200 μL de PBS 1x glacé en centrifugant à 2 000 x g pendant 1 minute à 4 °C et en retirant le surnageant clair après chaque lavage.
      REMARQUE : Pour 1 mg de protéine au début de ce protocole, utilisez 20 μL de billes conjuguées àl’agarose de K-L-LA , précédemment alicotées dans des tubes à faible liaison de 0,5 mL pour une utilisation facile.
    5. Transférez le surnageant transparent contenant les peptides en suspension dans le microtube de 0,5 mL contenant les billes pré-lavées. Scellez les tubes avec un film de paraffine pour éviter toute fuite.
    6. Incubez toute la nuit avec une rotation douce d’un bout à l’autre à 4 °C.
      REMARQUE : Les étapes 2.4.7-2.4.12 sont toutes effectuées à 4 °C.
    7. Pelletez les billes par centrifugation à 2 000 x g pendant 1 minute. Jetez le surnageant transparent.
    8. Ajoutez 200 μL de tampon IP de lactylome et lavez pendant 15 s en inversant le tube. Centrifugez à 2 000 x g pendant 30 s et jetez le surnageant transparent.
    9. Répétez l’étape 2.4.8 une fois.
    10. Ajoutez 200 μL de tampon de lavage et lavez pendant 15 s en inversant le tube. Centrifugez à 2 000 x g pendant 30 s et jetez le surnageant clair.
    11. Répétez l’étape 2.4.10 deux fois.
    12. Ajoutez 200 μL d’eau de qualité MS et lavez pendant 30 secondes en inversant le tube. Centrifugez à 2 000 x g pendant 1 minute et jetez le surnageant transparent.
      REMARQUE : Les étapes restantes du protocole lactylomé sont effectuées au RT.
    13. Éluvez les peptides liés avec 100 μL de tampon d’élution (0,1 % TFA fraîchement préparé) pendant 1 minute avec une rotation douce d’un bout à l’autre à la RT. Centrifugez à 2 000 x g pendant 2 minutes.
    14. Répétez l’étape 2.4.13 deux fois supplémentaires et combinez les élues. Procédez à la purification des échantillons.
  5. Concentration et purification des peptides de KL-LA
    1. Préparez les solutions suivantes dans de l’eau douce de qualité EM : 0,1 % TFA, 1 % AF et 1 % FA/50 % acétoninitrile.
      REMARQUE : Juste avant de commencer la purification, préparez la bonne quantité de solution dans des microtubes de 1,5 mL (étape 2.5.3 : 300 μL d’acétonitrile à 100 %, étape 2.5.4 : 300 μL de 0,1 % d’AGT, étape 2.5.6 : 300 μL de 0,1 % d’AGT et étape 2.5.7 : 300 μL de 1 % d’AC/50 %).
    2. Utilisez des embouts de C18 de 100 μL pour procéder à la purification.
      REMARQUE : Les embouts C18 de 100 μL sont utilisés de la même manière que les embouts de pipette traditionnels. Gardez le pouce engagé et ne relâchez jamais le ventouse entre les pas afin de maintenir la colonne humide et d’empêcher l’air d’entrer.
    3. Aspirez 100 μL d’acétonitrile à 100 %, la solution mouillante, et dispensez soigneusement sans éjecter tout le liquide. Répétez deux fois.
    4. Équilibrez la colonne en aspirant 100 μL de 0,1 % de TFA et distribuez prudemment. Répétez deux fois.
    5. Chargez la colonne avec 100 μL de l’échantillon de peptides de KL-LA . Poursuivez 10 cycles charge/éjection dans un nouveau microtube à faible liaison. Répétez si un échantillon reste encore.
    6. Lavez la colonne en aspirant 100 μL de 0,1 % de TFA et distribuez-le. Répétez deux fois.
    7. Procéder à 10 cycles charge/éjection pour l’élution en utilisant 100 μL de 1 % d’AC/50 % d’acétonitrile dans un nouveau microtube à faible liaison. Répétez deux fois et combinez les éluats.
      REMARQUE : Les peptides se liant à la pointe C18 pourraient empêcher la pointe d’aspirer 100 μL à la fois. Répétez cette étape jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de liquide dans le microtube (300 μL) à l’étape 2.5.7.
    8. Percer 1 à 3 trous dans le bouchon des microtubes avec une aiguille pour l’évaporation.
      REMARQUE : Identifiez les microtubes sur le côté du tube plutôt que sur le bouchon afin d’éviter de contaminer les échantillons lors de la perforation.
    9. À l’aide d’un concentrateur sous vide, concentrez les échantillons à 60 °C aussi longtemps que nécessaire pour que le liquide s’évapore (pour un volume total de 300 μL, cela peut prendre au moins 2 h).
    10. Resuspendez les peptides concentrés à 30 μL de 1 % d’AF.
    11. En suivant les directives de votre plateforme de spectrométrie de masse, quantifiez les peptides avec un spectrophotomètre à 205 nm pour déterminer leur concentration.
    12. Transférez dans un flacon en verre et gardez à 4 °C jusqu’à l’analyse de la sclérose en plaques.

3. Analyse de la maîtrise et bioinformatique

REMARQUE : Les échantillons ont été analysés à l’installation centrale de protéomique de l’Université de Sherbrooke à l’aide d’un spectromètre de masse (MS) (fonctionnant en mode acquisition dépendante des données avec fragmentation en série par accumulation parallèle (DDA-PASEF).

  1. Spectrométrie de masse
    1. Pour chaque échantillon, injectez 375 ng de peptides dans un système de chromatographie liquide haute performance (HPLC).
    2. Chargez les peptides sur une colonne de piège à un débit constant de 4 μL/min.
    3. Séparez les peptides sur une colonne C18 analytique en utilisant un gradient de 2 heures de 5 %-37 % d’acétonitrile en 0,1 % d’ACA à un débit de 400 nL/min.
    4. Effectuez une ionisation par électropulvérisation avec les réglages suivants : Tension capillaire : 1500 V, gaz sec : 3,0 L/min, Température sèche : 180 °C, TIMS-pression d’entrée : 2,6 mBar.
    5. Acquérir les spectres de masse dans une plage de 100-1700 m/z en utilisant le mode DDA auto-MS/MS.
      REMARQUE : L’instrument est configuré pour détecter les états de charge de 0 à 5+. Une configuration TIMS (double spectrométrie de mobilité ionique piégée) est utilisée avec un temps de rampe de 100 ms et 10 scans de fragmentation en série par accumulation parallèle (PASEF) par cycle d’acquisition, ce qui donne un cycle de travail de 1,17 s. L’exclusion dynamique est réglée à 0,4 min.
    6. Effectuer la fragmentation à l’aide d’une énergie de dissociation induite par collision (CID) augmentée linéairement de 20 à 59 eV sur une plage de mobilité ionique de 0,6 à 1,6 Vs/cm².
      REMARQUE : L’intensité cible est fixée à 20 000, avec un seuil d’intensité de 2 500. Un polygone de filtre standard est appliqué pour prioriser les précurseurs le long de la ligne de balayage diagonale pour les peptides chargés +2, +3 et +4 dans le plan de mobilité m/z-ion.
  2. Prétraitement des données : analyse MaxQuant
    REMARQUE : Les étapes suivantes sont réalisées à l’aide du logiciel MaxQuant v.2.6.713 pour identifier les peptides lactylés.
    1. Dans la section en haut à droite, cliquez sur l’onglet Configuration et vérifiez que la lactylation a été ajoutée en tant que modification.
    2. Sinon, utilisez la base de donnéesUnimod.org 14. Connectez-vous en tant qu’invité et cherchez lactylation (accession #2114).
    3. Cliquez sur le bouton Ajouter . Dans Nom, écrivez Lactylation (K), entrez la composition telle qu’elle est écrite dans Unimod en cliquant sur le bouton Changer .
    4. Vérifiez la masse monoisotopique obtenue. Cliquez sur OK.
    5. En haut à gauche de l’écran, en bleu, cliquez sur le bouton Enregistrer les changements .
    6. Dans la section en haut à gauche, cliquez sur Données brutes. Chargez les fichiers bruts et nommez-les automatiquement en utilisant le bouton Pas de fractions .
    7. Définissez le nombre de threads en bas à gauche en fonction du nombre de cœurs accessibles sur l’ordinateur.
    8. Dans l’onglet spécifique au groupe , cliquez sur Modifications en bleu.
    9. Ajoutez la lactylation aux modifications des variables en cliquant sur le bouton flèche pour ajouter à la case à droite.
    10. Cliquez sur Quantification sans étiquette. Entrez LFQ et changez le type de normalisation en aucun.
    11. Cliquez sur Digestion. Assurez-vous que la trypsine/P est ajoutée sur le carré à droite.
    12. Augmentez le maximum de clivages manqués à 4 car la lactylation pourrait affecter la digestion de la trypsine (HPS).
    13. Cliquez sur Instrument. Changez la tolérance peptidique de recherche principale à 20, sachant que la lactylation n’est pas une PTM courante.
    14. Dans la section en haut à gauche, cliquez sur Paramètres globaux. Ajoutez un fichier Fasta, précédemment téléchargé depuis Uniprot ou Ensembl, pour l’espèce correspondante.
    15. Cliquez sur Règle d’identification et Tester pour vous assurer que le fichier Fasta peut être lu correctement.
    16. Cliquez sur Quantification des protéines en bleu. Ajoutez Lactylation au carré à droite.
    17. Cliquez sur Identification en bleu. Changez FDR à 0,05. Assurez-vous que les seconds peptides et la correspondance entre les séries sont vérifiés.
    18. Cliquez sur Quantification sans étiquette en bleu. Cochez les cases iBAQ et Top3.
    19. Dans la section en haut à droite, cliquez sur Performance.
    20. Dans la section du bas, cliquez sur Démarrer en bleu.
  3. Identification des protéines lactylées
    REMARQUE : À la fin de la sortie MaxQuant, plusieurs fichiers de sortie seront obtenus, tels que :
    • Sites (K)de lactylation : fichier principal d’intérêt - contient des informations spécifiques au site sur les résidus de lysine lactylés dans une séquence peptidique précise (protéine identifiée, localisation de la lactylation dans la séquence, intensités, niveau de confiance).
    • Paramètres de lactylation : contient toutes les informations sur les réglages et seuils utilisés lors de l’analyse MaxQuant.
    • Peptides de lactylation : peptides identifiés modifiés et non modifiés.
    • Groupes protéiques de lactylation : groupes protéiques identifiés et leur lien avec la lactylation détectée.
    L’utilisation de ces fichiers dépendra de la question de recherche. L’étape suivante décrit comment identifier un site lactylé.
    1. Ouvrez le fichier Lactylation (K)Sites dans Excel.
    2. Dupliquez l’onglet en bas des sites de lactylation (K )Sites pour conserver les données originales.
    3. Triez de A à Z les colonnes Inverse et Contaminant potentiel . S’il y a de la valeur dans certaines lignes, supprimez ces lignes.
    4. Dans ce nouvel onglet, ne conservez que les colonnes nécessaires, telles que : (1) Protéine :UniProt 14 Numéro d’accession primaire, (2) Positions au sein des protéines : Position prédite de la lactylation, importante à confirmer comme décrit plus tard, (3) Noms de protéines, (4) Noms de gènes, (5) Nombre de lactylation (K détecté sur le peptide correspondant), (6) Probabilités de lactylation (K) (Probabilité de 1 sur la position de lactylation), (7) Intensité (somme de toutes les intensités individuelles appartenant au peptide correspondant).
    5. Complétez toutes les valeurs manquantes telles que les noms des protéines ou les noms des gènes.
    6. Ne gardez que le premier numéro d’acquisition dans la colonne « Protéines ». Le tableau obtenu représente tous les peptides lactylés détectés ainsi que la protéine la plus probable dans laquelle ce peptide peut être trouvé.
      REMARQUE : Comme la lactylation n’est pas une PTM abondante, entre 100 et 500 peptides devraient être identifiés comme lactylés. Comme les peptides détectés diffèrent d’un réplicat à l’autre, il est possible de fixer un seuil d’au moins détecté dans 2 réplicés biologiques.
    7. Pour confirmer la position d’un résidu modifié, utilisez un outil web d’alignement tel que BLAST du NIH15 ou Align de UniProt16 avec la séquence peptidique dans la colonne « Probabilités de lactylation (K) » (effacer toute probabilité) et la séquence protéique de la base de donnéesUniProt 17.
      REMARQUE : Puisque plusieurs sites de lactylation peuvent être identifiés dans une seule séquence protéique, il est possible d’aligner ces sites simultanément. Cela aidera également à identifier les sites dupliqués qui peuvent être sur différents peptides mais au même endroit dans la séquence protéique.
    8. L’analyse des données dépendra de la question de recherche, mais il est nécessaire de considérer les étapes de normalisation, de centrage, d’échelle et de transformation logarithmique avant de réaliser toute analyse statistiquedes données 18.
    9. Pour confirmer les protéines lactylées identifiées par l’analyse de la SEP, procédez au protocole d’immunoprécipitation.

4. Immunoprécipitation (IP)

  1. Extraction des protéines
    REMARQUE : Travailler sur glace.
    1. Préparez le tampon de lyse/lavage IP (Tableau 3) et conservez-le à 4 °C avant utilisation. Ajoutez les inhibiteurs de protéase juste avant utilisation.
      REMARQUE : Pour la préparation de l’échantillon, une pastille cellulaire conservée à -80 °C peut être utilisée. Si vous travaillez avec des cellules fraîches, suivez les étapes 4.1.2 et 4.1.3. Sinon, resuspendez la pellete cellulaire dans le même volume de tampon de lyse/lavage IP que indiqué à l’étape 4.1.2 et continuez avec l’étape 4.1.4.
    2. Ajoutez 1 mL de tampon de lyse/lavage IP et incubez les cellules à 4 °C pendant 10 minutes.
    3. Prélever les cellules à l’aide d’un racloir cellulaire et transférer la lyse dans un microtube de 1,5 mL.
    4. Incubez avec une rotation douce d’un bout à l’autre pendant 30 minutes à 4 °C.
    5. Centrifugez à 16 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C.
    6. Transférez le surnageant transparent dans un nouveau microtube de 1,5 mL.
    7. Quantifiez les protéines avec un kit BCA selon le protocole du fabricant.
  2. Pré-débarrassage des billes et incubation par anticorpsK-L-LA
    REMARQUE : Travailler sur glace. Pour chaque condition expérimentale, préparez un tube IP de contrôle (IgG de la même espèce que l’anticorps KL-LA ) et un tube pour KL-LA IP.
    1. Transférez 1 mg de protéines dans un nouveau microtube de 1,5 mL. Complétez tous les échantillons jusqu’au même volume final à l’aide de la lyse/tampon de lavage IP.
      REMARQUE : Ce protocole peut être réalisé à l’aide de billes magnétiques ou d’agrose. Pour les étapes suivantes, des billes magnétiques ont été utilisées.
    2. Transférez le volume requis de billes dans un nouveau microtube de 1,5 mL.
    3. Pour pré-laver les billes, magnétisez-les pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que la solution soit claire. Jetez le surnageant transparent. Lavez les billes 3 fois avec 500 μL de tampon de lyse/lavage IP. Jetez le surnageant transparent après chaque lavage. Ajoutez le même volume de tampon IP que le volume initial de billes prélevées.
    4. Incubez les échantillons de protéines avec 10 à 15 μL des perles pré-lavées en effectuant une rotation douce d’un bout à l’autre pendant 20 minutes à 4 °C.
      REMARQUE : Pour 1 mg de protéines, utilisez 10 à 15 μL de billes magnétiques. Cette étape minimise la liaison des protéines non spécifiques aux billes pendant le protocole d’immunoprécipitation.
    5. Magnétiser les billes pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que la solution soit claire. Transférez le surnageant transparent dans un nouveau microtube de 1,5 mL.
    6. Ajoutez 1,5 μL d’anticorpsanti-K L-LAdans un tube et la quantité correspondante d’IgG dans un autre tube.
      REMARQUE : Pour 1 mg de protéines au début de ce protocole, utilisez 1,5 μg d’anticorps.
    7. Incubez les échantillons avec une rotation douce de bout en bout toute la nuit à 4 °C.
  3. Immunoprécipitation KL-LA
    REMARQUE : Travailler sur glace.
    1. Préparez le tampon de lyse/lavage IP (Tableau 3) et conservez-le à 4 °C avant utilisation. Ajoutez les inhibiteurs de protéase juste avant utilisation.
    2. Pré-lavez les billes comme décrit à l’étape 4.2.3.
      REMARQUE : Pour 1 mg de protéines au début de ce protocole, utilisez 40 μL de billes magnétiques.
    3. Incubez les échantillons avec 40 μL de billes magnétiques pré-lavées avec une rotation douce d’un bout à l’autre pendant 4 heures à 4 °C.
    4. Magnétiser les billes pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que la solution soit claire. Collectez le premier surnageant clair. Lavez les billes 3 fois avec 500 μL de tampon de lyse/lavage IP. Retirez le surnageant transparent après chaque lavage.
      REMARQUE : Le premier surnageant peut être quantifié et utilisé en western blotting (WB). Il est utile d’évaluer l’efficacité de l’immunoprécipitation.
    5. Resuspendez les billes avec 20 μL de 2x Laemmli et 5 % de tampon β-mercaptoéthanol.
    6. Incubez à 95 °C pendant 5 minutes avant de les charger sur un gel SDS-PAGE. Sinon, les échantillons dénaturés peuvent être conservés à -20 °C pendant plusieurs semaines.
  4. Détection de WB
    1. Placez les tubes IP sur le support magnétique pendant 30 secondes avant de prélever l’échantillon et de le charger sur un gel SDS-PAGE.
    2. Effectuer un test de globule blanc en utilisant un anticorps contre la protéine d’intérêt et/ou l’anticorpsanti-K L-La pour confirmer la réduction des protéines lactylées dans l’albumine sérique bovine à 5 % (BSA). Les anticorps secondaires ont été dilués à 1:5000 dans 5 % de BSA.
    3. Détectez les bandes en utilisant la détection chimioluminescente basée sur HRP.

Résultats

Par exemple, la lignée cellulaire TE11 du carcinome épidermoïde œsophagien a été cultivée jusqu’à atteindre 80 % de confluence. En suivant le flux de travail illustré dans la Figure 1 et l’analyse MaxQuant telle que décrite dans ce protocole, le lactylomé a été déterminé. Dans ces cellules, 137 peptides ont été identifiés comme potentiellement lactylés, représentant 82 protéines uniques, plusieurs sites ayant été identifiés sur la même protéine (Figure 2A). Notez que cela ne prend pas en compte les peptides uniques. Un nombre compris entre 100 et 500 peptides identifiés est attendu dans ces expériences sur des lignées cellulaires de carcinomes épidermoïdes œsophagiens.

Les protéines lactylées identifiées sont liées à plusieurs processus biologiques, tels que le remodelage de la chromatine ou l’assemblage de la chromatine, qui avaient déjà été décrits dans la littérature comme enrichis en protéines lactylées (Figure 2B). Certaines des premières protéines lactylées identifiées étaient des histones, que l’on trouve également dans ces données, comme l’histone H1.2 (tableau 4). La lactylation a pu être identifiée sur plusieurs résidus de lysine différents provenant d’une même protéine. Par exemple, deux sites de lactylation ont été identifiés sur l’histone H1.2 : les lysines (K) 168 (probablement) et 191. Sur le premier peptide (tableau 4, ligne 2), il a été observé que le résidu K168 a une probabilité plus élevée d’être celui lactylé avec 0,733 sur 1 tandis que K169 n’a une probabilité que de 0,267. HNRNPA1 est un bon exemple de peptide qui devra être aligné pour déterminer le résidu modifié approprié.

Pour valider la lactylation de HNRNPA1 sur la base des résultats du lactylome (Tableau 4), un test IP ciblant cette modification post-traductionnelle a été réalisé. Tout d’abord, pour déterminer quel type de billes présente une interaction optimale avec l’anticorps anti-KL-LA, des billes G et A/G ont été comparées. Après avoir réalisé une IP avec un anticorps KL-LA et suivi d’un WB contre KL-LA, un enrichissement visible des protéines KL-LA a été observé, comparé à l’entrée, comme prévu, avec les deux types de billes (Figure 3). Ces résultats démontrent l’efficacité et la robustesse du protocole dans l’enrichissement des protéines lactylées. Aucune différence marquée n’a été observée entre les deux types de billes testés. Pour valider les cibles identifiées par la SEP, des IPs spécifiques peuvent alors être confirmées. Par exemple, la lactylation de HNRNPA1, identifiée par la EM (Tableau 4), a été calibrée. Une bande spécifique correspondant à HNRNPA1 a été détectée après KL-LA IP et HNRNPA1 WB, indiquant que HNRNPA1 est modifiée par la lactylation (Figure 4). Bien que les billes G et A/G aient immunoprécipité avec succès la protéine cible, un signal de HNRNPA1 plus intense est observé avec les billes A/G, suggérant une affinité ou une récupération accrue.

figure-results-1
Figure 1 : Aperçu du flux de travail pour l’analyse lactylomotique. Abréviations : IP = Immunoprécipitation ; KL-LA = L-lactyllysine ; LC-MS/MS = chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Résultats représentatifs pour certaines protéines obtenues pour le lactylomé des cellules TE11. (A) Nombre total de protéines et de peptides identifiés. Plusieurs sites de lactylation peuvent être identifiés sur la même protéine. (B) Les 5 principaux processus biologiques enrichis pour les protéines lactylées dans les cellules TE11 obtenus à l’aide de la base de données STRING. La valeur p a été corrigée lors de plusieurs tests utilisant Benjamini-Hochberg. Le nombre dans chaque barre représente le nombre de protéines du réseau identifiées comme lactylées sur le total de protéines de cette ontologie génique (GO). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Immunoprécipitation de KL-LA à l’aide de billes G ou A/G et détection de WB dePan-K L-LA dans les cellules TE11. La détection de Pan-KL-LA sert de contrôle crucial pour confirmer l’efficacité et la spécificité de l’immunoprécipitation de ce PTM. Cette expérience garantit que l’IP enrichit avec succès les protéines contenant la modification KL-LA. (*) indique les chaînes lourdes et légères de l’anticorps, comme clairement observé dans IP : voies IgG (IP témoin) (N = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Immunoprécipitation de KL-LA à l’aide de billes G ou A/G et détection de HNRNPA1 par WB. La détection de HNRNPA1 par WB dans les immunoprécipitations spécifiques à KL-LA à l’aide de billes G ou A/G confirme sa lactylation dans les cellules TE11 (N = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

SolutionConcentration finale
Urée8 M
Bicarbonate d’ammonium1 M
HEPES20 mM

Tableau 1 : Tampon de lyse lactylomique. Préparation dans de l’eau de qualité SEP et ajustement du pH à 8.

Solution - Tampon de lavage au lactylomeConcentration finale
NaCl100 mM
EDTA1 mM
Tris-HCl20 mM
Ajouter pour le tampon IP de lactylomeConcentration finale
NP-400.5%

Tableau 2 : Tampon de lavage lactylome et tampon IP. Préparation dans de l’eau de qualité MS et ajustement du pH à 8 pour les deux solutions.

SolutionConcentration finale
Chlorure de sodium100 mM
Fluorure de sodium50 mM
Tris-HCl (pH 7,5)50 mM
β-glycérophosphate40 mM
EDTA (pH 8)5 mM
Glycérol5%
Triton X-1001%
Ajoutez du neuf :
Cocktail inhibiteur de protéase 100X1X
PMSF1 mM
Orthovanadate0,2 mM

Tableau 3 : Lyse/tampon de lavage IP. Il doit être exempt de dénaturants, car ils peuvent déstabiliser la présence des PTM sur les protéines.

Positions au sein des protéinesProtéineNoms de protéinesNoms de gènesNombre de lactylation (K)Probabilités de lactylation (K)Intensité
168P16403Histone H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0,733)K(0,267)1.98E+04
191P16403Histone H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0Protéine de type alpha-2-macroglobuline 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0Homologue protéique Chromobox 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0Homologue protéique Chromobox 3CBX31TTLQK(0,828)MGK(0,172)2,49E+05
112; 141O76095-2JTB protéiqueJTB2K(0,858)ALEK(0,18)VRK(0,962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651Ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

Tableau 4 : Résultats représentatifs pour les peptides lactylés obtenus pour la lignée cellulaire TE11 du carcinome épidermoïde de l’œsophage. Ce tableau est obtenu à la suite de l’analyse MaxQuant.

Discussion

Ce protocole décrit comment l’immunoprécipitation des protéines modifiées par KL-LA peut être utilisée en SEP pour découvrir de nouvelles protéines lactylées et leurs sites de lactylation. Ce protocole lactylomé est réalisé à l’aide de billes conjuguées, mais pourrait être réalisé avec un anticorps KL-LA ou même un anticorps KD-LA selon la question de recherche. Si l’on utilise un anticorps au lieu de billes conjuguées, choisir un anticorps polyclonal facilite la formation de complexes plus serrés car il peut se lier à plusieurs épitopes ; cependant, cette approche peut introduire de la variabilité. Un avantage de l’utilisation de billes conjuguées est qu’elles empêchent l’anticorps de se libérer du support solide - ce qui pourrait contaminer les échantillons de SEP. C’est également plus efficace en termes de temps que d’utiliser un anticorps non conjugué.

De plus, il est important de noter que la quantité de peptides identifiés dans ce type d’analyse peut être influencée par plusieursfacteurs 1. Premièrement, la spécificité des anticorps joue un rôle crucial pour garantir la capture de la protéine correcte. Ajouter une étape de pré-clearing avec des billes d’agarose pourrait permettre de supprimer les interactions non spécifiques. En revanche, on ignore si la lactylation peut affecter la digestion de la trypsine car elle clive le côté c-terminal du résidu d’arginine, mais surtout, le résidu de lysine. Si tel est le cas, cela pourrait potentiellement entraîner une réduction de la couverture peptidique. Il est donc possible d’envisager d’autres options pour les protéases. Dans ce protocole, le paramètre « Max. clivages manqués » est augmenté pour prendre en compte cette limitation. Enfin, la préparation et la manipulation des échantillons, comme l’utilisation de gants pour éviter la contamination des échantillons par des kératines de la peau, par exemple, ou la stabilité de la modification, car le renouvellement PTM est un processus dynamique et parfoisrapide 6, doivent également être envisagées.

Contrairement à l’approche plus large de la SEP qui a conduit à une faible détection de PTM à faible abondance, comme la lactylation, l’identification des peptides enrichis de KL-LA par la protéomique basée sur la SEP permet une analyse détaillée des sites PTM, comme l’identification des sites nouvellement caractérisés de lactylation et des protéineslactylées 19. Western blot peut fournir des informations sur le schéma général de lactylation présent dans les cellules, mais ne peut pas informer sur la lactylation spécifique à la protéine. Ainsi, la IP est l’approche couramment utilisée pour confirmer la détection de PTM20 par la SEP. Le test de ligature de proximité (PLA) est une autre technique pouvant être utilisée pour confirmer la lactylation de cibles potentielles identifiées par la protéomique21. Cette technique peut également indiquer la localisation des protéines modifiées, mais avec une spécificité plus faible. Utiliser une approche IP spécifique à la lactylation est appropriée pour un criblage PTM large, mais il pourrait être intéressant de réaliser une IP spécifique à une protéine selon la question de recherche en question.

Lorsqu’on quantifie la proportion d’une protéine lactylée spécifique dans un extrait protéique total, effectuer une IP seule n’est pas suffisant. Bien que la PI utilisant des billes deL-LA de K permette de capturer des protéines lactylées, elle ne quantifie pas précisément la proportion de lactylation, car elle est limitée à enrichir les protéines cibles. Par conséquent, la spectrométrie de masse est nécessaire, fournissant une analyse plus détaillée permettant une mesure quantitative précise de la lactylation. Ainsi, effectuer la PI d’une protéine potentiellement lactylée à l’aide d’un anticorps contre cette protéine, suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, pourrait déterminer le pourcentage de protéines lactylées dans un échantillon protéique total, tandis que la réalisation de la IP est une approche efficace pour confirmer la lactylation des protéines identifiées comme lactylées par la SEP.

Dans une IP utilisant des anticorps non conjugués, optimiser le rapport billes/anticorps est essentiel pour garantir une capture optimale des protéines lactylées. En effet, l’équilibre entre ces deux composants impacte directement la spécificité et l’efficacité de la PI. Un excès d’anticorps peut entraîner une liaison non spécifique, ce qui augmente le bruit de fond et réduit la précision globale de la détection. En revanche, l’inverse peut entraîner un enrichissement inefficace des protéines cibles, entraînant des signaux plus faibles et une sensibilité réduite. Ces considérations techniques sont essentielles pour obtenir des résultats fiables et précis dans l’étude des protéines lactylées.

Pour conclure, ce protocole peut être utilisé pour surveiller les changements dans les profils de lactylation après la dérégulation de l’homéostasie, comme le cancer 8,10, qui pourraient influencer la réponse liée aux médicaments. L’identification de biomarqueurs pourrait même être réalisée grâce à cette méthode. Applicable à plusieurs lignées cellulaires, types de tissus, et même aux biopsies de patients, cette technique a le potentiel d’approfondir la compréhension de la signalisation cellulaire PTM en cas de maladie ou de conditions normales.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions sincèrement tous les membres du laboratoire Giroux pour leurs discussions scientifiques. Nous remercions la plateforme de protéomique et spectrométrie de masse de la Faculté de médecine et des sciences de la santé de l’Université de Sherbrooke pour ses services et ses orientations. VG est soutenue par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RJPIN-2019-06185) et par les Instituts canadiens de recherche en santé (178171). VG détient la chaire de recherche du Canada niveau 2 en biologie des cellules souches gastro-intestinales. MH est bénéficiaire de bourses du Centre de recherche en inflammation et oncologie digestive de l’Université de Sherbrooke, de l’Université de Sherbrooke-Fondation De Sève, du CRCHUS, du programme TRaIning A New Generation of Researchers in Gastroenterology and LivEr (TRIANGLE) et du FRQ. FMB est boursier de recherche mérite FRQS (366044). VG et FMB sont membres du « Centre de Recherche du CHUS » financé par la FRQS.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 uL Zip Tip C18  ;Pierce87784
Acclamation PepMap100 C18Dionex Corporation1649460,3 mm de diamètre d’identité x 5 mm
Acétonitrile (grade MS)FisherA955-4
Bicarbonate d’ammoniumSigma-AldrichA6141-500
Anticorps monoclonal anti-HNRNPA1Novus Biologicals & nbsp ;NB100-672
Anticorps monoclonal anti-L-Lactyllysine (KL-La)PTM-BioPTM1401RM
Anti-souris IgG, anticorps lié à HRPCST7076S
Anti-IgG du lapin, anticorps lié à HRPCST7074S
Azure 280BiosystèmesAZI280-01
Maillot BCAThermo Fisher ScientificP123227
Albumine sérique de Bovin (BSA)Wisent800-095-EG
Source nanoESI du spray captifBruker Daltonics
ChloroacétamideSigma-AldrichC0267
Substrat ECL occidental Clarity MaxBio-Rad1705062
Dithiothréitol (TDT)Thermo Fisher ScientificR0861
Dynabeads Billons de protéine G pour l’immunoprécipitationThermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-AldrichE9884
Acide formique (FA ; MS)Thermo Fisher ScientificA117-50
GlycérolFisher ScientificBP229-1
HEPES (1M)Wisent330-050-EL
Hypersep C18 colonne 100 mgFisher60108-302
Des billes conjuguées en agarose KL-LAPTM-BioPTM-1404
Laemmli 2X (SDS, Bromophénol)Wisent, J.T. Baker800-100-CG, D293-01
Microtube à faible liaison 0,5 mLSarstedt72.704.600
Microtube à faible liaison 1,5 mLThermo Fisher ScientificP190410
Microtube 1,7 mLAxygèneMCT-175-C
Système HPLC NanoEluteBruker DaltonicsTaille de particule de 1,9 um, 75 μm de diamètre x 25 cm
Anticorps polyclonal IgG IgG de Rabbit normalMillipore Sigma12-370
PepSepBruker Daltonics1811112
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)Wisent311-425-CL
PMSFThermo Fisher Scientific36978
Cocktail inhibiteur de protéase (PIC)Sigma-AldrichP8340-5
Particules magnétiques Sera-Mag SpeedBeads Protéine A/GThermo Fisher Scientific09-981-920
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS9888-500
Fluorure de sodiumSigma-AldrichS1504
Orthovanadate de sodiumSigma-AldrichS6508
TimsTOF pro spectromètre de masse   ;Bruker Daltonics
Acide trifluoroacétique (TFA)Thermo Fisher ScientificA116-50
Tris-HClWisent600-125-IK
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trypsine (grade MS)Pierce90058
UréeThermo Fisher ScientificU15-500
Vaccufuge plusEppendorf22820168
Eau (qualité MS)VWR10803-890A
&bêta ;-glycérophosphateSigma-AldrichG5422
&beta ;-mercaptoéthanolSigma-AldrichM3148

Références

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Mots-clés

Lactylation des prot inesmodification post traductionnelleimmunopr cipitation des peptidesextraction de prot inesdigestion prot iquecellules de carcinome sophagienmodification de la lysinesignalisation cellulaire

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