Ce protocole décrit un système de fixation par transducteur à ultrasons spécialement conçu pour la stimulation par ultrasons de la moelle épinière chez la souris éveillée. La méthode utilise un système de fixation pour assurer un positionnement précis du transducteur à ultrasons tout en permettant aux sujets expérimentaux de se déplacer librement sans compromettre la précision de la stimulation.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Fixation de transducteurs à ultrasons pour la neuromodulation de la moelle épinière chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les ultrasons focalisés (FUS) sont apparus comme une technologie innovante de neuromodulation non invasive démontrant un potentiel significatif pour la régulation neuronale de la moelle épinière. Cependant, la fixation stable du transducteur le long de la colonne vertébrale présente des défis techniques notables. Les méthodes d’immobilisation existantes nécessitent souvent une anesthésie animale prolongée ou démontrent une fiabilité d’adhérence insuffisante. Ces contraintes critiques soulignent le besoin urgent de développer un nouveau paradigme de fixation qui garantisse à la fois la stabilité opérationnelle et la compatibilité physiologique. Ce protocole introduit un système innovant de fixation par transducteur à ultrasons pour la stimulation de la moelle épinière chez les souris éveillées et en mouvement libre. L’établissement d’une méthode fiable pour le placement précis du transducteur à ultrasons sur la colonne vertébrale est essentiel pour les expériences de neurostimulation. Cette méthode intègre trois phases : l’exposition chirurgicale du corps vertébral T13, le meulage précis de l’apophyse épineuse pour créer une interface de contact planaire, et le collage sécurisé de la base métallique et du collimateur sur la colonne vertébrale à l’aide d’un matériau de base de prothèse et d’un mélange adhésif. Il permet des comportements moteurs naturels grâce à des mouvements sans restriction et assure un positionnement stable avec une variation spatiale minimale entre les séances, facilitant l’investigation des interventions de la moelle épinière médiées par échographie dans des modèles animaux conscients. Il est particulièrement pertinent pour les études nécessitant des évaluations comportementales dans la réparation des lésions de la colonne vertébrale, la modulation de la barrière hémato-moelle épinière et les mécanismes de la douleur chronique. En relevant un défi technique critique dans la recherche sur la neuromodulation chez l’animal éveillé, ce protocole offre une interface transducteur-colonne vertébrale stable sans restriction de mouvement, ouvrant la voie à des résultats expérimentaux plus précis et plus fiables.
Introduction
La moelle épinière est une plaque tournante cruciale pour l’intégration de l’information entre les systèmes nerveux central et périphérique, ce qui la rend précieuse pour la recherche clinique dans des domaines tels que la transduction du signal de douleur, la reconstruction du réseau neuronal moteur et la régulation de la neuroplasticité. Les ultrasons focalisés (FUS), une technologie émergente de neuromodulation non invasive, sont devenus un moyen important de régulation neuronale de la moelle épinière. Avec ses caractéristiques physiques de pénétration profonde des tissus, sa résolution spatiale au millimètre près et ses paramètres de production d’énergie contrôlables, son application s’étend de la recherche fondamentale sur les mécanismes neurologiques aux études précliniques de traduction de divers modèles pathologiques de la moelle épinière.
La recherche montre que le FUS peut réguler les circuits neuronaux de la moelle épinière de deux manières : soit en les inhibant, soit en les activant par des effets thermiques et mécaniques. Il se caractérise également par sa réversibilité temporelle et son innocuité pour les tissus 1,2,3. Dans l’étude de modèles de lésions de la moelle épinière, FUS a amélioré la capacité motrice des rats en modulant les réponses inflammatoires et en favorisant la réparation neuronale 4,5,6. De plus, il a été démontré que le FUS ouvre la barrière hémato-moelle épinière et améliore l’efficacité de l’administration locale de médicaments grâce à un effet de cavitation médié par des microbulles 7,8. Dans le domaine de la douleur neuropathique, Liao et al. ont confirmé que le FUS atténue efficacement les manifestations de la douleur neuropathique chez le rat en régulant l’expression de KCC2 et en inhibant la voie KaMKIV KCC29. Song et al. ont démontré que l’application de tsFUS de faible intensité sur la moelle épinière lombaire réduisait significativement l’allodynie mécanique et supprimait l’activation microgliale dans un modèle de lésion de constriction chronique chez le rat10. L’obtention d’une modulation précise de la moelle épinière avec FUS dépend de la stabilité spatiale du système de distribution d’énergie par ultrasons. Les stratégies de fixation actuelles sont principalement divisées en deux catégories : 1) Méthode de fixation rigide : elle permet d’obtenir un positionnement précis en utilisant un cadre stéréotaxique, mais nécessite une anesthésie continue, ce qui supprime l’activité neuronale des sujets expérimentaux et affecte la validité des évaluations comportementales 1,2,3,4,10 ; 2) Méthode de fixation flexible : Il permet des recherches sur des sujets conscients en utilisant un dispositif de ceinture élastique, mais en raison de la grande mobilité de la colonne vertébrale, il y a des erreurs de déplacement et un détachement du transducteur 6,8,9. De plus, l’hétérogénéité géométrique de la lame de la colonne vertébrale entraîne une atténuation significative de l’énergie des ultrasons, réduisant l’efficacité de la modulation neuronale 7,8.
Cette étude propose de manière innovante un schéma de fixation de transducteur à ultrasons focalisés implantable pour la recherche sur la modulation neuronale de la moelle épinière chez des souris conscientes et en mouvement libre. Ce protocole utilise une approche chirurgicale mini-invasive pour intégrer la base métallique, le collimateur et la colonne vertébrale, soutient le port répété du transducteur à ultrasons, assure la cohérence de la cible à ultrasons et maintient l’atténuation de l’énergie ultrasonore à travers la lame dans une plage acceptable. La méthodologie développée répond aux limites critiques des approches existantes, permettant ainsi des expériences de neuromodulation de la moelle épinière plus fiables et reproductibles chez des animaux éveillés et au comportement précoce. Les paramètres clés comprennent une incision médiane de 2,5 cm au niveau T13, une fixation de la base métallique en acier inoxydable et un rapport de volume de 3:1 entre le matériau de base de la prothèse et l’adhésif cyanoacrylate. Les limites comprennent une invasivité chirurgicale modérée et une précision dépendante de l’opérateur dans la préparation de la surface osseuse.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les procédures animales décrites dans la présente étude ont été approuvées par le Comité d’éthique institutionnel de l’expérimentation animale des Instituts de technologie avancée de Shenzhen (numéro de certificat : SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). Toutes les expériences ont utilisé des souris mâles C57BL/6J (âgées de 8 semaines). Les souris pesaient de 18 à 22 g au moment de l’opération.
1. Induction et entretien de l’anesthésie (5 ± 1 min)
- Préchargez le circuit d’anesthésie pendant 5 min.
- Régler la chambre d’induction pour qu’elle délivre 4 % d’isoflurane dans l’air médical à un débit de 2 L/min.
- Passez à la ventilation par masque facial après perte du réflexe de redressement.
- Ajustez le vaporisateur pour maintenir une concentration de 1,5 à 2 % d’isoflurane.
- Maintenez la température corporelle de la souris à l’aide d’une couverture chauffante à 37 °C, avec une plage cible de 36-38 °C tout au long de l’anesthésie.
- Appliquez la pommade ophtalmique Terramycin.
2. Positionnement (1 ± 1 min)
- Utilisez un adaptateur stéréotaxique réglable pour la souris.
- Positionnez la souris en position couchée avec l’alignement de la colonne vertébrale pour maintenir la courbure physiologique de la colonne vertébrale.
- Fixez la tête de la souris à l’aide de barres d’oreille.
- Positionnez les membres de manière symétrique.
3. Préparation du terrain chirurgical (1 ± 1 min)
- Utilisez une tondeuse électrique (écartement des lames de 0,1 mm) pour enlever les poils du site chirurgical.
- Assurez-vous que la zone d’épilation est d’environ 3 cm × 1 cm.
- Effectuez trois passages de tonte dans le sens opposé à la croissance des cheveux.
4. Incision et approche (2 ± 1 min)
- Essuyez la zone avec de l’iodophore 3 fois (intervalles de 30 s).
- Palpez la dernière côte (attachée à la vertèbre T13 chez la souris) et utilisez-la comme
le principal point de repère. Créez une incision de 2,5 cm au niveau des vertèbres T13 le long de
la ligne médiane dorsale à l’aide d’un scalpel. - Disséquer séquentiellement le fascia sous-cutané.
- Exposez les muscles paraspinaux à travers les plans anatomiques.
5. Dissection du muscle paraspinal (5 ± 1 min)
- Réglez le grossissement du microscope chirurgical sur 5x pour une visualisation optimale des muscles paraspinaux et des structures vertébrales.
- Effectuez une dissection nette des muscles paraspinaux à l’aide de micro-ciseaux.
- Réséquer complètement les muscles paraspinaux dorsaux et latéraux tout en préservant les couches musculaires ventrales.
- Gérez les saignements avec de la gaze hémostatique résorbable.
6. Installation de la base métallique (1 ± 1 min)
- Montez la tige de fixation (en plastique) sur l’adaptateur stéréotaxique.
- Montez la base métallique personnalisée (acier inoxydable, 0,28 g) à l’extrémité distale de la tige (Figure 1A).
- Positionnez la base métallique personnalisée bilatéralement au niveau des apophyses transverses vertébrales T13.
- Vérifiez la stabilité de l’accouplement.
7. Préparation de l’interface osseuse (2 ± 1 min)
- Retirer le tissu musculaire résiduel de la lame et des apophyses épineuses au microscope chirurgical.
- Obtenez une hémostase complète grâce à la compression des serments de coton stérile.
- Créez une surface de contact plane à l’aide d’une perceuse à os de précision avec irrigation saline continue. Faites fonctionner la perceuse à une vitesse de 5 000 à 10 000 tr/min pour minimiser la génération de chaleur. Portez un écran oculaire et un masque pendant le forage.
- Enlevez la poussière d’os à l’aide de cotons-tiges imbibés d’une solution saline.
8. Système de fixation d’étanchéité (3 ± 1 min)
- Mélangez les matériaux de base de la prothèse et l’adhésif cyanoacrylate (colle 502) à un rapport de volume de 3:1. Portez des gants en nitrile et des lunettes de sécurité pour éviter tout contact avec la peau et les yeux.
- Fixez le collimateur à ultrasons (plastique, 0,6 g, figure 1B) et la base métallique à la colonne vertébrale à l’aide du mélange adhésif (figure 1C).
- Laisser le mélange adhésif durcir dans des conditions ambiantes contrôlées (24 ± 1 °C, 40-60 % d’humidité relative). Maintenir le positionnement statique pendant 60 s jusqu’à la confirmation visuelle de la solidification complète (perte de brillance de surface et formation d’une interface rigide).
- Séparez la base métallique de la tige de fixation en plastique.
- Vérification de la stabilité de la fixation : Appliquez une légère force de rotation sur la base métallique dans le plan horizontal. Observez l’interface collimateur-vertèbre sous un grossissement de 5x pour tout déplacement (tolérance de <0,1 mm). Si le mouvement dépasse la tolérance, réappliquez le mélange d’adhésif (étape 8.2) et répétez le durcissement (étape 8.3).
9. Fermeture de la plaie (1 ± 1 min)
- Alignez les bords enroulés pour encapsuler complètement la base métallique.
- Effectuez des sutures interrompues avec des sutures en soie 4-0.
- Essuyez l’incision avec de l’iodophore.
- Éliminez les débris sanguins et osseux résiduels à l’intérieur du site d’exposition laminaire du collimateur et remplissez-le de coton stérile pour l’étanchéité et l’hémostase.
10. Prise en charge postopératoire
- Thermorégulation : Maintenir la souris sur une couverture chauffante (37°C) jusqu’à la récupération complète de la marche (généralement 2-3 h après l’anesthésie).
- Antibioprophylaxie postopératoire : Administrer de la céfazoline sodique (50 mg/kg, dissoute dans une solution saline à 0,9 % jusqu’à une concentration de 50 mg/mL) par injection sous-cutanée dans la région dorsale du cou immédiatement après la chirurgie.
- Maintenez l’hygiène des plaies. Nettoyez la plaie à l’aide d’un coton-tige imbibé d’une solution saline une fois par jour pendant les 3 premiers jours et effectuez une inspection quotidienne du site chirurgical à la recherche de signes d’infection, de déhiscence ou d’inflammation.
- Analgésie postopératoire : Administrer du carprofène (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) toutes les 12 h pendant 3 jours après l’interventionchirurgicale 11.
REMARQUE : La figure 1D montre le système de fixation implanté dans une souris vivante après la récupération.
11. Élimination des déchets dangereux
- Recueillir la poussière d’os et les matières contaminées par le sang dans des sacs étanches étiquetés avec les symboles « Risque biologique » pour les transférer dans une installation d’élimination des déchets médicaux autorisée.
- Placez le matériau de base de prothèse dentaire non polymérisé et les résidus de colle 502 dans des contenants scellés résistants aux produits chimiques étiquetés « Déchets chimiques », et stockez-les dans une armoire ventilée désignée pour élimination conformément aux protocoles de gestion des déchets chimiques.
- Jetez les aiguilles, les lames de scalpel et les forets à os dans des contenants pour objets tranchants résistants à la perforation marqués d’étiquettes « Risque biologique ».
12. Avertissements de sécurité
- Lors de la manipulation de matériaux à base de prothèses dentaires, évitez tout contact direct avec la peau en portant des gants en nitrile et des lunettes de sécurité, et effectuez le mélange et le durcissement dans une hotte bien ventilée pour minimiser l’inhalation de monomères volatils.
- Éliminer les matières résiduelles comme déchets chimiques conformément aux directives de l’établissement. Pour les adhésifs cyanoacrylate 502, évitez tout contact avec la peau ou les yeux et rincez immédiatement à l’eau pendant 15 minutes en cas d’exposition, en cherchant une aide médicale. Utilisez-les dans des endroits ventilés, rangez-les dans des endroits frais et secs, à l’abri des sources d’inflammation, et évitez tout contact avec des tissus en coton ou en laine.
- Lorsque vous utilisez des perceuses de précision, fixez la pièce à main, portez un écran facial et un masque chirurgical, et irriguez le site de forage avec une solution saline pour éviter les blessures thermiques.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Test en champ ouvert
Le test en plein champ a été conçu pour évaluer les changements de comportement potentiels chez les souris après une intervention chirurgicale (Figure 2A). Une chambre standard à champ ouvert de 40 cm × 40 cm a été utilisée pour assurer un espace d’activité suffisant pour les souris tout en maintenant des conditions environnementales relativement constantes et en minimisant les interférences externes. L’expérience s’est déroulée en deux phases : préop...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Cette étude présente un nouveau protocole de couplage vertébral qui facilite la neuromodulation précise de la moelle épinière par ultrasons chez des souris éveillées et se comportant librement. Contrairement aux approches de fixation conventionnelles, cette méthodologie surmonte les limites des approches de fixation conventionnelles. Contrairement aux cadres stéréotaxiques rigides nécessitant une anesthésie continue (qui supprime l’activité neuronale et complique les évaluations comporte...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu en partie par le High-Level Talent Scientific Research Startup Project de l’hôpital de l’Université de Hong Kong-Shenzhen dans le cadre de la subvention HKUSZH202207003. Nous remercions sincèrement tous les membres du laboratoire pour leur aide dans l’optimisation des protocoles et les soins aux animaux, ainsi que l’Institut de technologie avancée de Shenzhen, Académie chinoise des sciences (SIAT), pour leur soutien institutionnel.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chambre d’induction d’anesthésie | Propulsion de Shenzhen | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Adhésif cyanoacrylate (colle 502) | Usine chimique de Pékin | https://item.taobao.com/item.htm ? detail_redpacket_pop=vrai& id=736 869038961& ltk2=1752156592779 mdbp47qqp4vyv57mq156e& ns=1& priceTId=214780251752156543206 3926e1996& query=502 %E8%83 % B6 %E6 %B0 %B4%20 %E5%8C %97 %E4 %BA %AC %E5%8C %96 %E5 % B7 %A5 %E5%8E %82& skuId=52584 34238219 | |
| Matériaux de base de prothèse | Dentaire du Nouveau Siècle | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| Tige de fixation | Coutume | ||
| L’isoflurane | Propulsion de Shenzhen | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Base en métal | Coutume | ||
| Microinstrument ; | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | ||
| Perceuse de précision | Propulsion de Shenzhen | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Système d’anesthésie multicanal pour petits animaux | Propulsion de Shenzhen | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| Adaptateur stéréotaxique pour souris et rats juvéniles | Changsha Mayue | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =true& id=651346369142& ltk2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 & ns=1& priceTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query= %E8%84 %91 %E7 %AB %8B %E4 %BD %93 %E5 %AE % 9A %E4 %BD %8D %E4 %BB %AA %20 % E9%95 %BF %E6 %B2%99 %E8 %BF % 88 %E8 %B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam= %7B %22aplus_abtest % 22%3A %22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobaoSearch | |
| Microscope chirurgical | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Suture chirurgicale (Prolene) | Ethicon (Johnson & Johnson) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =true& id=774292384846& ltk2= 1752157506907c0321finubb5 rpkub6av6n& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& query= %E5 %BC %B A %E7%94%9F %E7 %BC %9D %E7 %BA %BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.hoverI | |
| Pommade ophtalmique Terramycine | Pfizer | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| Collimateur à ultrasons | Coutume |
Références
- Song, W., et al. Transspinal focused ultrasound suppresses spinal reflexes in healthy rats. Neuromodulation. 27 (4), 614-624 (2024).
- Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (7), 1992-2001 (2023).
- Kim, E., Kum, J., Kim, H. Trans-spinal focused ultrasound stimulation selectively modulates descending motor pathway. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 30, 314-320 (2022).
- Hong, Y. -R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Sci Rep. 12 (1), 3636(2022).
- Hwang, B. Y., et al. Ultrasound in traumatic spinal cord injury: A wide-open field. Neurosurgery. 89 (3), 372-382 (2021).
- Liao, Y. -H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the l4-l5 sections of rats following spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 16, 882127(2022).
- Payne, A. H., et al. Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability. Neural Regen Res. 12 (12), 2045-2049 (2017).
- Fletcher, S. -M. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
- Liao, Y. -H., Wang, B., Chen, M. -X., Liu, Y., Ao, L. -J. Lifu alleviates neuropathic pain by improvingthe kcc2 expression and inhibiting the camkiv-kcc2 pathway in the l4-l5 section of the spinal cord. Neural Plast. 2021, 6659668(2021).
- Song, W., Giannotti, A., Bekiaridou, A., Bloom, O., Zanos, S. Low intensity trans-spinal focused ultrasound reduces mechanical sensitivity and suppresses spinal microglia activation in rats with chronic constriction injury. Bioelectron Med. 11 (1), 8(2025).
- Glasenapp, A., Bankstahl, J. P., Bähre, H., Glage, S., Bankstahl, M. Subcutaneous and orally self-administered high-dose carprofen shows favorable pharmacokinetic and tolerability profiles in male and female C57bl/6j mice. Front Vet Sci. 11, 1430726(2024).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
