Article de méthode

Techniques multi-omiques pour le profilage des transitions d’état de la chromatine dans les cholangiocytes primaires de souris à faible entrée

DOI :

10.3791/68606

⸱

3 juillet 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit présente un protocole complet pour le ChIP-seq à faible entrée afin de profiler les modifications des histones et l’ATAC-seq pour évaluer l’accessibilité de la chromatine dans de petites quantités de cholangiocytes primaires de souris.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La polykystose hépatique (DLP) est une maladie héréditaire caractérisée par la formation de kystes remplis de liquide dérivés des cholangiocytes, entraînant une maladie progressive et une réduction significative de la qualité de vie des patients. Les traitements actuels de la DLP sont inadéquats, ce qui souligne la nécessité de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le rôle de la régulation épigénétique dans la progression de la DLP, en particulier l’accessibilité de la chromatine et les modifications des histones, reste sous-exploré. Les techniques traditionnelles de profilage épigénétique, telles que le ChIP-seq et le DNase-seq, nécessitent un grand nombre de cellules, qui sont difficiles à obtenir à partir de cholangiocytes primaires. Pour résoudre ce problème, nous avons optimisé les protocoles ChIP-seq et ATAC-seq à faible entrée pour un faible nombre de cholangiocytes primaires. Ces approches permettent d’analyser les modifications des histones et l’accessibilité de la chromatine avec une entrée cellulaire minimale. Le ChIP-seq à faible entrée utilise la nucléase micrococcique (MNase) pour la fragmentation de l’ADN, tandis que l’ATAC-seq utilise la transposase Tn5 pour capturer les régions ouvertes de la chromatine. Ces techniques multi-omiques fournissent des informations précieuses sur la dynamique de l’état de la chromatine lors des transitions du destin des cholangiocytes dans la DLP et d’autres maladies biliaires. Il est important de noter que les protocoles optimisés sont applicables en toute confiance à d’autres cellules primaires à faible entrée, ce qui permet d’explorer les mécanismes épigénétiques dans divers contextes cellulaires. Ce travail présente une approche systématique pour l’étude des altérations de l’état de la chromatine, contribuant au développement de stratégies thérapeutiques basées sur l’épigénétique pour la DLP et les maladies apparentées.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La DLP est une maladie héréditaire caractérisée par le développement de plusieurs kystes remplis de liquide dérivés des cholangiocytes. Au fur et à mesure que ces kystes s’étendent, ils ont un impact sévère sur la qualité de vie despatients1,2. Les stratégies de traitement existantes pour la DLP sont inadéquates, n’offrant que des avantages limités tout en conduisant fréquemment à des taux de récidive et de complications élevés 3,4. Par conséquent, il existe un besoin urgent d’approches thérapeutiques plus sûres et plus efficaces pour relever les défis cliniques non résolus dans le traitement de la DLP.

Dans des conditions normales, les cholangiocytes restent au repos, tandis que dans la DLP, ils présentent une prolifération excessive, un facteur clé de la progression de la maladie 5,6. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette transition kystique restent incertains. Bien que la régulation épigénétique, y compris l’accessibilité de la chromatine et les modifications des histones, joue un rôle essentiel dans les transitions du destin cellulaire 7,8, son rôle dans la progression de la DLP reste sous-étudié. Cependant, de nombreuses techniques de profilage épigénétique nécessitent un grand nombre de cellules. Le ChIP-seq traditionnel, qui repose sur la fragmentation de la chromatine par sonication, ainsi que sur les tests d’accessibilité de la chromatine tels que DNase-seq et MNase-seq, nécessite généralement plus de 106 cellules, ce qui dépasse de loin le nombre pouvant être obtenu à partir de cholangiocytes primaires.

Ce manuscrit fournit un protocole complet pour le ChIP-seq 9,10,11 à faible entrée afin de profiler les modifications des histones et l’ATAC-seq 11,12,13 pour évaluer l’accessibilité de la chromatine dans un petit nombre de cholangiocytes primaires. Le ChIP-seq à faible entrée utilise la MNase pour fragmenter l’ADN9, tandis que l’ATAC-seq capture les fragments d’ADN des régions ouvertes de la chromatine à l’aide de la transposase Tn512. L’analyse multi-omique utilisant ces approches offre des informations précieuses sur la dynamique de l’état de la chromatine pendant les transitions du destin des cholangiocytes dans la DLP et d’autres maladies biliaires, facilitant ainsi le développement de thérapies ciblées sur l’épigénétique.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation des solutions et des cholangiocytes pour l’ATAC-seq

  1. Au moins 1 jour avant l’expérience ATAC-seq, préparez le tampon de lyse ATAC à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 1.
    REMARQUE : Le tampon de lyse ATAC peut être stocké à 4 °C dans l’obscurité pendant au moins 1 mois.
  2. Pour les cholangiocytes primaires14 fraîchement isolés, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre immédiatement après l’isolement et procédez à l’expérience ATAC-seq.
    REMARQUE : Le plus tôt sera le mieux pour minimiser l’impact sur la viabilité cellulaire. Cependant, s’il est maintenu sur la glace, il n’est généralement pas difficile de progresser dans les 2 heures.

2. ATAC-seq

REMARQUE : Utilisez 100 000 cholangiocytes pour ATAC-seq. Gardez les échantillons et les solutions sur de la glace. Pour l’expérience ATAC-seq, l’ensemble de la procédure prend environ 2 jours.

  1. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min à 4 °C.
  2. Jetez le surnageant, ajoutez 200 μL de tampon de lyse ATAC contenant un inhibiteur de protéase, pipetez doucement pour mélanger et incubez sur de la glace pendant 20 min. Pendant les 10 premières minutes, pipeter doucement pour mélanger.
  3. Centrifugeuse à 1 500 × g pendant 10 min à 4 °C.
  4. Préparez le tampon de réaction de transposition (50 μL) en mélangeant 3 μL de mélange d’enzymes du kit de préparation de banque d’ADN ATAC, 10 μL de tampon 5x du kit de préparation de banque d’ADN ATAC et 37 μL d’eau sans nucléase. Mélanger.
  5. Jetez soigneusement le surnageant, placez la pastille nucléaire recueillie sur de la glace et ajoutez immédiatement 50 μL de tampon de réaction de transposition. Remettre doucement en suspension et incuber à 37 °C pendant 60 min, en retournant le fond du tube toutes les 10 minutes pour mélanger.
    REMARQUE : Préparez le tampon de réaction de transposition avant de jeter le surnageant pour éviter que les cellules ne se dessèchent.
  6. Purifiez l’ADN à l’aide du kit de purification PCR selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Les billes résiduelles de la protéine G du processus d’isolement des cholangiocytes14 ont pu être retirées au cours de cette étape. Les échantillons d’ADN peuvent être conservés à -80 °C pour une conservation à long terme.
  7. Effectuez la construction de la bibliothèque à l’aide du kit de préparation de bibliothèque d’ADN ATAC conformément aux instructions du fabricant.
    REMARQUE : Conservez tous les échantillons et solutions sur de la glace, sauf indication contraire. Bien que les procédures puissent différer d’une marque de kit à l’autre, toutes sont compatibles avec notre protocole.
    1. Enrichissement par PCR : Préparez le mélange d’enrichissement par PCR (50 μL) dans un tube PCR en mélangeant les composants suivants dans l’ordre spécifié : 10 μL d’échantillon d’ADN (à partir de l’étape 2.6), 14 μL d’eau sans nucléase, 10 μL de 5x TAB, 5 μL de PPM, 1 μL de TAE, 5 μL d’amorce P5 et 5 μL d’amorce P7. Pipeter doucement pour mélanger.
    2. Transférez le tube dans un instrument de PCR et exécutez le programme suivant : (72 °C pendant 3 min) x 1 cycle, (98 °C pendant 30 s) x 1 cycle, (98 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 3 min) x 15 cycles, et (72 °C pendant 5 min) x 1 cycle, et maintenez à 4 °C.
    3. Purification : Amenez les billes DNA Clean à température ambiante pendant 30 min avant de les utiliser, puis effectuez une purification magnétique en deux étapes.
      1. Premier tour : Ajouter 30 μL de billes DNA Clean aux produits de PCR (à partir de l’étape 2.7.2), pipeter doucement pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placez le tube PCR sur un séparateur magnétique et attendez que la solution devienne claire (~5 min). Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube et jetez les billes d’ADN Clean.
      2. Deuxième tour : Ajouter 7,5 μL de billes d’ADN Clean au surnageant recueilli (à l’étape 2.7.3.1), pipeter doucement pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placez le tube sur un séparateur magnétique et attendez que la solution devienne claire (~5 min). Jetez soigneusement le surnageant.
    4. Maintenez le tube sur le séparateur magnétique et rincez les billes DNA Clean pendant 2 x 30 s avec 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant après chaque rinçage. Avec le tube toujours sur le séparateur magnétique, ouvrez le couvercle du tube et faites sécher les billes à l’air libre pendant 10 min. Enfin, ajoutez 22 μL d’eau sans nucléase pour éluer l’ADN.
      REMARQUE : Les échantillons d’ADN peuvent être conservés à -80 °C pour une conservation à long terme.
  8. Séquencez les bibliothèques à l’aide d’un séquenceur standard de nouvelle génération.
    REMARQUE : Nous vous recommandons d’obtenir au moins 50 millions de lectures d’extrémité de paire.

3. Préparation de solutions et de cholangiocytes pour le ChIP-seq à faible apport

  1. Au moins 1 jour avant l’expérience ChIP-seq à faible entrée, préparez le tampon de lyse ChIP, le tampon MNase ChIP, le tampon d’arrêt ChIP, le tampon RIPA ChIP 2x, le tampon ChIP RIPA et le tampon LiCl ChIP à l’aide des réactifs répertoriés dans le Tableau 2, le Tableau 3, le Tableau 4 et le Tableau 5.
    REMARQUE : Les solutions ci-dessus peuvent être conservées à 4 °C pendant au moins 1 mois.
  2. Pour les cholangiocytesprimaires 14 fraîchement isolés, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre immédiatement après l’isolement et procéder à l’expérience ChIP-seq à faible entrée.
    REMARQUE : Le plus tôt sera le mieux pour minimiser l’impact sur la viabilité cellulaire. Cependant, s’il est maintenu sur la glace, il n’est généralement pas difficile de progresser dans les 2 heures.

4. Jour 1 du ChIP-seq à faible apport : lyse cellulaire, digestion de la MNase et incubation d’anticorps

REMARQUE : Pour l’expérience ChIP-seq à faible entrée, l’ensemble de la procédure prend environ 3 jours.

  1. Divisez les cholangiocytes en aliquotes de 100 000 cellules par tube et conservez les échantillons et les solutions sur de la glace.
    REMARQUE : Si vous effectuez une expérience ChIP-seq à faible entrée pour plusieurs modifications d’histones, il est acceptable d’augmenter le volume proportionnellement avant d’ajouter l’anticorps de modification d’histones. Les volumes de réactif dans les étapes suivantes sont basés sur un tube contenant 1 × 105 cellules.
  2. Centrifuger à 2 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
  3. Jeter le surnageant, ajouter 19 μL de tampon de lyse ChIP contenant un inhibiteur de protéase, pipeter doucement pour mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min. Évitez de générer des bulles.
  4. Ajouter 19 μL de tampon ChIP MNase et pipeter doucement pour mélanger.
  5. Ajouter 2 μL de MNase (0,01 U/μL) et pipeter doucement pour mélanger. Incuber à 37 °C pendant 5 min.
    REMARQUE : Le temps d’incubation est critique. La concentration finale de MNase est de 0,0005 U/μL. La concentration optimale de MNase peut être déterminée en fonction du type et du nombre de cellules.
  6. Placez immédiatement l’échantillon sur de la glace, ajoutez 5 μL de tampon ChIP STOP pour terminer la digestion et pipetez doucement pour mélanger.
  7. Ajouter 45 μL de tampon ChIP 2x RIPA contenant un inhibiteur de protéase, pipeter doucement pour mélanger et incuber davantage sur de la glace pendant 10 min.
  8. Centrifugeuse à 20 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Transférez lentement le surnageant dans un nouveau tube.
    REMARQUE : Les billes résiduelles de la protéine G du processus d’isolement des cholangiocytes14 ont pu être retirées au cours de cette étape.
  9. Ajouter 40 μL de tampon ChIP RIPA.
  10. Pour les échantillons d’immunoprécipitation (IP), ajoutez 1 μg d’anticorps par échantillon et incubez la suspension sur un rotateur (20 tr/min) à 4 °C pendant la nuit.
  11. Pour les échantillons d’entrée, n’ajoutez pas d’anticorps et incubez la suspension sur un rotateur (20 tr/min) à 4 °C pendant la nuit.

5. Jour 2 du ChIP-seq à faible apport : immunoprécipitation, lavage et élution

REMARQUE : Pour les échantillons IP, suivez les étapes 5.1 à 5.7. Pour les échantillons d’entrée, suivez les étapes 5.8 à 5.12.

  1. Prélaver les billes de protéine G avec 1 mL de tampon ChIP RIPA glacé.
  2. Ajouter 400 μg de billes de protéine G aux échantillons et incuber à rotation (20 tr/min) à 4 °C pendant 2 h.
  3. Laver les billes pendant 5 x 5 min avec 150 μL de tampon ChIP RIPA glacé pendant 5 min à 4 °C sur un rotateur (20 tr/min). Retirez le surnageant à l’aide d’un séparateur magnétique.
  4. Lavez les billes avec 150 μL de tampon LiCl ChIP glacé pendant 5 min à 4 °C sur un rotateur (20 tr/min). Retirez le surnageant à l’aide d’un séparateur magnétique.
  5. Ajouter 30 μL de tampon d’élution ChIP (29 μL d’eau sans nucléase et 1 μL de protéinase K) pour remettre les billes en suspension et agiter à 900 tr/min à 55 °C pendant 90 min. Agitez doucement le tube périodiquement pour maintenir les billes en suspension.
  6. Récupérez le surnageant à l’aide d’un séparateur magnétique et transférez-le lentement dans un nouveau tube. Incuber à 72 °C pendant 40 min pour inactiver la protéinase K.
  7. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre.
    REMARQUE : Les échantillons d’ADN peuvent être conservés à -80 °C pour une conservation à long terme.
  8. Pour les échantillons d’entrée, ajouter 1 μL de protéinase K et agiter à 900 tr/min à 55 °C pendant 90 min.
  9. Purifier l’ADN par extraction au phénol-chloroforme. Ajouter 130 μL de réactif d’extraction d’ADN et agiter vigoureusement jusqu’à ce que la solution devienne rose. Centrifugeuse à 20 000 × g pendant 5 min.
  10. Transférez le surnageant dans un nouveau tube, ajoutez 130 μL d’isopropanol glacé, puis ajoutez 1 μL de glycogène et 6,5 μL de NaAc 3M. Centrifugeuse à 20 000 × g pendant 15 min.
  11. Jetez le surnageant, lavez-le une fois avec 1 ml d’éthanol à 70 % et centrifugez-le à 20 000 × g pendant 15 min. Faites sécher la pastille et mettez-la en suspension dans 30 μL d’eau sans nucléases.
  12. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre.
    REMARQUE : Les échantillons d’ADN peuvent être conservés à -80 °C pour une conservation à long terme.

6. Jour 3 du ChIP-seq à faible intrant : construction de la bibliothèque et séquençage

  1. Effectuez la construction de la bibliothèque à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque d’ADN ChIP selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Les étapes comprennent la préparation de l’extrémité, la ligature de l’adaptateur et l’amplification de la bibliothèque. Pipette 5 ng d’échantillons ChIP (échantillons d’entrée et IP) pour la construction de bibliothèques. Conservez tous les échantillons et solutions sur de la glace, sauf indication contraire. Bien que les procédures puissent différer d’une marque de kit à l’autre, toutes sont compatibles avec notre protocole.
  2. Préparation finale : Préparez le tampon de réaction de préparation finale (65 μL) dans un tube PCR en mélangeant 5 ng d’échantillon d’ADN (de l’étape 5.6 ou de l’étape 5.11), 15 μL de mélange de préparation finale 4, 6,5 μL de Tris EDTA et de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume final de 65 μL. Pipeter doucement pour mélanger. Transférez le tube dans un instrument PCR et exécutez le programme suivant : 20 °C pendant 15 min, 65 °C pendant 15 min et maintenez à 4 °C (couvercle chaud : 105 °C).
  3. Ligature de l’adaptateur : Diluez l’adaptateur d’ADN S dans un rapport de 1:100. Préparez le tampon de réaction de ligature de l’adaptateur (100 μL) dans un tube PCR en mélangeant 65 μL de produits de préparation d’extrémité (à partir de l’étape 6.2), 25 μL de tampon de ligature rapide 2, 5 μL d’ADN ligase rapide et 5 μL d’adaptateur d’ADN S dilué. Transférez le tube dans un instrument PCR et exécutez le programme suivant : 20 °C pendant 15 min, suivi d’un maintien à 4 °C (couvercle chaud : 105 °C).
  4. Purification:
    1. Amenez les billes DNA Clean à température ambiante pendant 30 minutes avant de les utiliser. Ajoutez 60 μL de billes DNA Clean aux produits Adapter Ligation (à partir de l’étape 6.3). Pipeter doucement pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    2. Placez le tube PCR sur un séparateur magnétique et attendez que la solution devienne claire (~5 min). Jetez soigneusement le surnageant.
    3. Gardez le tube sur le séparateur magnétique. Rincez les billes DNA Clean pendant 2 x 30 s avec 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant après chaque rinçage.
    4. Avec le tube toujours sur le séparateur magnétique, ouvrez le couvercle du tube et faites sécher les billes à l’air libre pendant 5 min. Enfin, ajoutez 22,5 μL de 10 mM de Tris-HCL (PH 8,0) pour éluer l’ADN.
  5. Amplification de la bibliothèque : Préparez le tampon de réaction d’amplification de la bibliothèque (50 μL) dans un tube PCR en mélangeant 20 μL de produits de purification (à partir de l’étape 6.4), 2,5 μL d’amorce PCR i5, 2,5 μL d’amorce PCR i7 et 25 μL de mélange d’amplification. Pipeter doucement pour mélanger. Transférez le tube dans un instrument de PCR et exécutez le programme suivant : (95 °C pendant 3 min) x 1 cycle, (98 °C pendant 20 s, 60 °C pendant 15 s, 72 °C pendant 30 s) x 18 cycles, (72 °C pendant 5 min) x 1 cycle et maintenez à 4 °C.
  6. Purification : Amenez les billes DNA Clean à température ambiante pendant 30 min avant de les utiliser, puis effectuez une purification magnétique en deux étapes.
    1. Premier tour : Ajoutez 30 μL de billes d’ADN propre aux produits d’amplification de la bibliothèque (à partir de l’étape 6.5). Pipeter doucement pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placez le tube PCR sur un séparateur magnétique et attendez que la solution devienne claire (~5 min). Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube et jetez les billes d’ADN Clean.
    2. Deuxième tour : Ajouter 7,5 μL de billes d’ADN propre au surnageant recueilli. Pipeter doucement pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placez le tube sur un séparateur magnétique et attendez que la solution devienne claire (~5 min). Jetez soigneusement le surnageant. Gardez le tube sur le séparateur magnétique. Rincez les billes DNA Clean pendant 2 x 30 s avec 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant après chaque rinçage. Avec le tube toujours sur le séparateur magnétique, ouvrez le couvercle du tube et faites sécher les billes à l’air libre pendant 10 min. Enfin, ajoutez 22,5 μL de 10 mM de Tris-HCl (PH 8,0) pour éluer l’ADN.
      REMARQUE : Les échantillons d’ADN peuvent être conservés à -80 °C pour une conservation à long terme.
  7. Séquencez les bibliothèques dans un séquenceur standard de nouvelle génération.
    REMARQUE : Nous vous recommandons d’obtenir au moins 10 à 20 millions de lectures de fin de paire.

7. Analyse des données de l’ATAC-seq et du ChIP-seq à faible entrée

  1. Préparation de l’environnement virtuel d’analyse (miniconda)
    1. Téléchargez Miniconda3 à partir du site Web à l’aide des commandes suivantes et suivez les instructions d’installation de Miniconda.
      WGET https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. Créez un environnement virtuel pour le pipeline d’analyse d’ATAC-seq et de ChIP-seq.
      conda create -n NGSpipeline
      conda activate NGSpipeline
      conda install bioconda ::fastqc bioconda ::multiqc bioconda ::trim-galore bioconda ::bowtie2 bioconda ::samtools bioconda ::macs2 bioconda ::d eeptools bioconda ::p icard bioconda ::igv
    3. Téléchargez le fichier de séquence du génome de référence et créez un indice d’alignement pour l’alignement du nœud papillon2.
      WGET https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      Gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. Effectuez le contrôle qualité des lectures ATAC-seq et ChIP-seq avec FastQC et résumez le rapport de contrôle qualité à l’aide de MultiQC pour garantir le biais GC des résultats de séquençage et une complexité de bibliothèque suffisante pour l’analyse en aval. Écartez la bibliothèque de séquences avec des résultats de contrôle qualité différents significatifs.
    fastqc -o ......
    multiqc
  3. Adaptateur de séquençage de trim à l’aide de trim abondamment.
    trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j -o
  4. Mappez les lectures tronquées à l’assemblage du génome de référence mm10 avec Bowtie2 en utilisant les paramètres par défaut, et transmettez les paramètres d’ajout (--très-sensible -X 2000) à bowtie2 pour ATAC-seq en raison de la large distribution de longueur du fragment ATAC-seq.
    1. Pour ATAC-seq :
      Bowtie2 -P --très-sensible -X 2000 -x -1 -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
    2. Pour ChIP-seq :
      Bowtie2 -P -x -1 1> -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
  5. Supprimez les lectures avec un faible score d’alignement (q30) et les lectures alignées sur le génome des mitochondries et le chromosome non standard.
    samtools view -bh -q 30 -f 2 | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'aléatoire' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o
  6. Utilisez la commande Picard MarkDuplicates pour supprimer les lectures de doublons PCR.
    picard MarkDuplicates I= O= M= REMOVE_DUPLICATES=true
  7. Appelez peak à l’aide de la commande callpeak MACS2 avec le paramètre -f BAMPE -g mm -B -q 0.01.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t -g mm -n -B -q 0.01
  8. Générez des fichiers BigWig à l’aide de la commande BamCoverage de Deeptools.
    Samtools Index -@ 4
    bamCoverage -b     -o -bs 50 -p --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
  9. Utilisez le navigateur génomique IGV pour afficher le fichier narrowPeak de macs2 et les fichiers BigWig de Deeptools BamCoverage.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour générer le paysage chromatinique des cholangiocytes primaires, nous avons optimisé les protocoles ChIP-seq et ATAC-seq pour un faible nombre (~100 000) de cholangiocytes primaires. Les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose pour les cholangiocytes primaires ont indiqué que pour 1 × 105 cholangiocytes primaires, 0,02 U MNase à 37 °C pendant 5 min a entraîné la production de mononucléosomes, ce qui a été identifié comme la concentration optimale (figure 1).

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour cartographier de manière systématique et exhaustive la dynamique de l’état de la chromatine sous-jacente à la transition d’état des cholangiocytes kystiques, nous avons réussi à optimiser le ChIP-seq et l’ATAC-seq à faible entrée pour un nombre limité de cholangiocytes primaires. Bien que cette étude se soit concentrée sur les cholangiocytes primaires, nous sommes convaincus que le protocole peut également être appliqué à d’autres cellules primaires à haute viabilité dont la disponi...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82402166 à R.J.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH=7,5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH=8,0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
BiosharpBS081
ATAC DNA Library Kit de préparationVazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M stock
Bibliothèque d’ADN ChIP Kit de préparationVazymeND607
ADN Perles propresVazymeN411
Réactif d’extraction d’ADNSolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 mM (pH = 8) stock
FluorimètreInvitrogenQ33226
GlycogèneThermo ScientificR0561
HémocytomètreQIUJINGXB. K.25.
Igepal CA-630SigmaI889610 % stock
Séparateur magnétiquePromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881,5 M stock
MNaseSigmaN37550,01 U/µ ; L stock
NaClSangon BiotechA6104765 M stock
NP40SolarbioN8030
Eau sans nucléaseLife TechnologiesAM9937
Instrument PCRApplied Biosystems4484073
Kit de purification PCRQIAGEN28106
Inhibiteur de protéaseRoche
Protéines G billesInvitrogen10004D
Protéinase KTransGenGE201-01
RotateurKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010 %
Désoxycholate de sodiumSigmaS1827
Thermomixer comfortEppendorf5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220
Software>Citation (PMID)/EntrepriseVersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
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MinicondaAnaconda4.7.12.1https://www.anaconda.com/
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trim-abonde0.6.6https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
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Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: Advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
  2. Olaizola, P., et al. Genetics, pathobiology and therapeutic opportunities of polycystic liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (9), 585-604 (2022).
  3. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  4. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Therapeutic targets in polycystic liver disease. Curr Drug Targets. 18 (8), 950-957 (2017).
  5. Caballero-Camino, F. J., et al. Synthetic conjugates of ursodeoxycholic acid inhibit cystogenesis in experimental models of polycystic liver disease. Hepatology. 73 (1), 186-203 (2021).
  6. Masyuk, A. I., Masyuk, T. V., Trussoni, C. E., Pirius, N. E., Larusso, N. F. Autophagy promotes hepatic cystogenesis in polycystic liver disease by depletion of cholangiocyte ciliogenic proteins. Hepatology. 75 (5), 1110-1122 (2022).
  7. Meng, Y., et al. Epigenetic programming defines haematopoietic stem cell fate restriction. Nat Cell Biol. 25 (6), 812-822 (2023).
  8. Perino, M., Veenstra, G. J. Chromatin control of developmental dynamics and plasticity. Dev Cell. 38 (6), 610-620 (2016).
  9. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification h3k4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  10. Brind'amour, J., et al. An ultra-low-input native chip-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).
  11. Liu, Z., Zhang, L., Chen, Y. Epigenomic, cistromic, and transcriptomic profiling of primary kidney tubular cells. J Biol Methods. 11 (2), e99010015(2024).
  12. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by atac-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  14. Ji, R., Qing, B., Chen, J., Zhao, Z., Zhang, L. Isolation and culture of primary cholangiocytes from mice with polycystic liver disease using a two-step digestion method. J Vis Exp. (219), e68202(2025).
  15. Spirli, C., et al. Cyclic amp/pka-dependent paradoxical activation of raf/mek/erk signaling in polycystin-2 defective mice treated with sorafenib. Hepatology. 56 (6), 2363-2374 (2012).
  16. Lin, T. C. Runx1 and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (3), 188715(2022).
  17. Spirli, C., et al. Mammalian target of rapamycin regulates vascular endothelial growth factor-dependent liver cyst growth in polycystin-2-defective mice. Hepatology. 51 (5), 1778-1788 (2010).
  18. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).

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