Microscopie de localisation par ultrasons pour la cartographie à super-résolution de la microvascularisation cérébrale des rongeurs

Résumé

La microscopie de localisation par ultrasons (ULM) est une technique récemment développée qui permet d’obtenir un niveau de résolution sans précédent dans l’imagerie de la microvascularisation in vivo. Dans ce travail, nous décrivons en détail comment obtenir des images super-résolues de la microvascularisation cérébrale chez les rongeurs à l’aide d’une plateforme d’imagerie par ultrasons fonctionnelle standardisée conçue pour la recherche préclinique.

Résumé

La microscopie de localisation par ultrasons (ULM) est une technique d’imagerie à super-résolution qui permet de visualiser in vivo l’architecture microvasculaire du cerveau, dépassant la limite de diffraction des ultrasons conventionnels. En détectant et en suivant les microbulles injectées par voie intraveineuse lorsqu’elles circulent dans les vaisseaux cérébraux, l’ULM produit des cartes à haute résolution de la densité vasculaire, de la vitesse d’écoulement et de l’amplitude du signal rétrodiffusé à des échelles spatiales allant jusqu’à 5-10 μm. Ce protocole présente un flux de travail complet pour la réalisation de l’imagerie ULM chez les rongeurs, y compris la préparation des animaux, le positionnement de la sonde, l’acquisition d’images, l’injection de microbulles et le traitement des données, à l’aide d’une plateforme d’échographie fonctionnelle dédiée. Deux méthodes de préparation sont décrites, adaptées aux souris (transcrâniennes) et aux rats (avec fenêtres crâniennes), suivies d’instructions détaillées pour l’alignement de la sonde et le ciblage anatomique à l’aide d’un atlas cérébral intégré. Lors de l’acquisition, les séquences d’ultrasons ultrarapides sont synchronisées avec des injections en bolus de microbulles pour capturer des données de flux dynamiques. Les étapes de reconstruction ultérieures impliquent le filtrage des encombrements, l’interpolation d’image, la détection des microbulles, la localisation des sous-pixels et le suivi de trajectoire. Les résultats comprennent des cartes de densité reflétant l’occupation des navires, des cartes de vitesse révélant les modèles d’écoulement et la directionnalité, et des cartes d’amplitude offrant un contraste supplémentaire pour l’interprétation structurelle. Des résultats représentatifs illustrent une acquisition réussie dans des plans coronaux complets et mettent en évidence des pièges courants tels que la mauvaise qualité de l’injection, les artefacts de mouvement et l’aberration induite par le crâne. Le protocole est compatible avec les études transversales et longitudinales et est particulièrement adapté à l’étude des altérations cérébrovasculaires dans des modèles de vieillissement, d’accident vasculaire cérébral, d’anévrisme et de maladies neurodégénératives. En combinant la pénétration en profondeur, une résolution spatio-temporelle élevée et l’imagerie vasculaire sans marquage, ULM offre un outil puissant pour l’analyse non invasive de la microcirculation cérébrale dans les modèles précliniques.

Introduction

Bien que le cerveau ne représente que 2 % de la masse du corps, il consomme environ 20 % de son oxygène et de son glucose pour soutenir l’activité neuronale¹. Cette forte demande métabolique est satisfaite par un réseau vasculaire complexe, des grosses artères et veines aux microvaisseaux comme les artérioles, les veinules et les capillaires, régulé par le couplage neurovasculaire². La perturbation de ce processus finement réglé a été impliquée dans un large éventail de troubles neurologiques. Le découplage neurovasculaire, par exemple, est une caractéristique pathologique précoce dans des maladies telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la sclérose latérale amyotrophique (SLA), précédant souvent les caractéristiques classiques de la neurodégénérescence telles que la bêta-amyloïde et la pathologie tau 3,4,5,6. L’imagerie de la nature complexe du cerveau in vivo a donc été une préoccupation primordiale pour répondre au besoin croissant de comprendre les processus physiologiques. Les progrès technologiques ont fourni des capacités uniques pour sonder le fonctionnement et l’activité du cerveau, à la fois directement et indirectement, avec une précision, une résolution et une accessibilité croissantes.

L’échographie Doppler est apparue comme un outil puissant pour la mesure fonctionnelle de l’activité cérébrale à l’aide du flux sanguin⁷. En particulier, l’imagerie Doppler de puissance, conçue pour détecter le mouvement des globules rouges (GR), transmet des impulsions ultrasonores répétées aux vaisseaux sanguins et enregistre l’amplitude des échos ultrasonores rétrodiffusés par les globules rouges⁸ en mouvement. L’avènement de l’imagerie par ultrasons ultrarapides, en particulier de l’échographie fonctionnelle (fUS), a marqué un tournant dans le dépassement des limites précédentes. En effet, l’échographie conventionnelle scanne les tissus ligne par ligne, une approche séquentielle qui limite son application aux grandes artères cérébrales, car les flux sanguins lents typiques de la microvascularisation du cerveau ne peuvent pas être détectés⁹. La technique fUS la plus récente utilise plusieurs transmissions d’ondes planes pour acquérir des milliers d’images par seconde, améliorant considérablement la résolution temporelle et le rapport signal/bruit (SNR). De manière cruciale, la fUS permet de détecter des changements hémodynamiques dans de très petits vaisseaux à des vitesses aussi faibles que 1 mm/s, ce qui permet l’imagerie fonctionnelle en temps réel de l’activité cérébrale jusqu’au niveau des artérioles⁸.

Bien que les méthodes Doppler ultrarapides aient considérablement amélioré l’imagerie microvasculaire, elles sont toujours limitées par la résolution limitée par la diffraction de l’échographie¹⁰. En tandem avec la fUS, la microscopie de localisation par ultrasons (ULM) brise cet obstacle, permettant de visualiser les structures microvasculaires au niveau capillaire en exploitant des agents de contraste et des algorithmes de localisation de haute précision¹¹. Cela fournit des informations sans précédent sur la morphologie et la fonction vasculaires. Plus précisément, dans l’ULM, des agents de contraste constitués de microbulles remplies de gaz stabilisés, d’environ 1 à 3 μm de diamètre, sont injectés dans la circulation sanguine. Ils agissent comme de puissants diffuseurs acoustiques qui peuvent être détectés comme des sources ponctuelles individuelles. Étant donné que les microbulles sont nettement plus petites que la longueur d’onde des ultrasons, elles peuvent être isolées spatialement et temporellement, apparaissant comme la fonction d’étalement de points (PSF) du système. Inspirée par des techniques de super-résolution optique telles que STORM et PALM, la localisation sous-pixel de ces microbulles est réalisée à l’aide de méthodes de déconvolution qui cartographient leurs positions avec une grande précision 10,12,13,14. Cela permet aux structures vasculaires d’être résolues à une résolution spatiale de 5 à 10 μm, bien au-delà de la limite imposée par la diffraction de l’imagerie Doppler conventionnelle par ultrasons ultrarapides.

L’ULM est un outil puissant et efficace pour la cartographie vasculaire jusqu’à l’échelle capillaire et surmonte les limites de nombreuses méthodes optiques limitées aux couches superficielles. Sa capacité à effectuer l’imagerie microvasculaire chez des animaux vivants, permettant des études longitudinales et pharmacologiques, est un autre avantage clé de l’ULM par rapport aux autres techniques nécessitant une fixation et une coloration du cerveau. Les informations extraites vont au-delà des cartes vasculaires statiques, fournissant des estimations quantitatives du flux sanguin jusqu’au niveau capillaire, ouvrant ainsi des voies prometteuses pour des applications précliniques et cliniques. Pour faciliter la reproductibilité, nous décrivons un flux de travail complet pour l’imagerie cérébrale basée sur l’ULM chez les rongeurs, mis en œuvre à l’aide d’une plate-forme d’imagerie par ultrasons fonctionnelle standardisée conçue pour la recherche préclinique.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans cette étude ont été menées conformément à la Directive du Conseil de la Communauté européenne du 22 septembre 2010 (010/63/UE) et approuvées par le Comité d’éthique en matière d’expérimentation animale numéro 59, Paris Centre et Sud, projet #2020-16). Les expériences ont été menées sur des souris C57BL/6 Rj mâles adultes (âgées de 2 mois, 20-30 g) et des rats Sprague-Dawley Rj :Han (200-300 g) provenant de sources commerciales. Les animaux ont été logés par groupes de quatre par cage selon un cycle lumière/obscurité de 12 heures, à une température constante de 22 °C, et avec de la nourriture et de l’eau fournies à volonté. Avant le début des expériences, tous les animaux ont subi une période d’acclimatation d’au moins une semaine aux conditions d’hébergement. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des animaux

1. Anesthésie et préparation animale chez la souris
   1. Placez la souris dans la chambre d’induction de l’isoflurane et administrez 2 % d’isoflurane avec de l’air (0,075 L/min) et de l’oxygène (0,175 L/min, ou de l’air médical).
   2. Après 5 min d’induction de l’anesthésie, transférez l’animal dans le cadre stéréotaxique, qui est placé sur un coussin chauffant réglé à 37 °C pour maintenir la température corporelle, et assurer une distribution continue d’isoflurane via un masque à la même concentration et au même débit.
   3. Confirmez la profondeur adéquate de l’anesthésie en vérifiant l’absence de réflexes en réponse à un pincement des orteils ou de la queue en utilisant une pression ferme mais non dommageable. En cas de réflexe, augmentez légèrement la concentration d’isoflurane. Réévaluez avant de continuer.
   4. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la formation de cataracte.
   5. Rasez la tête de la souris à l’aide d’une tondeuse. Appliquez une crème dépilatoire, laissez reposer pendant 1 à 1,5 min, puis rincez à l’eau tiède et séchez avec de la gaze. Répétez au besoin jusqu’à ce que tous les poils soient éliminés. Évitez de laisser la crème dépilatoire pendant de longues périodes, car elle pourrait causer des dommages chimiques à la peau.
   6. Appliquer du gel à ultrasons centrifugé (sans bulles, dégazé) sur la tête pour assurer le couplage acoustique.
2. Anesthésie et préparation animale chez le rat
   1. Après avoir pesé le rat, administrer une injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (75 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) à l’aide d’une seringue de 1 mL. Rasez la fourrure sur le dessus de la tête et nettoyez la peau avec une solution iodée.
      REMARQUE : La kétamine est une substance hautement réglementée dans de nombreux pays et peut nécessiter une autorisation spéciale pour son acquisition et son utilisation. Des régimes anesthésiques alternatifs peuvent être utilisés pour obtenir une anesthésie de niveau chirurgical.
   2. Placez l’animal sur un appareil stéréotaxique placé sur un coussin chauffant réglé à 37 °C pour maintenir la température corporelle. Appliquez une quantité généreuse de pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement et la formation de cataracte.
   3. Injecter par voie sous-cutanée du méloxicam (2 mg/kg) à l’aide d’une seringue de 1 mL pour l’analgésie peropératoire.
   4. Confirmez la profondeur adéquate de l’anesthésie en vérifiant l’absence de réflexes en réponse à un pincement de l’orteil ou de la queue en utilisant une pression ferme mais non dommageable. En cas de réflexe, administrer une dose supplémentaire égale au quart de la dose initiale d’anesthésique. Attendez environ 5 minutes avant de réévaluer la profondeur de l’anesthésie. Ne procédez qu’une fois qu’un plan chirurgical d’anesthésie est confirmé et réévaluez toutes les 20 à 30 minutes.
   5. Faites une incision longitudinale le long de la suture sagittale à l’aide d’un scalpel, en vous assurant que la coupure est suffisamment profonde pour inclure la peau et les tissus conjonctifs attachés au crâne.
   6. Gardez les tissus environnants bien hydratés tout au long de la chirurgie à l’aide d’une solution saline physiologique.
   7. À l’aide d’une perceuse rotative, tracez légèrement le contour de la fenêtre crânienne en marquant la couche superficielle du crâne. Pour un accès optimal au cerveau, la fenêtre doit être d’environ 14 mm dans la dimension latérale et d’au moins 2 mm dans la dimension antéropostérieure, en fonction de la taille du crâne.
   8. Continuez à fraiser le long du contour jusqu’à ce qu’il ne reste plus de résistance osseuse. Pendant le forage, appliquez périodiquement quelques gouttes de solution saline physiologique pour refroidir l’os et minimiser les dommages thermiques. Une spatule fine à bord arrondi doit être facilement insérée dans l’espace sans force.
   9. À l’aide de coups d’alésage courts et unidirectionnels, amincissez la dernière couche d’os jusqu’à ce que la résistance soit à peine perceptible.
   10. Insérez une spatule mince et légèrement incurvée aux bords arrondis sur le bord latéral de la fenêtre crânienne.
   11. Déplacez lentement la spatule vers le centre, en détachant doucement l’os des méninges. Une fois qu’aucune résistance n’est ressentie, soulevez et retirez complètement le morceau d’os détaché.
   12. Appliquez du gel à ultrasons centrifugé sur le dessus de la dure-mère. La figure 1 donne une description du dispositif expérimental.

Figure 1 : Schéma du dispositif expérimental d’imagerie cérébrale ULM chez les rongeurs. Le système d’imagerie est constitué d’une unité d’acquisition d’ultrasons reliée à une sonde haute fréquence montée sur une platine de positionnement motorisée. Les souris et les rats sont représentés dans des cadres stéréotaxiques : la souris présente un cuir chevelu rasé pour l’imagerie transcrânienne, tandis que le rat subit une imagerie à travers une fenêtre crânienne préparée chirurgicalement. Un cathéter veineux de la queue est placé pour l’injection d’agent de contraste chez les deux espèces. Cette configuration permet l’acquisition stable de données d’échographie fonctionnelles à haute résolution lors de l’injection de microbulles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Cathétérisme de la veine caudale
   1. Utilisez un ensemble de perfusion à ailettes de 27 G × 1/2 » connecté à une aiguille de 18 G × 1/2 » avec un tube de 8 ». Raccourcissez le tube, si possible, pour minimiser le volume mort.
   2. Tournez doucement la queue de l’animal à 90 degrés pour exposer les veines latérales de la queue (voir la figure 2). Fixez la queue en place à l’aide de ruban adhésif pour assurer la stabilité et éviter tout mouvement inutile pendant le cathétérisme.
   3. Identifiez la veine de la queue en commençant par l’extrémité distale (bout de la queue) et en vous déplaçant vers la base. Pour faciliter cette étape, la queue peut être réchauffée avec de l’eau tiède pour favoriser la vasodilatation et améliorer la visibilité des veines.
   4. À l’aide d’un doigt, appliquez une légère pression à la base de la queue et faites-la glisser vers le site d’injection (c’est-à-dire dans le sens inverse de la circulation sanguine). Cette manœuvre entrave temporairement le retour veineux, provoquant la distension et l’augmentation des veines caudales, facilitant ainsi l’insertion du cathéter.
   5. Insérez l’aiguille de 27 G × 1/2" de l’ensemble de perfusion à ailettes parallèlement à la veine, en vous assurant que le biseau est orienté vers le haut.
   6. Observez la tubulure pour détecter la présence d’un retour de sang, ce qui confirme le bon placement de l’aiguille.
      REMARQUE : Commencez le cathétérisme à l’extrémité distale de la queue pour éviter les fuites dues aux ponctions antérieures lors des injections ultérieures. Si le cathétérisme de la veine caudale s’avère difficile ou infructueux, d’autres voies centrales peuvent être envisagées. Il s’agit notamment du sinus rétro-orbitaire, de la veine jugulaire ou de la veine saphène.

Figure 2 : Anatomie en coupe transversale de la queue de rongeur illustrant les repères vasculaires pour le cathétérisme. Dessin schématique d’une coupe transversale à travers la queue distale d’un rongeur, montrant les positions relatives des principaux vaisseaux sanguins. Deux artères sont présentes près de la ligne médiane : l’artère caudale dorsale, située dans la région supérieure (dorsale), et l’artère caudale ventrale, positionnée dans la partie inférieure (ventrale) de la section transversale de la queue. Ces artères sont généralement évitées lors des procédures intraveineuses. Les veines caudales flanquent latéralement les artères, qui courent symétriquement de chaque côté et se trouvent juste sous la peau, ce qui en fait les sites d’accès privilégiés pour le cathétérisme ou l’injection de microbulles. Cet aperçu anatomique aide à la localisation précise des veines, en particulier lorsqu’elles sont renforcées par un réchauffement pour favoriser la vasodilatation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Positionnement de la sonde à l’aide du logiciel IcoScan
   1. Sur la plateforme d’acquisition, démarrez le logiciel d’acquisition fUS (par exemple, IcoScan pour Iconeus One) et créez une session d’expérimentation. Ajustez la position de la sonde à ultrasons.
      REMARQUE : Placez la sonde à environ 1 mm au-dessus de la tête de l’animal. Assurez-vous que la sonde est en contact avec le gel à ultrasons avant de commencer toute séquence d’imagerie.
   2. Démarrez l’acquisition Live View et ajustez la position de la sonde selon vos besoins à l’aide de l’imagerie du volume sanguin cérébral (CBV) en temps réel. Le cerveau doit être centré sur l’image. Optimisez les paramètres d’imagerie, tels que le contraste et la compression, pour améliorer la qualité de la visualisation.
   3. Ouvrez le menu Angio3D dans le logiciel d’acquisition. Ajustez les paramètres de balayage (première tranche, dernière tranche et taille du pas), en vous assurant qu’ils couvrent l’ensemble du cerveau. Lancez l’acquisition.
      REMARQUE : Lors de la configuration des paramètres de balayage, assurez-vous que le balayage couvre la partie postérieure du cerveau, à savoir l’ensemble des artères postérieures.
   4. Gardez le logiciel d’acquisition ouvert et démarrez le logiciel IcoStudio pour l’analyse et la visualisation des données. Chargez le scan Angio3D .
   5. Accédez au panneau d’enregistrement du cerveau et enregistrez l’analyse dans le cadre de coordonnées communes de la souris Allen à l’aide du mode d’enregistrement entièrement automatique ou manuel.
   6. Enregistrez l’enregistrement sous forme de fichier .bps.
   7. Ensuite, allez dans le menu Brain Navigation . Dans le panneau Gestionnaire d’atlas , utilisez le navigateur de l’arborescence parent/enfant pour parcourir l’atlas du cerveau de la souris Allen. Sélectionnez les régions anatomiques ciblées, qui seront superposées au scan dans le panneau à 3 vues.
   8. Choisissez un plan d’imagerie qui chevauche les régions d’intérêt. Définissez manuellement deux marqueurs dans la vue coronale pour définir la tranche d’imagerie ciblée.
   9. Cliquez sur le système de positionnement cérébral (BPS) pour extraire les coordonnées du moteur correspondant à la position de la sonde pour l’imagerie du plan sélectionné. Vérifiez l’aperçu de l’image, calculé à partir du scan Angio3D, et cliquez sur Copier les coordonnées BPS.
   10. Passez au logiciel IcoScan et ouvrez le panneau de positionnement de la sonde . Cliquez sur Entrer les coordonnées BPS et collez les valeurs extraites à l’étape 1.4.9. La sonde se déplacera et s’alignera automatiquement sur le plan d’imagerie sélectionné.
   11. Effectuez une acquisition en mode Live View pour confirmer que le plan d’imagerie actuel correspond au plan prédit à l’étape 1.4.8.
       REMARQUE : En enregistrant et en réutilisant les mêmes marqueurs spatiaux, le plan d’imagerie peut être redéfini de manière cohérente d’une session à l’autre, ce qui permet un repositionnement précis de la sonde pour les études longitudinales.

2. Acquisition d’ULM

1. Préparation des microbulles
   REMARQUE : Une variété d’agents de contraste à ultrasons disponibles dans le commerce peuvent être utilisés. Cependant, la composition du gaz, la concentration des bulles, le diamètre et la stabilité peuvent varier en fonction du produit utilisé. Veuillez suivre les recommandations du fabricant concernant la préparation et le stockage.
   1. À l’aide d’une seringue stérile, injecter 5 mL de solution de chlorure de sodium à 0,9 % dans le flacon par le septum.
      REMARQUE : Pour des administrations répétées en bolus ou une perfusion continue, un volume inférieur de solution de chlorure de sodium à 0,9 % peut être utilisé pour préparer une suspension de microbulles plus concentrée. Ajustez le facteur de dilution en conséquence en fonction de l’application prévue.
   2. Agitez vigoureusement le flacon pendant 20 s pour remettre complètement les microbulles en suspension et obtenir une dispersion uniforme.
2. Enregistrement ULM
   1. Prédéfinissez les paramètres d’enregistrement, y compris la séquence d’échographie, la fréquence d’images et la durée totale d’enregistrement.
      REMARQUE : Les paramètres recommandés pour l’enregistrement sont de 5 à 10 min à 2,5 Hz.
   2. Dessinez le volume de microbulles à injecter et lancez l’acquisition. Une fois l’acquisition commencée, procédez à l’injection de microbulles. Il est recommandé d’injecter 200 μL pour les rats et 100 μL pour les souris, à la dilution appropriée.
   3. Confirmez l’amélioration du contraste sur l’image Live View. Immédiatement après, rincez les microbulles restantes dans le volume mort en injectant du liquide physiologique dans le cathéter. La figure 3 est un exemple typique de profil d’intensité de microbulles.
   4. Attendez la fin de l’acquisition et enregistrez les données.
   5. A l’issue de l’acquisition, procédez comme suit, en fonction du protocole utilisé :
      1. Pour les souris (protocole non invasif) : Inverser l’anesthésie en arrêtant l’administration d’isoflurane et surveiller l’animal pendant la récupération dans un environnement chaud jusqu’à ce qu’il soit complètement réveillé.
      2. Pour les rats (protocole invasif avec fenêtre crânienne) : Euthanasier l’animal par injection intrapéritonéale d’Euthasol (pentobarbital sodique, 140 mg/kg), conformément aux directives institutionnelles et éthiques.

Figure 3 : Intensité du signal des microbulles au fil du temps. (A) Illustration de la région d’intérêt (ROI) utilisée pour l’extraction du signal, englobant l’ensemble de la tranche de cerveau coronal. (B) Évolution temporelle de l’intensité du signal de microbulles pendant une acquisition de 5 minutes. Le bolus de microbulles a été injecté à 30 s, ce qui a entraîné une augmentation caractéristique de l’amplitude du signal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Reconstruction d’images à l’aide du logiciel IcoLab

1. Ouvrez IcoLab et accédez à ULM en cliquant sur l’onglet ULM dans la partie la plus à gauche de l’écran.
2. Cliquez sur Calculer les cartes ULM pour lancer le flux de travail de traitement, comme détaillé à la figure 4.
3. Sélectionnez le dossier source contenant les données acquises.
4. Choisissez le scan spécifique à traiter et ajustez les limites de temps de traitement si nécessaire.
5. Cliquez sur Suivant pour passer à l’étape Reporting. À l’étape Reporting, configurez le chemin d’accès au dossier de sortie où les fichiers traités seront enregistrés. Définissez les paramètres de visualisation des images qui seront incluses dans le rapport PowerPoint.
6. Passez en revue le résumé des options sélectionnées affiché sur l’écran final.
7. Lorsque vous êtes prêt, cliquez sur EXÉCUTER pour démarrer le traitement. Une fois le traitement terminé, un fichier .trk sera généré, contenant toutes les coordonnées des microbulles localisées, ainsi que des fichiers TIFF rastérisés pour la densité, la vitesse et l’amplitude de rétrodiffusion (BSA).
   REMARQUE : Une acquisition de 5 minutes peut nécessiter plusieurs heures de traitement. Il est préférable d’effectuer cette étape pendant la nuit ou sur un poste de travail dédié.
   1. Génération de cartes de densité de microbulles : Les positions localisées de toutes les microbulles détectées sont accumulées au cours du temps d’acquisition sélectionné. Cartographiez ces positions sur une grille spatiale à résolution fixe.
      REMARQUE : Chaque pixel de la carte de densité résultante reflète le nombre de microbulles localisées dans ce groupe spatial. Le résultat final est une image en niveaux de gris (TIFF) où l’intensité des pixels correspond à l’occupation des vaisseaux, ce qui permet une reconstruction à haute résolution du réseau vasculaire.
   2. Génération de cartes de vitesse : le logiciel suit les microbulles individuelles sur des images consécutives pour former des trajectoires. Pour chaque trajectoire, le logiciel calcule un vecteur vitesse en divisant le déplacement par le temps écoulé (ce qui donne un vecteur vitesse en mm/s).
      REMARQUE : Deux types de cartes de vitesse peuvent être générés : les cartes de vitesse absolues, où chaque pixel stocke l’amplitude de vitesse moyenne des microbulles qui le traversent, et les cartes de vitesse directionnelles, où la vitesse est décomposée le long d’un axe anatomique choisi (c’est-à-dire x ou z), et le composant signé correspondant est stocké. Ces cartes sont pixellisées sur la même grille spatiale et enregistrées sous forme d’images TIFF individuelles.
   3. Génération de cartes BSA : Pour chaque microbulle localisée, l’amplitude brute du signal ultrasonore (intensité rétrodiffusée) est affichée. Projetez ces amplitudes sur la grille spatiale, en accumulant l’intensité du signal dans chaque pixel. La carte BSA résultante met en évidence les régions où les microbulles ont traversé la zone focale du faisceau, fournissant un contraste qui complète les cartes de densité et de vitesse¹⁵.

Figure 4 : Organigramme du pipeline de traitement pour la reconstruction de la carte ULM. La figure illustre les étapes de traitement séquentielles effectuées dans le logiciel d’analyse pour générer des cartes ULM à partir de données échographiques brutes. À partir d’images composées (n = 200), l’étape 1 applique un filtrage des échos nuisibles par décomposition en valeurs singulières (SVD) pour isoler les signaux de microbulles (MB) de l’arrière-plan tissulaire. À l’étape 2, les signaux MB subissent une interpolation Lanczos, ce qui permet d’obtenir une pile d’images prétraitées. L’étape 3 effectue la détection des maxima locaux et les met en corrélation avec la fonction d’étalement des points (PSF) du système pour identifier les emplacements candidats des microbulles. À l’étape 4, la localisation des sous-pixels (détection des centroïdes) et le suivi des particules sont utilisés pour extraire les trajectoires des microbulles, à partir desquelles des cartes de vitesse et d’amplitude rétrodiffusée sont calculées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Visualisation des données à l’aide du logiciel IcoStudio

1. Chargez un fichier .trk dans IcoStudio pour commencer l’exploration des données.
2. Ajustez les paramètres de visualisation tels que le contraste, la compression et la palette de couleurs dans le panneau de droite pour affiner la représentation des données.
3. Définissez le temps d’intégration à l’aide du double curseur en bas de la vue principale pour définir les images de début et de fin.
4. Ouvrez l’onglet Densité pour afficher les occurrences de microbulles et choisir entre la densité absolue (nombre par pixel) et la densité directionnelle (pondérée axialement).
5. Utilisez l’onglet Vitesse pour afficher la vitesse des microbulles en mm/s dans plusieurs modes : Absolu, Directionnel, Axial et Latéral. Ajustez les seuils de contraste, de compression et de vitesse pour améliorer la visualisation.
6. Explorez l’onglet BSA pour visualiser la réflectivité des microbulles, en fournissant un mécanisme de contraste alternatif qui met en évidence les structures microvasculaires et les mouvements hors du plan. Exportez des captures d’écran PNG haute résolution ou générez des fichiers TIFF pour une analyse quantitative avec des paramètres de taille de pixel et de type de données personnalisables.

Résultats

Les exemples représentatifs de la figure 5 montrent un exemple typique de données ULM d’un cerveau de rat acquises sur 1 min d’enregistrement après 200 μL d’injection de bolus de microbulles, avec une résolution de 10 μm.

Figure 5 : Sorties ULM représentatives acquises d’un rat craniotomisé suite à une seule injection de microbulles. Des exemples de cartes de la densité des microbulles (MB) (à gauche), de la vitesse (au centre) et de l’amplitude rétrodiffusée (à droite) sont présentés pour une tranche de cerveau coronale complète, acquise sur 1 min d’enregistrement après une injection de microbulles en bolus de 200 μL. Barre d’échelle : 2 mm. Les inserts zoomés mettent en évidence la microvascularisation corticale gauche (barre d’échelle : 0,5 mm). La carte de densité reflète la distribution spatiale des occurrences de MB, révélant la structure du réseau vasculaire. La carte des vitesses illustre la vitesse d’écoulement et la directionnalité des MB individuels, ce qui permet de différencier les types de navires. La carte d’amplitude montre le signal ultrasonore rétrodiffusé des MB, fournissant un mécanisme de contraste supplémentaire qui améliore la visualisation de la morphologie des vaisseaux et du mouvement hors du plan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les cartes résultantes illustrent trois vues complémentaires de la microvascularisation cérébrale : la densité des microbulles (MB) (à gauche), la vitesse (au centre) et l’amplitude de rétrodiffusion (à droite). Chaque carte correspond à une tranche coronale complète du cerveau, avec des inserts zoomés mettant en évidence la microvascularisation corticale gauche (barres d’échelle : 2 mm et 0,5 mm, respectivement).

La carte de densité montre la distribution spatiale des occurrences de MB dans le champ de vision. La morphologie des vaisseaux est résolue bien en dessous de la limite de diffraction, révélant à la fois de gros vaisseaux et de fines structures capillaires. Ce type de carte permet une visualisation claire de la topologie du réseau vasculaire, y compris les bifurcations et les motifs de ramification, même dans les régions corticales profondes.

La carte des vitesses affiche la vitesse d’écoulement des MB individuels projetés le long de la direction axiale (z). Cette projection produit des valeurs de vitesse signées, où les vitesses négatives reflètent le flux ascendant dans le cortex et les valeurs positives reflètent le flux descendant. Dans le cortex cérébral des rongeurs, l’architecture vasculaire est fortement stéréotypée : les artérioles pénétrantes descendent de la surface piale dans les couches corticales, tandis que les veinules remontent du cortex vers la surface pour drainer le sang désoxygéné¹⁶. Cette disposition anatomique cohérente permet d’utiliser des mesures de vitesse directionnelle pour distinguer les types de vaisseaux, les vitesses axiales positives indiquant généralement le flux artériel et les vitesses négatives indiquant le drainage veineux. Dans l’ensemble, les valeurs de vitesse mesurées avec l’ULM sont cohérentes avec les plages précédemment rapportées dans la littérature^10,17, allant de 10 à 20 mm/s dans les artérioles pénétrantes à plusieurs centimètres par seconde dans les principales artères intracrâniennes. Ces résultats sont conformes à des observations antérieures selon lesquelles les microbulles qui s’écoulent imitent étroitement le comportement rhéologique des globules rouges¹⁸, validant l’utilisation de l’ULM pour quantifier la dynamique physiologique du flux sanguin à l’échelle microscopique.

La carte d’amplitude rétrodiffusée (BSA) fournit une représentation spatiale de l’intensité du signal ultrasonore renvoyé par chaque MB. Comme l’énergie rétrodiffusée est maximisée lorsque les MB traversent la région focale, cette carte offre un contraste basé sur la position d’élévation. Il permet d’affiner la segmentation en identifiant les mouvements hors plan ou les récipients de faible amplitude, en particulier à de grandes profondeurs ou près des bords focaux. Les cartes BSA sont également utiles pour détecter l’atténuation du signal liée à la profondeur ou identifier les décalages dans l’alignement focal¹⁵.

Pour démontrer la reproductibilité du ciblage du plan avec le système de positionnement cérébral, la figure 6A montre les cartes de densité vasculaire ULM acquises chez la même souris sous anesthésie le jour 0 (semaine 1) et le jour 7 (semaine 2), en ciblant le même plan coronal. La superposition des deux cartes montre une forte correspondance spatiale du signal vasculaire, confirmant la précision du repositionnement du plan et la fiabilité des expériences longitudinales, comme montré précédemment¹⁹.

L’analyse quantitative peut être appliquée à n’importe lequel de ces produits. Par exemple, les utilisateurs peuvent segmenter les vaisseaux à l’aide de seuils d’intensité ou d’algorithmes de regroupement, puis extraire des statistiques régionales telles que la densité des vaisseaux, la vitesse d’écoulement moyenne et des paramètres morphométriques, notamment le rayon des vaisseaux, la longueur moyenne, le nombre de branches et d’autres descripteurs structurels du réseau vasculaire. Des comparaisons entre des régions corticales ou des groupes expérimentaux (p. ex., injecté de médicament par rapport à témoin) peuvent être effectuées directement sur ces cartes ou au moyen de statistiques paramétriques dérivées sur des vaisseaux couramment identifiés^20,21. À titre d’exemple d’une telle analyse, nous avons effectué des quantifications régionales des paramètres vasculaires dans le cortex somatosensoriel gauche (S1BF, Figure 6B) et le thalamus gauche (Figure 6C). Les cartes de densité ont d’abord été binarisées, squelettisées et les rayons des vaisseaux ont été estimés à l’aide d’une transformée de distance euclidienne. Les vitesses d’écoulement ont été obtenues directement à partir des trajectoires MB, et le débit a été dérivé du rayon du récipient en utilisant la loi de Poiseuille comme détaillé précédemment²¹. La même méthodologie que celle décrite dans cette étude a été appliquée ici. Les diagrammes à moustaches affichent les distributions du rayon du vaisseau, de la vitesse et du débit pour d0 et d7, démontrant une bonne reproductibilité entre les sessions. Ensemble, ces sorties ULM multimodales permettent une caractérisation complète du réseau microvasculaire du cerveau, offrant des informations anatomiques et dynamiques avec une résolution sans précédent.

Figure 6 : Reproductibilité longitudinale du ciblage plan et exemple de quantifications vasculaires à l’aide du système de positionnement cérébral. (A) Cartes de densité vasculaire ULM acquises de la même souris anesthésiée le jour 0 (semaine 1) et le jour 7 (semaine 2), ciblant le même plan coronal à l’aide du système de positionnement cérébral (barre d’échelle = 1 cm). La superposition des deux cartes montre une forte correspondance spatiale du signal vasculaire, illustrant la reproductibilité du positionnement du plan à travers les sessions. (B, C) Quantification représentative de paramètres vasculaires extraits de deux régions d’intérêt : le cortex somatosensoriel gauche (S1BF, B) et le thalamus gauche (C). Pour chaque région, nous affichons la carte de densité vasculaire à d0 (barre d’échelle = 0,5 cm), ainsi que des diagrammes à moustaches montrant la distribution du rayon des vaisseaux (μm), de la vitesse d’écoulement (mm/s) et du débit (mm³/s) à d0 et d7 (médiane, 25e-75e centile, moustaches = 1,5×IQR, valeurs aberrantes tracées individuellement). Ces résultats illustrent la capacité du pipeline à extraire des métriques morphométriques et hémodynamiques à partir des données ULM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La microscopie de localisation par ultrasons (ULM) représente une avancée transformatrice dans l’imagerie par ultrasons, permettant une visualisation en super-résolution de la microvascularisation au-delà de la limite de diffraction conventionnelle. Cette discussion met en évidence les étapes critiques du protocole ULM, aborde les modifications potentielles et les stratégies de dépannage, explore les limites de la méthode, évalue sa signification par rapport à d’autres modalités d’imagerie, et examine son importance et ses applications potentielles dans la recherche biomédicale.

Étapes critiques du protocole ULM

Plusieurs étapes sont cruciales pour la réussite de la mise en œuvre de l’ULM, et leur influence est illustrée à la figure 7. L’une des étapes les plus importantes est l’administration de microbulles, car la concentration et la qualité de l’administration affectent directement les résultats de l’imagerie. Une concentration optimale est nécessaire pour équilibrer la résolution spatiale et la détectabilité. Une administration inadéquate, comme un mauvais placement du cathéter ou une extravasation, peut entraîner un signal vasculaire très faible et des reconstructions incomplètes, comme le montre la figure 7B, où seul un petit nombre de microbulles atteignent la circulation sanguine. L’imagerie à fréquence d’images élevée, généralement de l’ordre du kilohertz, est essentielle pour capturer le mouvement rapide des microbulles et permettre un suivi fiable sur toutes les images. Toute instabilité pendant l’acquisition, telle qu’un mouvement introduit par la respiration, une mauvaise fixation ou une anesthésie insuffisante, peut dégrader la précision de la localisation. Un exemple de ceci est illustré à la figure 7C, où un mouvement excessif pendant l’acquisition entraîne une carte de densité floue et inutilisable.

La localisation et le suivi des microbulles dépendent d’algorithmes de traitement d’image avancés qui détectent les bulles individuelles, effectuent la localisation des sous-pixels et reconstruisent les trajectoires avec une précision de sous-diffraction. Même avec une acquisition et un traitement appropriés, des facteurs anatomiques tels que les aberrations induites par le crâne peuvent toujours affecter la qualité de l’image. En imagerie transcrânienne, en particulier chez les souris âgées, l’épaississement du crâne peut introduire une distorsion acoustique. Cela conduit à des artefacts d’ombrage caractéristiques sous la suture sagittale, où aucune microbulle n’est détectée, comme le montre la figure 7D. De telles aberrations réduisent le rapport signal/bruit et peuvent obscurcir les structures vasculaires à moins d’être corrigées par un filtrage adaptatif ou en affinant le placement de la sonde.

Lorsque toutes les étapes sont effectuées avec succès, il est possible d’obtenir des cartes ULM de haute qualité, comme le montre la figure 7A, où un réseau vasculaire dense et bien résolu est reconstruit par une approche transcrânienne.

Figure 7 : Exemples de référence et de dépannage pour la qualité d’imagerie ULM chez la souris. Le panneau (A) montre une carte de densité de microbulles ULM (MB) transcrânienne de haute qualité acquise chez une jeune souris adulte, illustrant une cartographie vasculaire réussie sur l’ensemble du plan coronal. Le panneau (B) montre un exemple de signal vasculaire faible en raison d’une extravasation de microbulles ou d’un accès veineux insuffisant, entraînant des détections de MB clairsemées. Le panneau (C) montre une acquisition affectée par un mouvement excessif de l’animal, produisant une carte de densité floue et non interprétable. Le panneau (D) met en évidence l’aberration acoustique induite par le crâne couramment observée chez les souris âgées, visible sous la forme d’un cône d’ombre sous la suture sagittale où aucun MB n’est détecté en raison d’un rapport signal/bruit réduit. Ces exemples servent de références visuelles pour identifier et traiter les artefacts expérimentaux courants dans l’imagerie ULM. Barre d’échelle : 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figurine.

Limites de la méthode

Malgré ses nombreux avantages, l’ULM présente des limites inhérentes qui affectent son applicabilité. Le biais des vaisseaux hors du plan est un problème important en imagerie 2D, car les vaisseaux s’étendant à l’extérieur du plan d’imagerie ne sont pas correctement reconstruits, ce qui entraîne des cartes vasculaires incomplètes. Cette limitation peut être atténuée par le passage à des approches d’imagerie volumétrique (3D)²², bien que cela augmente la complexité du calcul. Les défis du cathétérisme intraveineux constituent également un obstacle, en particulier dans les modèles de petits animaux, où l’obtention d’une administration cohérente de microbulles peut être techniquement exigeante. La stabilité des microbulles est également un facteur limitant, en particulier lors de séances d’imagerie prolongées. En raison de leur courte demi-vie de circulation, les microbulles peuvent nécessiter des injections répétées en bolus ou des protocoles de perfusion continus pour maintenir un contraste adéquat tout au long de la période d’acquisition. Les artefacts de mouvement restent une préoccupation importante, en particulier pour les sujets éveillés, où même de petits mouvements involontaires peuvent dégrader l’imagerie à super-résolution. Enfin, la pénétration en profondeur dans l’ULM est intrinsèquement limitée par l’atténuation par ultrasons. Bien que cela ne pose généralement pas de problème pour l’imagerie des rongeurs à des fréquences élevées (par exemple, 15 MHz), cela devient plus difficile chez les animaux plus grands tels que les porcs ou les primates non humains. Dans ces cas, des sondes à basse fréquence peuvent être nécessaires pour atteindre une profondeur d’imagerie suffisante, mais cela se fait au prix d’une résolution spatiale réduite, ce qui souligne un compromis clé entre la profondeur et les détails qui doit être pris en compte lors de la traduction de l’ULM en modèles précliniques plus grands.

Importance de l’ULM par rapport aux méthodes existantes

La microscopie de localisation par ultrasons (ULM) offre des avantages substantiels par rapport aux modalités d’imagerie conventionnelles, en particulier dans le contexte de l’imagerie microvasculaire. Parmi ses atouts les plus notables, citons sa capacité à dépasser la limite de diffraction des ultrasons traditionnels, réalisant une imagerie de sous-diffraction à des échelles spatiales comparables aux techniques optiques telles que la microscopie à deux photons. Contrairement à ces méthodes optiques, cependant, l’ULM permet une pénétration tissulaire plus profonde, permettant d’accéder à des régions du cerveau qui sont autrement difficiles à visualiser de manière non invasive.

ULM offre également des capacités d’imagerie fonctionnelle, permettant l’évaluation quantitative de la vitesse du flux sanguin, de la dynamique de perfusion et du remodelage vasculaire. Ces caractéristiques le rendent parfaitement adapté à l’étude des processus physiologiques et des modifications pathologiques des réseaux neurovasculaires. Par rapport à l’IRM et au PET, l’ULM est plus rentable, ne nécessite pas d’infrastructure lourde et évite l’utilisation d’agents de contraste présentant des risques de toxicité connus, s’appuyant plutôt sur des microbulles remplies de gaz avec des profils de sécurité favorables.

La combinaison d’une résolution spatiale et temporelle élevée rend ULM particulièrement précieux pour une gamme d’applications de recherche. Il est particulièrement puissant dans les études ciblant les structures microvasculaires et les noyaux cérébraux profonds, où les modalités traditionnelles sont souvent insuffisantes. De plus, contrairement aux approches histologiques qui nécessitent la fixation et la coloration des tissus, l’ULM permet l’imagerie en temps réel chez les animaux vivants, soutenant les conceptions longitudinales et les interventions dynamiques telles que les défis pharmacologiques.

Au-delà de la cartographie vasculaire statique, l’ULM permet également l’imagerie fonctionnelle à haute résolution en capturant la dynamique du flux sanguin cérébral avec une précision spatiale et temporelle exceptionnelle. Des progrès récents ont démontré sa faisabilité pour la neuroimagerie fonctionnelle du cerveau entier chez les rongeurs, révélant des changements du flux sanguin au niveau capillaire à travers des réseaux cérébraux distribués². Cela positionne l’ULM comme un outil puissant pour les études fonctionnelles, comblant efficacement le fossé entre l’imagerie hémodynamique à méso-échelle et la cartographie de l’activité neuronale.

Considérations relatives à l’utilisabilité, à l’efficacité et à la reproductibilité

Le flux de travail ULM décrit dans ce protocole a été optimisé pour faciliter la mise en œuvre et la reproductibilité dans différentes configurations expérimentales. L’utilisation de composants disponibles dans le commerce, y compris des microbulles approuvées par la FDA et l’EMA et des procédures standard d’anesthésie des rongeurs, garantit une large accessibilité. De plus, l’intégration de l’ensemble du pipeline de traitement au sein du logiciel dédié (IcoLab) améliore considérablement la convivialité en automatisant des étapes complexes telles que la localisation de microbulles, la reconstruction de trajectoires et la génération de cartes. Cette interface simplifiée réduit le besoin de code personnalisé et minimise l’intervention de l’utilisateur, ce qui permet d’obtenir des résultats cohérents entre les utilisateurs et les expériences. Alors que le traitement ULM haute résolution nécessite des calculs intensifs, en particulier pour les longues acquisitions ou les données volumétriques, les outils de traitement par lots et l’accélération GPU réduisent considérablement le temps d’analyse. La conception modulaire du protocole favorise également la reproductibilité, ce qui permet aux chercheurs d’affiner les paramètres d’acquisition et de traitement tout en maintenant un cadre analytique robuste. Le protocole comprend également une section dédiée au positionnement de la sonde à l’aide d’IcoScan et d’IcoStudio, qui permet aux utilisateurs de repositionner de manière fiable la sonde à la même coupe d’imagerie d’une session à l’autre, avec une précision d’environ 100 μm. Cette caractéristique est particulièrement précieuse pour les études longitudinales, où une cohérence spatiale précise est essentielle pour suivre les changements vasculaires au fil du temps. Ensemble, ces caractéristiques réduisent la barrière à l’entrée pour les nouveaux utilisateurs et soutiennent le déploiement évolutif de l’ULM dans les études d’imagerie exploratoires et longitudinales.

Conclusion

Ce protocole présente un flux de travail complet pour la mise en œuvre de la microscopie de localisation par ultrasons (ULM) dans l’imagerie cérébrale des rongeurs, couvrant la préparation chirurgicale, l’administration de microbulles, l’acquisition d’images et la cartographie vasculaire à haute résolution à l’aide d’une plate-forme d’acquisition et d’analyse standardisée optimisée pour la recherche préclinique. L’ULM représente une avancée majeure dans le domaine de l’imagerie biomédicale, offrant une visualisation in vivo de la microvascularisation à super-résolution avec des détails sans précédent. Par rapport aux modalités d’imagerie existantes, l’ULM offre une combinaison unique de haute résolution spatiale, de quantification du flux fonctionnel et d’accessibilité, ce qui le rend particulièrement bien adapté aux études du développement vasculaire, du couplage neurovasculaire et de la physiopathologie des maladies. Au fur et à mesure que la technologie continue de mûrir, l’ULM est sur le point de devenir une pierre angulaire à la fois dans la recherche préclinique et, à terme, dans les applications cliniques de neuroimagerie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Régulateur de température animal (plaque chauffante couplée à une sonde rectale)	Physitemp	TCAT-2DF
Atipamezole  ;	Orion Pharma, France	Antisedan	Solution injectable de 5 mg/mL
C57BL/6 souris	Janvier Labs	SC-C57J-M	C57BL/6Rj souris mâles, 8 semaines
Perceuse dentaire	Foredom, États-Unis	K.1070 Kit de micromoteur rotatif à grande vitesse
Crème dépilatoire	Vichy	N/A
Pommade oculaire	TVM, Royaume-Uni	Ocry-gel
Tondeuse à cheveux	Phymep	ISIS GT 421 Aesculap
Logiciel de traitement IcoLab (v 1.2.0.0)	Iconeus, France	IcoLab
Configuration de l’Iconeus One Xpand	Iconeus, France	IconeusOne Xpand
Sonde IcoPrime 15MHz	Iconeus, France	Sonde IcoPrime-15MHz
Logiciel d’acquisition IcoScan (v1.9.0)	Iconeus, France	IcoScan
Logiciel d’analyse IcoStudio (v2.2.0)	Iconeus, France	IcoStudio
Solution d’iode   ;	Mylan, France	N/A
Station d’anesthésie à l’isoflurane	Minerve, Esternay, France	N/A
Kétamine	Virbac, France	Kétamine1000	Solution injectable de 100 mg/mL
Méloxicam	Boehringer Ingelheim	Metacam	Solution injectable de 0,5 mg/mL
Aiguilles	Terumo, France	AN*1838R1	18 G x & frac12 ; ” aiguille de 8" Tubulure
Eau saline	Laboratoire Gilbert Physiodose, Pharmacie, France	N/A
Scalpel	DREXCO medical, France	80011
Microbulles SonoVue	Bracco Imaging	SonoVue 8ul/ml
Spatula	Phymed, France.	K.1070 Kit de micromoteur rotatif à grande vitesse
Sprague-Dawley Rj : Han rats	Janvier Labs	RN-SD-M	RjHan : SD - rats mâles Sprague Dawley, 200-300 g
Cadre stéréotaxique	David Kopf (Tujunga, États-Unis)	900-WA	Utilisation de l’adaptateur de souris   ; (Réf. : 922) et des barres auriculaires sans rupture (réf. : 922) & nbsp ;
Seringue	DREXCO medical, France	2058
Gel à ultrasons	DREXCO medical, France	Medi’Gel
Ensemble d’infusion ailé	Terumo, France	SV*27EL
Xylazine 2 %  ;	Bayer, France	Rompun	Solution injectable de 20 mg/mL