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Définition de la reprogrammation xénofree de progéniteurs du sang de cordon en cellules souches pluripotentes et de type blastomère induites

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DOI :

10.3791/68613

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22 août 2025

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1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit des méthodes chimiquement définies pour la reprogrammation épisomique des progéniteurs myéloïdes du sang de cordon humain (CB) en cellules souches pluripotentes induites humaines conventionnelles (hiPSC). Ces cellules souches naïves régulées par l’inhibiteur de la tangyrase/PARP1 (TIRN-SC) de type blastomère peuvent être efficacement transformées en cellules souches naïves régulées par l’inhibiteur de la tangyrase/PARP1 (TIRN-SC) possédant une différenciation accrue et un potentiel de chimère interspécifique.

Résumé

La reprogrammation des progéniteurs myéloïdes du sang de cordon humain (CB) vers un état de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) haute fidélité peut être réalisée à l’aide de vecteurs épisomiques non intégrateurs et de signaux stromaux. Ces lignées CB-hiPSC conventionnelles et amorcées peuvent ensuite être rétablies chimiquement avec une efficacité élevée à un état de cellules souches naïves régulées par l’inhibiteur de la tankyrase/PARP (TIRN-SC) de type blastomère avec totipotence fonctionnelle. Les TIRN-SC régulés par PARP sont des cellules souches humaines à forte plasticité épigénétique, à empreintes épigénomiques stables et ont un pouvoir de différenciation plus élevé que les hiPSC conventionnelles amorcées par la lignée. Ici, des méthodes XF/FF optimisées sont décrites pour une reprogrammation épisomale efficace activée par le stroma mésenchymateux des progéniteurs myéloïdes CD34+ CD33+ CB en hiPSC XF/FF conventionnelles. La réversion de TIRN a potentialisé de manière reproductible les hiPSC conventionnelles XF/FF pour adopter les caractéristiques transcriptionnelles, épigénétiques et fonctionnelles des cellules embryonnaires humaines au stade de clivage avec une expression génique diminuée de la lignée amorcée. Nous avons vérifié que XF-hiPSC dérivé de CB inversé par TIRN présentait une amélioration marquée de la différenciation multi-lignées dirigée (y compris les lignées hématovasculaires) à travers un large répertoire de milieux génétiquement indépendants. Ces méthodes constituent une première étape pour générer des lignées TIRN-SC conformes aux BPFc pour les banques de donneurs « universels » de qualité clinique définis par HLA (UTIR-SC). La dérivation des lignées UTIRN-SC avec une meilleure polyvalence de différenciation à partir des progéniteurs CD34+ CD33+ CB pourrait avoir un impact important sur la médecine régénérative. Par exemple, les UTIRN-SC pourraient générer des banques de tissus de progéniteurs cardiaques, vasculaires et neuraux de donneurs définis par HLA et cryoconservés pour des thérapies cellulaires multi-lignées complètes « prêtes à l’emploi ».

Introduction

Bien que les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) offrent des opportunités prometteuses pour les thérapies cellulaires personnalisées, leur application clinique est confrontée à des défis majeurs, notamment la tumorigénicité, l’immunogénicité et l’hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle1, qui ont un impact sur leur innocuité, leur efficacité et leur rentabilité. De plus, les progéniteurs engagés dans la lignée dérivés de lignées hiPSC conventionnelles et amorcées sont générés avec des efficacités de différenciation inter-lignées très variables2, et présentent une greffe et une fonctionnalité in vivo limitées. Cependant, ces limitations peuvent être surmontées à l’aide de méthodes de reprogrammation optimisées3 ou d’états alternatifs des cellules souches 4,5.

Bien que l’efficacité de la reprogrammation épisomale non virale des cellules somatiques cutanées ou sanguines en hiPSC soit faible (~0,01 %-2 %)6, une reprogrammation à quatre facteurs hautement optimisée des progéniteurs CB peut être atteinte et peut atteindre jusqu’à 50 % d’efficacité globale dans des conditions de co-culture activées par des cellules souches stromales mésenchymateuses activées par des progéniteurs (CSM)7. Dans ce système, la reprogrammation cellulaire des progéniteurs myéloïdes CB a été accélérée par des signaux stromaux solubles et dépendants du contact. Les lignées épisomiques de cellules souches de cellules souches dérivées de CB amorcées par le stroma (SP) se sont différenciées en progéniteurs vasculaires (VP) avec des efficacités plus élevées que les celluleshiPSC 3,5 conventionnelles dérivées de fibroblastes. Les VP dérivés de SP-CB-iPSC ont montré une identité transcriptionnelle embryonnaire plus authentique, une sénescence réduite et une sensibilité aux dommages à l’ADN 3,4. Le VP dérivé de SP-CB-iPSC a également démontré une greffe in vivo plus robuste que le VP conventionnel dérivé d’hiPSC après transplantation systémique ou directe dans le vitré de souris adultes immunodéficientes endommagées par ischémie-reperfusionrétinienne 3,4.

Zimmerlin et al. ont établi un système de reprogrammation chimique en deux étapes (« LIF-5i -> LIF-3i ») qui fait passer des cellules souches pluripotentes humaines conventionnelles amorcées à un état TIRN-SC avec un potentiel de différenciation multi-lignées amélioré5. Les progéniteurs vasculaires différenciés dérivés de TIRN-SC ont présenté une fonctionnalité plus élevée, une plus grande stabilité génomique et une greffe in vivo supérieure, comme le montre leur capacité améliorée à migrer et à revasculariser les couches neurales profondes de la rétine ischémique4. TIRN-SC a subi une reprogrammation protéogénomique pour acquérir un état hybride fonctionnel de type blastomère avec une contribution élevée dans l’essai de chimère interspécifique8. TIRN-SC a maintenu l’expression de DNMT1 et a été protégé contre l’érosion dans les régions imprimées par génomique méthylée par CpG. Il est intéressant de noter que les SP-CB-hiPSC ont été reconvertis en TIRN-SC plus efficacement que les hiPSC dérivés par d’autres méthodes moins efficaces 5,9.

Ainsi, les TIRN-SC sont un état alternatif des cellules souches avec une capacité de différenciation multi-lignées améliorée et une contribution efficace de la chimère. Optimisation supplémentaire de
La reprogrammation de TIRN-SC dans des conditions de culture définies et conformes aux BPFc facilitera la génération d’un large éventail de types de cellules et de tissus fonctionnels et greffables pour les thérapies. Pour répondre au besoin de progéniteurs thérapeutiques rentables, ces méthodes peuvent être appliquées pour produire des banques de cellules TIRN-SC de « donneur universel » (UTIR-SC) de qualité GMPc à l’aide de CB hématopoïétiques CD34+ définis par HLA ou de progéniteurs sanguins périphériques. Les progéniteurs dérivés d’UTIRN-SC définis par HLA pourraient répondre aux besoins d’un plus grand nombre de patients nécessitant une régénération immédiate et multi-lignées de tissus complexes.

Les paradigmes développés pour la greffe clinique de moelle osseuse (BMT) peuvent guider le développement de banques UTIRN-SC à partir de cellules souches hématopoïétiques partiellement compatibles HLA ou HLA-haplo-identiques provenant de registres nationaux de donneurs. Une analyse computationnelle prédictive mondiale des 10 principaux haplotypes combinés de 18 pays, dont les États-Unis, fournirait une couverture moyenne de 68,4 % des patients à partir de ces « haplobanques » hiPSC10. Une banque UTIRN-SC définie pourrait non seulement fournir des progéniteurs engagés dans la lignée, mais aussi soutenir les applications thérapeutiques TIRN-SC de systèmes de complémentation de blastocystes interspécifiques chez les animaux domestiques (p. ex., les porcs) pour la génération d’organes entiers11,12, y compris la génération de progéniteurs hématopoïétiques induisant la tolérance pour réduire le rejet de greffe dans les populations présentant une grande diversité génétique (p. ex., aux États-Unis).

Ce protocole de reprogrammation modifié pour générer des lignes hiPSC XF/FF compétentes TIRN est une première étape pour le développement de futures banques UTIRN-SC conformes aux BPF. Ce protocole décrit la reprogrammation par étapes par stroma et la validation fonctionnelle des progéniteurs myéloïdes CB humains dans les lignées XF-hiPSC conventionnelles. Ces XF-hiPSC ont démontré une réversion facile en TIRN-SC, avec une efficacité similaire aux méthodes non-XF7 et ont atteint une pluripotence fonctionnelle sans restriction, y compris une capacité améliorée à produire des tératomes bien formés et réduits par biais de lignée (par rapport aux XF-hiPSC amorcés isogéniques)4,5,9. Nous décrivons également des protocoles qui valident la différenciation directe améliorée et robuste de XF-hiPSC inversée par TIRN vers les lignées hématovasculaires.

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Protocole

Toutes les expériences de reprogrammation étaient conformes aux directives publiées par l’Académie nationale des sciences et la Société internationale de recherche sur les cellules souches (ISSCR). Pour la génération de hiPSC, les protocoles de collecte de cellules du donneur et le consentement éclairé du donneur ont été approuvés par le comité d’examen institutionnel (IRB) de l’Université Johns Hopkins (JHU). Toutes les expériences ont été menées dans le cadre de l’ISCRO (Institutional Stem Cell Research Oversight (ISCRO) de la JHU et sont conformes aux normes institutionnelles en matière de consentement éclairé et d’évaluation de la provenance. De plus, toutes les interventions chirurgicales et d’utilisation d’animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le comité de l’Institut de protection et d’utilisation des animaux de JHU (IACUC). Toutes les expériences impliquant des procédures animales (p. ex., injections sous-cutanées/intramusculaires de NOD. Les souris Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOG SCID) (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) pour l’analyse des tératomes et le transfert de blastocystes dans des souris pseudo-enceintes ICR) ont été examinées et approuvées par le JHU IACUC. Ces examens comprenaient des considérations relatives au sacrifice éthique, à un logement sans cruauté et à des mesures appropriées pour minimiser l’inconfort des animaux.

1. Reprogrammation épisomale des hiPSC sans xénosans nourricier

  1. Préparation de cellules progénitrices hématopoïétiques de donneur
    1. Utiliser des cellules souches hématopoïétiques/progénitrices CD34+ cryoconservées (p. ex. 1x106 cellules CB néonatales) immédiatement après l’accouchement ou stocker les cryoflacons dans un réservoir de stockage d’azote liquide. Assurez-vous que les cellules ont été maintenues en permanence à l’état congelé pendant le transport et la manipulation.
      REMARQUE : Alternativement, les cellules de donneurs non cryoconservées peuvent également être utilisées immédiatement après le prélèvement et l’enrichissement en CD34 en utilisant des protocoles approuvés.
    2. Avant de décongeler les cellules dans le bain-marie, ouvrez doucement le cryoflacon stérilisé dans une enceinte de biosécurité pour libérer tout gaz piégé à l’intérieur du flacon, puis fermez hermétiquement le flacon.
    3. Placez le flacon dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 min. Faites tourner doucement le flacon jusqu’à ce qu’il ne reste presque plus de glace. Retirez le flacon du bain-marie et stérilisez-le soigneusement (c’est-à-dire en vaporisant de l’éthanol à 70 %).
      REMARQUE : Toutes les étapes nécessitent une technique d’asepsie appropriée et sont effectuées dans une enceinte de capot de sécurité biologique stérile.
    4. Transférez doucement et lentement les cellules dans un tube conique stérile vide de 50 ml. Lavez le flacon avec 1 mL de milieu d’expansion du progéniteur hématopoïétique (progéniteur hématopoïétique xénolibre) froid (tableau 1) et combinez doucement (goutte à goutte le long des bords du tube) avec les cellules pour diluer le cryoprotecteur DMSO.
    5. Laissez le tube debout dans une grille pendant 30 s et ajoutez lentement (goutte à goutte) 2 ml de milieu XF-HP froid. Agitez doucement la suspension cellulaire tout en ajoutant le milieu. Répétez cette étape deux fois en ajoutant séquentiellement 4, 8 et 4 ml de milieu XF-HP froid (jusqu’à 20 ml de volume total). Centrifuger les cellules diluées à 100 x g pendant 10 min à 4 °C.
      REMARQUE : Ne faites pas pipter les cellules de haut en bas dans la solution cryoprotectrice et pendant les étapes de dilution. Ajoutez XP-HP medium goutte à goutte et lentement jusqu’à ce que le DMSO soit dilué au moins 10 fois. Utilisez un milieu froid car la dilution du DMSO entraîne une réaction exothermique.
    6. Aspirer le surnageant acellulaire dans une enceinte de biosécurité. Délogez doucement la pastille de cellule. Mettre en suspension dans 2 mL de milieu d’expansion XF-HP pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
    7. Transférez les cellules décongelées sur des plaques multipuits de culture cellulaire à très faible attachement (p. ex., transférez 2 mL de mélange de cellules/milieux XF-HP dans 1 puits d’une plaque à 6 puits).
    8. Enveloppez hermétiquement la plaque dans du film Saran pour imiter les conditions hypoxiques. Transvaser la plaque dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2, atmosphère humide). Vous pouvez également placer la plaque déballée dans un incubateur avec contrôle O2 (5 % O2, 5 % CO2, atmosphère humide).
    9. Cultivez les progéniteurs hématopoïétiques pendant 3 jours dans un milieu XF-HP.
  2. Préparation de cellules souches progénitrices mésenchymateuses (CSM)
    1. Décongeler une aliquote (0,75 - 1x106 cellules) de CSM humaines à faible passage (p2 à p3) en incubant une aliquote cryoconservée dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 min. Faites tourner doucement le flacon jusqu’à ce qu’il ne reste presque plus de glace. Retirez le flacon du bain-marie et stérilisez-le soigneusement (c’est-à-dire à 70 % d’éthanol).
      REMARQUE : Les CSM humaines à faible passage (p2) peuvent être achetées ou préparées à partir de moelle osseuse humaine en utilisant des protocoles établis et cryoconservées. Les CSM peuvent être décongelées environ 7 à 10 jours à l’avance et irradiées/plaquées comme couche nourricière la veille de la nucléofection (figure 1).
    2. Transférez doucement et lentement (en goutte à goutte le long des bords du tube) les cellules dans un tube conique de 15 mL contenant un milieu froid de cellules souches mésenchymateuses sans sérum xénofree (XF-MSC) (tableau 1) à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pour diluer le cryoprotecteur DMSO au moins 10 fois (p. ex. transvaser 1 mL d’aliquote de cellules cryopréservées dans un milieu XF-MSC de 9 mL).
    3. Utilisez 1 ou 2 ml de milieu XF-MSC froid pour rincer le tube et combiner dans le tube conique. Centrifuger les cellules diluées à 100 x g pendant 5 min à 4 °C.
    4. Aspirer le surnageant acellulaire dans une enceinte de biosécurité. Remettre doucement la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu XF-MSC pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
    5. Transférez les cellules décongelées sur des plaques multipuits de culture cellulaire traitées (par exemple, 5 000 à 6 000 cellules par cm2 ou environ 50 000 cellules dans 1 puits d’une plaque à 6 puits). Placer les assiettes dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2, atmosphère humide). Rafraîchir le milieu XF-MSC tous les 2-3 jours dans une enceinte de biosécurité.
    6. La veille de la nucléofection, aspirer le surnageant acellulaire dans une enceinte de biosécurité. Laver MSC une fois avec du PBS (2 ml/puits). Aspirer PBS. Ajouter 1 mL/puits de réactif de dissociation cellulaire (p. ex., une solution de trypsine-EDTA 1X). Incuber 5 min à 37 °C dans un incubateur deCO2 .
    7. Neutralisez le réactif de dissociation en ajoutant 1 mL de milieu XF-MSC (dilution d’au moins 2 fois) et triturez doucement à l’aide d’une pipette dans une suspension unicellulaire. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 100 x g pendant 5 min.
    8. Aspirez le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu XF-MSC pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
    9. Irradier (2 000 rad) les progéniteurs mésenchymateux en 5 passages à l’aide d’un irradiateur à rayons G ou X et d’une plaque sur une surface synthétique revêtue d’un peptide Arg-Gly-Asp (RGD), des plaques à 6 puits (2x10,5 cellules par puits) dans un milieu XF-MSC. Conservez les assiettes toute la nuit dans un incubateur (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humide).
  3. Reprogrammation épisomale Xenofree
    1. Prélever des cultures de CB HP âgées de 3 jours dans un milieu d’expansion XF-HP dans un tube conique de 15 mL dans une enceinte de biosécurité. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
    2. Aspirer le surnageant acellulaire dans une enceinte de biosécurité.  Remettre doucement la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu d’expansion XF-HP pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
    3. Combinez 1x106 cellules HP expansées avec 100 μL de solution de nucléofection de cellules CD34+ humaines (kit de nucléofecteur de cellules CD34+ humaines). Ajouter 6 μg d’épisome concentré purifié (<5 μL) et transférer délicatement dans une cuvette de nucléofecteur à l’aide de la pipette de transfert en plastique du kit de nucléofection. Évitez les bulles. Placez la cuvette dans le dispositif nucléofecteur et utilisez le programme U-008.
      REMARQUE : Préparer des stocks du vecteur épisomal pCEP4 à base d’EBNA pEP4 EO2S EM2K (OCT4, SOX2, MYC, KLF4) par transformation régulière en TOP10 E. coli et purifier à l’aide de kits plasmides Maxi-prep. Le jour de la nucléofection, nettoyez et concentrez le plasmide à l’aide d’un kit de purification PCR 7.
    4. Immédiatement après la nucléofection, ajouter 500 μL de milieu d’expansion XF-HP préchauffé dans la cuvette et transférer les cellules dans 1 mL de milieu XF-HP sur 1 puits de culture cellulaire à très faible fixation et une plaque à 6 puits à l’aide d’une pipette de transfert stérile.
      REMARQUE : Les cellules nucléofectées sont très fragiles et ne survivront pas à la contrainte de cisaillement des pointes de pipette ordinaires de 1 ml. Le transfert sur des plaques de culture à très faible fixation est une étape qui favorise la récupération des cellules post-nucléofection avant la fixation finale sur des plaques revêtues de RGD.
    5. Enveloppez hermétiquement la plaque dans une pellicule plastique pour imiter les conditions hypoxiques. Placez la plaque dans un incubateur de CO2 (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humide). Vous pouvez également placer la plaque déballée dans un incubateur avec contrôle O2 (5 % O2, 5 % CO2, atmosphère humide). Incuber pendant 4 à 6 heures.
      REMARQUE : Cette étape permettra aux cellules HP nucléofectées de récupérer avant d’être transférées sur des monocouches MSC.
    6. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 mL dans une enceinte de biosécurité. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
    7. Aspirer le surnageant dans une enceinte de biosécurité. Remettre la pastille de cellule en suspension dans 1 mL de milieu d’expansion XF-HP. Des cellules HP nucléofectées sur des CSM irradiées à une densité d’environ 17 500 cellules parcm2 dans des plaques revêtues de RGD dans un milieu d’expansion XF-HP (2 mL/puits) complété par l’inhibiteur de ROCK Y-27632 (concentration finale 10 μM). Placez la plaque dans un incubateur de CO2 (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humide).
    8. Deux jours après la nucléofection, ajouter 2 ml (volume égal) de milieu E8 dans chaque puits à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité.
    9. Remplacez la moitié du volume du milieu de culture tous les deux jours par du milieu E8. Prélever les cellules flottantes dans un tube conique de 15 mL, centrifuger à 200 x g pendant 5 min et rajouter les cellules récupérées à la culture.
    10. Le jour 21, préparez des plaques à 6 puits enrobées de vitronectine et traitées par culture tissulaire. Ajouter 1 ml de solution de vitronectine diluée (par exemple, 40 ml/ml pour Vitronectin-XF) dans 1 puits d’une plaque à 6 puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
    11. Prélever manuellement des colonies individuelles de XF-hiPSC à l’aide d’un microscope inversé dans une enceinte de biosécurité. Triturer avec une pipette et transférer des colonies individuelles sur des plaques recouvertes de vitronectine dans un milieu E8 complété par l’inhibiteur de ROCK Y-27632 (concentration finale 5 μM). Placez la plaque dans un incubateur de CO2 (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humide).
    12. Le lendemain, remplacez soigneusement le milieu par du milieu E8 sans supplémentation en inhibiteur de ROCK. Changer le milieu E8 tous les jours par la suite (2 mL/puits) dans une enceinte de biosécurité.

2. Culture et entretien réguliers des hiPSC

  1. Lorsque les colonies deviennent plus grandes 5 à 6 jours plus tard (c.-à-d. de 0,5 à 1 mm de diamètre ou environ 80 % de confluence), aspirez le milieu dans une enceinte de biosécurité.
  2. Ajouter 2 ml/puits de PBS pour laver les cellules. Aspirer le PBS. Ajouter 1 mL de solution de dissociation cellulaire à base d’EDTA. Incuber pendant 5 min dans un incubateur de CO2 (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humide). À l’aide d’un microscope, vérifiez que les cellules sont mal fixées (p. ex., des cellules rondes brillantes, mais toujours attachées à la plaque).
  3. Aspirez doucement la solution de dissociation dans une enceinte de biosécurité sans perturber les cellules.
  4. Prélever les cellules dans 1 à 2 mL de milieu E8 complété par l’inhibiteur de ROCK Y-27632 (concentration finale 5 μM) avec un pipetage non vigoureux pour maintenir les amas cellulaires. Transférez les amas de cellules sur des plaques traitées par culture cellulaire à 6 puits recouvertes de vitronectine (voir section 1.3.11) (équivalent de 10 colonies par puits ou d’une division 1:10). Placez la plaque dans un incubateur de CO2 (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humide).
  5. Poursuivez la sous-culture en utilisant une solution de dissociation cellulaire à base d’EDTA tous les 5 à 7 jours.
    REMARQUE : Un sous-clonage supplémentaire ou un prélèvement manuel des colonies n’est généralement pas nécessaire pour la reprogrammation des SP-CB-hiPSC, mais si les clones hiPSC contiennent des colonies à morphologie anormale (par exemple, différenciation spontanée telle que la formation de fibroblastes ou de corps embryoïdes, émergence de colonies anormales non plates), sélectionnez manuellement les colonies à l’aide d’une micro-pipette et d’un microscope dans une enceinte de biosécurité ou jetez les clones aberrants. La reprogrammation non efficace et non stable des hiPSC n’est pas compatible avec la réversion TIRN-SC.

3. Validation phénotypique des clones XF-hiPSC

  1. Étendre les clones XF-hiPSC sur au moins 5 à 7 passages pour la validation initiale (Figure 2) comme décrit dans la section 2, avant la cryoconservation à long terme et l’application dans les études fonctionnelles. Noter le nombre de passages sur chaque flacon cryoconservé.
    REMARQUE : La caractérisation initiale des clones XF-hiPSC à faible passage peut être confirmée par plusieurs dosages tels que l’activité de la phosphatase akaline et l’immunodétection de l’antigène TRA-1 ou du NANOG.
  2. Effectuez la validation et le dénombrement XF-hiPSC avec coloration à la phosphatase alcaline (Figure 2A,B).
    REMARQUE : L’efficacité de la reprogrammation dans les cultures en vrac peut être déterminée à P0 3-5 semaines après les nucléofections épisomiques en énumérant le nombre de colonies entièrement reprogrammées par cellule d’entrée unique plaquée le jour 3 7,13.
    1. Aspirer le milieu de culture dans une enceinte de biosécurité.
    2. Laver les cellules avec du PBS (2 mL par puits). Aspirer PBS. Fixez les cellules en ajoutant une solution de paraformaldéhyde/PBS à 2 %. Incuber 10 min à température ambiante.
    3. Retirer et éliminer la solution de paraformaldéhyde/PBS conformément aux directives de sécurité relatives aux déchets chimiques.
    4. Laver les cellules avec du PBS (2 mL par puits). Aspirer PBS. Ajouter 1 à 2 ml de substrat de phosphatase alcaline et incuber pendant 10 à 15 minutes à température ambiante avec agitation lente.
    5. Lavez 3 fois avec du PBS pour arrêter la réaction. Photomicrographie et énumération.
      REMARQUE : Évitez un temps d’incubation ou une température excessive car cela peut entraîner des taches faussement positives.
  3. Effectuer la validation et le dénombrement de la coloration XF-hiPSC à l’aide d’immunocolorants de l’antigène TRA-1 (Figure 2C).
    REMARQUE : Pour la reprogrammation épisomale, la détection de l’expression transgénique et du squelette du vecteur EBNA1 pendant les passages initiaux doit être effectuée à l’aide des protocoles publiés7. La validation de routine comprend le caryotype par bande G (figure 2D) ou des tests de couverture basés sur un réseau de génome entier. La pluripotence fonctionnelle de base peut également être testée à l’aide de protocoles de différenciation des tératomes (Figure 2E) ou de cartes de pointage quantitatives d’expression multigénique des différenciations corporelles embryoïdes non dirigées14.
    1. Dans une enceinte de biosécurité, l’immunocoloration réplique des puits pour les antigènes TRA-1-60 ou TRA-1-81 pendant 30 minutes en ajoutant des anticorps vivants conjugués au fluorochrome au milieu E8 à la concentration appropriée.
    2. Aspirez le milieu de culture. Laver deux fois avec un moyen E8 (2 mL par puits).
    3. Photomicrographie et dénombrement dans un milieu E8 ou un milieu sans rouge de phénol.
      REMARQUE : Alternativement, fixez les cellules à l’aide d’une solution de paraformaldéhyde/PBS à 2 % pendant 10 min à température ambiante et d’immunocoloration pour les antigènes TRA-1 à l’aide d’anticorps standard.
  4. Valider l’immunophénotype XF-hiPSC par cytométrie en flux.
    1. Dans une enceinte de biosécurité, aspirer le milieu de culture.
    2. Laver les cellules dans du PBS (2 mL par puits). Aspirer PBS. Ajouter un réactif de dissociation enzymatique (p. ex., Accutase, 1 mL par puits). Incuber la plaque pendant 5 min à 37 °C dans un incubateur de CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).
    3. Prélever les cellules en ajoutant un volume égal de milieu de culture et les passer à travers une passoire cellulaire (filtre de 40 à 70 μm). Cellules de centrifugation à 200 x g pendant 5 min.
    4. Mettre en suspension la pastille de cellules dans du PBS avec 5 % de FBS (1 mL par équivalent de puits). Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules. Distribuer environ 100 000 à 200 000 cellules dans des tubes à fond rond par test FACS (en maintenant les volumes à environ 100 μL par test).
    5. Pour les colorations extracellulaires, après une étape de blocage facultative à l’aide de sérum de souris pur (ajouter 5 μL par dosage, 5 min à température ambiante), incuber avec des anticorps conjugués au fluorochrome (par exemple, TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) selon les instructions du fabricant. Laver avec 3 mL de PBS. Centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g. Suspendez à nouveau dans le tampon FACS (par exemple, PBS avec 5 % FBS) et acquérez à l’aide d’un instrument FACS.
      REMARQUE : utilisez toujours des contrôles d’isotypes appropriés et colorez des échantillons parallèles pour valider la spécificité des protéines immunodétectées.
    6. Pour les colorations intracellulaires (par exemple, NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE), suivez les instructions du fabricant pour les étapes de fixation/perméabilisation. Incuber avec des anticorps conjugués au fluorochrome ou des contrôles d’isotypes correspondants. Acquérir à l’aide d’un instrument FACS.

4. Cryoconservation et décongélation de clones XF-hiPSC

  1. Étendre les clones XF-hiPSC sur au moins 5 à 7 passages pour effectuer une validation initiale (Figure 2) avant la cryoconservation à long terme et l’application dans des études fonctionnelles. Noter le nombre de passages sur chaque flacon cryoconservé.
    1. Aspirer le milieu de culture dans une enceinte de biosécurité.
    2. Laver les cellules avec du PBS (2 mL par puits). Aspirer PBS.  Ajouter une solution de détachement cellulaire à base d’EDTA (1 mL par puits) pour dissocier les colonies XF-hiPSC en amas cellulaires. Incuber la plaque pendant 5 min dans un incubateur de CO2 (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humide). À l’aide d’un microscope, vérifiez que les cellules sont mal fixées (p. ex. des cellules rondes brillantes).
    3. Aspirer doucement la solution de dissociation sans perturber les colonies cellulaires monocouches et prélever les cellules dans un milieu E8 de 1 à 2 ml avec un pipetage non vigoureux pour maintenir les amas cellulaires (10 à 50 cellules par amas). Prélever XF-hiPSC dans un tube conique stérile de 15 ml. Cellules de centrifugation à 200 x g pendant 5 min.
    4. Aspirer le surnageant dans une enceinte de biosécurité. Mettre en suspension la pastille cellulaire dans une solution de congélation (tableau 2, ~ 1 équivalent puits par mL).
    5. Transfert des cellules dans des tubes cryogéniques de stockage à long terme. Placez les tubes dans un récipient de congélation lente et laissez les échantillons geler pendant la nuit dans un congélateur à -80 °C. Le lendemain, placez les cryoflacons dans un congélateur à azote liquide pour un stockage à long terme.
  2. Pour la décongélation, préparez une plaque en l’enrobant au préalable de vitronectine (voir section 1.3.11).
    1. Placez le flacon congelé dans un bain-marie à 37 °C et décongelez les cellules pendant ~1-2 min. Stérilisez (c’est-à-dire pulvérisez de l’éthanol).
    2. Transférez lentement XF-hiPSC dans un tube conique stérile de 15 mL contenant 9 mL de milieu de décongélation (Tableau 2) pour diluer lentement les cellules 10 fois dans une enceinte de capot de sécurité biologique stérile.
      REMARQUE : Ne pipetez pas vigoureusement.
    3. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
    4. Aspirez le surnageant acellulaire dans une enceinte de biosécurité. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans un milieu E8 (1-2 mL) complété par un inhibiteur de ROCK (concentration finale 5 mM).
      Remarque : L’exclusion du Y-27632 entraînera une faible efficacité de récupération après décongélation.
    5. Transférez les cellules décongelées sur 1 ou 2 puits enrobés de vitronectine d’une plaque à 6 puits. Le lendemain, changez de milieu avec du milieu E8 régulier sans inhibiteur de ROCK pour l’expansion cellulaire.

5. Différenciation hématovasculaire xénolibre de XF-hiPSC

  1. Différencier XF-hiPSC à l’aide de notre protocole de différenciation hémato-vasculaire optimisé (Figure 3)4.
    REMARQUE : Ce protocole est modifié à partir de15.
    1. Préparer XF-hiPSC à ~40-50 % de confluence (1-3 jours après le passage).
    2. Aspirer le milieu de culture et ajouter 2 mL de milieu de dosage mésodermique (tableau 2) dans une enceinte de biosécurité.
    3. Après 2 jours, aspirer le milieu et ajouter 2 mL/puits de milieu de différenciation vasculaire (tableau 2) dans une enceinte de biosécurité. Si beaucoup de cellules mortes ou flottantes sont visibles à cette étape, laver une fois avec 2 mL de PBS.
    4. Remplacer le milieu de différenciation vasculaire tous les deux jours dans une enceinte de biosécurité jusqu’au 11e jour.
      REMARQUE : Si le milieu jaunit en raison d’une densité cellulaire élevée et d’un faible pH, ajoutez 1 mL de milieu frais ou remplacez-le tous les jours.
  2. Après 7 à 10 jours de culture dans un milieu de différenciation vasculaire, purifier les cellules vasculaires CD31+ ou CD34+ de la monocouche adhérente à l’aide d’une méthode de tri des cellules à billes magnétiques.
    REMARQUE : Chaque clone individuel peut présenter une cinétique de différenciation distincte. Déterminez le point temporel maximal de l’expression de CD31/CD34 par analyse FACS (Figure 4A). Une analyse FACS de l’enrichissement des billes magnétiques avant et après l’enrichissement des billes est requise. Les progéniteurs hématopoïétiques (HP) peuvent être récupérés à ce stade du surnageant et enrichis à l’aide de microbilles CD34. Les HP dérivés de CD34+ XF-hiPSC peuvent être validés davantage à l’aide d’un test de méthylcellulose (Figure 4B-C)16.
    1. Dans une enceinte de biosécurité, aspirer le milieu de culture et laver les cellules dans du PBS (2 mL par puits). Aspirez le PBS et dissociez les colonies de hiPSC en cellules uniques en ajoutant un réactif de dissociation enzymatique (par exemple, Accutase, 1 mL par puits). Incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C dans un incubateur de CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).
    2. Dans une enceinte de biosécurité, prélever les cellules en ajoutant un volume égal de milieu de culture. Cellules de centrifugation à 200 x g pendant 5 min.
    3. Remettre en suspension le culot cellulaire dans le milieu de différenciation vasculaire (Tableau 2). Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules. Réservez environ 50 000 à 100 000 cellules pour le test FACS d’enrichissement en billes prémagnétiques à l’aide d’anticorps anti-CD31 ou anti-CD34 directement conjugués.
    4. Centrifugez les cellules restantes à 300 x g pendant 5 min. Dans une enceinte de biosécurité, remettre en suspension les pastilles cellulaires dans un tampon d’enrichissement en billes magnétiques (PBS pH 7,2, 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’EDTA).
    5. Passez les cellules à travers une crépine de cellules (filtre de 40 à 70 μm). Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Remettre en suspension dans un tampon d’enrichissement à billes magnétiques de 60 μL.
    6. Ajouter 20 μL de réactif bloquant FcR, puis ajouter 20 μL de microbilles CD31 ou CD34 et incuber pendant 15 à 20 min à 4 °C.
    7. Laver les cellules avec un tampon d’enrichissement en billes magnétiques de 2 mL dans une armoire de biosécurité et une centrifugeuse (300 x g, 5 min).
    8. Mettre en suspension la pastille de cellule dans un tampon d’enrichissement en billes magnétiques de 1 mL dans une enceinte de biosécurité.
    9. Placez une colonne LS dans le champ magnétique d’un séparateur de cellules magnétiques à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité. Colonne de lavage avec tampon d’enrichissement en billes magnétiques de 3 ml.
    10. Appliquer des cellules à la colonne.  Prélever les cellules non marquées dans un tube conique de 15 ml. Lavez la colonne 3 fois avec un tampon d’enrichissement à billes magnétiques de 3 ml.
    11. Retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un nouveau tube conique de 15 ml.
    12. Rincez les cellules marquées magnétiquement en ajoutant 3 à 5 ml de milieu de croissance endothéliale. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
    13. Mettre en suspension dans 1 mL de milieu de croissance endothéliale dans une enceinte de biosécurité. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules. Mettez de côté environ 50 000 cellules pour l’enrichissement post-talon magnétique et triez la pureté par analyse FACS à l’aide d’anticorps anti-CD31 ou anti-CD34 directement conjugués.
    14. Le VP isolé peut être davantage développé sur des plaques de flacons traitées par culture tissulaire enrobées de fibronectine (10 μg/mL) dans un milieu de croissance endothéliale.

6. Lignes directrices de conception expérimentale pour la validation fonctionnelle de XF-hiPSC

  1. Établissez des stocks de XF-hiPSC validés dès les premiers passages à l’aide d’une méthode non intégratrice établie, telle que la reprogrammation épisomale 7,17, Sendai virus18 ou ARNm19.
    REMARQUE : Une comparaison de l’efficacité et de la fiabilité des méthodes sans reprogrammation est fournie ailleurs6. La clairance du matériel transgénique dans les méthodes de reprogrammation épisomale ou du virus Sendai peut être vérifiée lors des passages initiaux à l’aide de méthodes PCR 7,20. La rétention des transgènes n’est pas compatible avec la génération de TIRN-SC.
  2. Valider le caryotype normal chez les clones XF-hiPSC par des tests de couverture basés sur la bande G ou sur l’ensemble du génome9.
  3. Valider l’expression génique et l’intégrité épigénomique des lignées XF-hiPSC (c’est-à-dire les empreintes parentales, l’activation X) à l’aide de la méthylation de l’ADN et des réseaux d’expression génique ou des méthodes de séquençage 5,11,14.
  4. Validez la pluripotence fonctionnelle de base à l’aide de protocoles de différenciation des tératomes (Figure 2E), d’essais quantitatifs de différenciation des corps embryoïdes (EB) à l’aide de puces RT-PCR14 ou d’essais de différenciation dirigée vers les 3 couches germinales9.
    REMARQUE : Des méthodes quantitatives pour la capacité de différenciation multilignage et l’indice prolifératif intra-lignage des tests de tératome utilisant la caractérisation histologique par microscopie sont fournies ailleurs4. Les protocoles de différenciation dirigée vers les lignées mésodermiques et la spécification hémato-vasculaire (Figure 4A-C) ont été précédemment détaillés 4,5,9, ainsi que le test de différenciation dirigée vers l’endoderme définitif (Figure 4D)5. Des exemples d’essais de différenciation dirigée vers l’ectoderme sont fournis ailleurs 4,5.

7. Adaptation chimique TIRN de XF-hiPSC

  1. Achetez ou préparez des mangeoires MEF à passage bas à partir d’embryons de souris CF1 ou CF1 x DR4 hybrides E13.5 conformément aux protocoles publiés 9,21. Déposer 200 000 alimentateurs MEF par puits dans une plaque de 6 puits gélatinisée (0,1 % de gélatine dans l’eau, 1 mL par puits) traitée par culture tissulaire au moins un jour avant l’étape d’adaptation au TIRN (les protocoles détaillés du TIRN sont fournis ailleurs 4,5,9).
  2. Maintenir et étendre les cultures XF-hiPSC exemptes de transgènes avec des caryotypes normaux validés dans un système de culture sans mangeoire (p. ex., milieu E8, voir le tableau 1 pour la formulation interne).
  3. Remplacer le milieu E8 par le milieu LIF-5i (2 mL par puits ; Tableau 1) après que les cultures XF-hiPSC ont atteint une confluence de ~50 % (c.-à-d. 3 à 5 jours après le placage initial) dans une enceinte de biosécurité.
  4. Le lendemain, aspirer le milieu de culture et laver une fois le XF-hiPSC adapté à LIF-5i avec du PBS (2 mL par puits) dans une enceinte de biosécurité. Aspirer le surnageant et ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire enzymatique dans chaque puits. Incuber 5 min à 37 °C dans un incubateur deCO2 .
  5. Triturez doucement à l’aide d’une pipette dans une suspension unicellulaire dans une enceinte de biosécurité. Neutraliser avec le milieu LIF-5i (1 mL par puits). Prélever la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 ml.  Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
  6. Aspirer le surnageant dans une enceinte de biosécurité. Remettre la pastille de cellule en suspension dans 2 mL de milieu LIF-5i.
    REMARQUE : Si possible, prélever une aliquote pour le comptage cellulaire. Il est possible de neutraliser l’activité enzymatique avec le milieu LIF-5i/LIF-3i sans supplémentation en inhibiteurs ou en facteurs de croissance.
  7. Lavez la plaque MEF deux fois avec du PBS (2 mL par puits dans des plaques à 6 puits) et ajoutez des cellules (1 puits équivalent de cellules adaptées LIF-5i sur 1 puits de mangeoires MEF dans un milieu LIF-5i de 2 mL).
    REMARQUE : L’optimisation des densités initiales de placage pour chaque ligne XF-hiPSC individuelle est facultative. Si les cellules ont été comptées à l’étape précédente, placez un minimum de 1 x 106 cellules par puits sur les mangeoires.  Transvaser la plaque dans un incubateur àCO2 (37 °C, 5 % CO2, atmosphère humide).
  8. Cultiver et maintenir XF-hiPSC pendant 3 à 5 jours dans LIF-5i sur MEF dans un incubateur de CO2 (37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humide). Changez le milieu LIF-5i tous les jours.
  9. Lorsque des colonies de TIRN-SC en forme de dôme se forment (après 3 à 5 jours de culture sur des mangeoires), aspirer le milieu de culture dans une enceinte de biosécurité. Lavez chaque puits avec 2 ml de PBS.
  10. Aspirer PBS. Ajouter 1 mL de solution de décollement cellulaire (p. ex. Accutase) dans chaque puits. Incuber 5 min à 37 °C dans un incubateur de CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).
  11. Ajouter 1 mL de milieu LIF-3i (tableau 1) dans chaque puits d’une enceinte de biosécurité pour neutraliser le réactif de dissociation. Triturez doucement et recueillez les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
  12. Aspirer le surnageant dans une enceinte de biosécurité. Remettre en suspension dans le milieu LIF-3i (1 mL par puits) pour le comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules. Plaquez ~5 x 105 cellules dans un milieu LIF-3i de 2 mL par puits sur du MEF irradié dans des plaques gélatinisées à 6 puits dans une enceinte de biosécurité.
    REMARQUE : répéter les étapes 7.12 5o 7.16 pour tous les passages suivants.  Après la culture initiale adaptée à LIF-5i, mettre en plaques les cultures LIF-3i à une densité plus faible (2x105 cellules/puits) et passer tous les 3-4 jours.
  13. Passage TIRN-inversé XF-hiPSC pour au moins 6-7 passages continus dans le milieu LIF-3i avant utilisation dans des études fonctionnelles ou la cryoconservation. Noter le nombre de passages dans le milieu de culture amorcé xénofree (p. ex., E8) ou dans le milieu TIRN LIF-5i/LIF-3i.
    REMARQUE : La réversion TIRN des lignes XF-hiPSC à passage élevé (par exemple, >p40) est inefficace et n’est pas recommandée. Les lignées à haut passage présentent souvent des anomalies chromosomiques ou sous-chromosomiques, qui ne sont pas compatibles avec une réversion efficace de TIRN, et entraîneront une faible efficacité de réversion et une stabilité de culture limitée. De plus, l’utilisation de cultures TIRN ayant subi plus de 15 passages dans le milieu LIF-3i n’est pas recommandée pour les études fonctionnelles. L’impact fonctionnel de la réversion TIRN de XF-hiPSC est le plus important entre 7 et 15 passages dans le milieu LIF-3i.

8. Lignes directrices de conception expérimentale pour la différenciation dirigée de TIRN-SC dérivé de XF/FF hiPSC.

  1. Utiliser directement TIRN-SC dérivé de XF/FF hiPSC dans des protocoles de différenciation dirigée établis sans aucune étape de « réamorçage » (c’est-à-dire qu’il n’est pas nécessaire de revenir aux conditions conventionnelles de « amorçage » des cellules souches TIRN avant leur utilisation dans des essais de différenciation dirigée).
  2. Pour l’évaluation fonctionnelle de l’impact de TIRN sur XF-hiPSC, mettre en place des cultures isogéniques sœurs, à un nombre de passage équivalent en parallèle. Maintenir les cultures isogéniques XF-hiPSC amorcées/TIRN en parallèle dans leurs milieux respectifs (p. ex., E8 sur vitronectine vs. LIF-3i sur MEF), et effectuer simultanément un test de tératome (Figure 5), ou différencier à l’aide de corps embryoïdes identiques ou de protocoles et de matériaux de différenciation dirigée (Figure 6).
  3. Effectuer une évaluation fonctionnelle des lignées différenciées terminales, lorsque cela est possible. Par exemple, les progéniteurs vasculaires peuvent être évalués par l’expression protéique, le test d’absorption des lipoprotéines de basse densité (LDL) acétylées conjuguées au DiI et le test du tube Matrigel (Figure 7).
    REMARQUE : Des essais fonctionnels supplémentaires pour les VP dérivés de CB-hiPSC et de TIRN-SC (c.-à-d. les essais d’absorption/de sénescence, de prolifération/de migration de DiI-Ac-LDL, les essais in vitro sur tube Matrigel, les essais de plug-age Matrigel chez l’animal, les essais de xénotransplantation) sont détaillés ailleurs 3,4.
  4. Ajustez et optimisez les densités et la cinétique initiales de placage (Figure 6) pour chaque clone XF-hiPSC individuel dans chaque test de différenciation.
    REMARQUE : Les XF-hiPSC inversés par TIRN ont une capacité de prolifération et de différenciation plus robuste dans les essais de différenciation dirigée que les XF-hiPSC amorcés. Les cultures TIRN nécessitent généralement une densité initiale de placage inférieure à celle des cultures E8 et ne nécessitent pas l’utilisation de suppléments anti-apoptotiques pour améliorer la survie clonale.

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Résultats

Ce protocole optimise les méthodes publiées pour une reprogrammation efficace des progéniteurs myéloïdes vers un état pluripotent amorcé de haute fidélité à l’aide de vecteurs épisomaux et de signaux stromaux7. Le protocole (Figure 1) décrit les méthodes définies pour la reprogrammation épisomale amorcée par le stromal XF/FF des progéniteurs humains CB CD34+ en XF-hiPSC, et explique comment valider leur fonctionnalité via une spécification hémato-v...

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Discussion

Le groupe Zambidis a initialement présenté une méthode épisomale à quatre facteurs hautement optimisée pour reprogrammer les progéniteurs myéloïdes CB engagés dans la lignée en CB-hiPSC, avec des efficacités globales atteignant jusqu’à 50 % dans les cellules exprimant des épisomes purifiés7. Ici, nous avons présenté une version modifiée du protocole original de reprogrammation épisomale du progéniteur CB humain dans des conditions d’amorçage du stroma XF/FF. Cette...

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Déclarations de divulgation

Aucune divulgation à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH/NEI (R01EY032113 ; ETZ), le Fonds de recherche sur les cellules souches du Maryland (2023-MSCRFV-5995 ; 2024-MSCRFV-6248 ; 2025-MSCRFV-0005 ; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) et la Fondation Lisa Dean Moseley (ETZ).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Amaxa Biosystems Nucleofector IILonzaAAB-1001
anticorps anti-CD143 (BB9), APC conjuguéBD Biosciences557929Utilisation 10-20 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-CD144, conjugué au PEBD Biosciences560410Utilisation 10-20 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-CD146, conjugué au PEBD Biosciences550315Utilisation 10-20 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-CD184/CXCR4, APC conjuguéBD Biosciences555976Utilisation 10-20 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-CD31BD Biosciences550389Diluer 1:100 dans une solution bloquante pour le dosage immunofluorescent
anticorps anti-CD31, APC conjuguéeBiosciences17-0319-42Utilisation 2 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-CD34, APC conjuguéBD Biosciences555824Utilisation 5 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-CD45, conjugué au PEBD Biosciences555483Utilisation 10-20 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-NANANOG, conjugué au PEBD Biosciences560483Utilisation 10-20 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-OCT4, conjugué au PER& D SystèmesIC1759PUtilisation 10 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-SOX17, conjugué à Alexa488BD Biosciences562205Utilisation 5 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-SOX2, conjugué au PER& D SystèmesIC2018PUtilisation 10 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-SSEA-4, APC conjuguéR& Système DFAB1435AUtilisation 5 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-SSEA-4 GloLIVE, NL493 conjuguéR& Système DNLLC1435GUtilisation à dilution 1:50 (immunomarquages vivants et fixes)
anti-TRA-1-60 Kit conjugué A488ThermoFisher ScientificN° A25618
anticorps anti-TRA1-60, conjugué au PEBD Biosciences560193Utilisation 10 & micro ; L par dosage (FACS)
anticorps anti-TRA-1-60 GloLIVE, NL557 conjuguéR& D SystèmesNLLC4770Rutiliser at  ; une dilution de 1:50 (immunomarquages vivants et fixes)
anti-TRA-1-60 Anticorps StainAlive, DyLight 488 conjuguéTige09-0068Utilisation à une dilution de 1:100 (immunomarquages vivants et fixes)
anticorps anti-TRA1-81, conjugué PEBD Biosciences560161Utilisation 10 & micro ; L par dosage (FACS)
anti-TRA-1-81 Anticorps StainAlive, DyLight 488 conjuguéTige09-0069Utilisation à une dilution de 1:100 (immunomarquages vivants et fixes)
CD31 Kit de microbilles, humainMiltenyi Biotec130-091-935
CD34 MicroBead Kit, humainMiltenyi Biotec130-046-702
CD34+ Donneurs mixtes,  ; Sang de cordon, 1 million de cellulesAllCellsCB, CR, CD34+, Mixte, PS, CS10, 1MD’autres sources de cellules comprennent le foie fœtal, la moelle osseuse adulte et le sang périphérique mobilisé
Souris CF1Rivière Charles023
CHIR99021R& Système DN° L5283reconstituer à 100 mM dans le DMSO
Plaques 6 puits traitées pour culture tissulaire Corning CostarCorning3506
Substrat Corning Synthemax II-SC, flacon de 10 mgCorning3535Utilisation à 5 &mu ; g/cm2 en remplacement de Corning 3978
Plaque Corning Synthemax-R à 6 puitsCorning3978abandonné et remplacé par 3535
Costar 6 puits transparent à fond plat à fond ultra-faible Plaque à 6 puitsCorning3471
Comtesse  ; Lame de chambre de comptage cellulaireThermo Fisher ScientificRéf. C10228
Compteur de cellules automatisé ComtesseThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoStore CS10StemCell Technologies100-1061
DII-AC-LDLThermo Fisher ScientificN° L3484Utilisation à 5-15 &Micro ; g/mL
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)  ;Thermo Fisher Scientific11995065
DMEM/F-12 , Supplément GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018
DMEM/F-12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032
DMSO (diméthylsulfoxyde)Sigma AldrichD2650
Souris DR4Le Laboratoire Jackson3208
Milieu Essential 8 (E8)StemCell Technologies5940
Sérum de bovin fœtal (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
RÉPARER & Kit de perméabilisation cellulaire PERMThermo Fisher ScientificGAZ004
ForskolineTige04-0025reconstituer à 100 mM dans le DMSO
Gélatine (porcine)Sigma AldrichG1890-100GRemettre en suspension dans l’eau et stériliser à l’autoclave
noyau de cellules CD34+ humaines  ; trousseLonzaVPA-1003
Isotype souris IgG1 PE conjuguéBD Biosciences554680
Isotype souris IgG2a PE conjuguéBD Biosciences558595
Isotype rat IgG2b PE conjuguéR& D SystèmesRéférence IC013P
Remplacement du sérum KnockOutThermo Fisher Scientific10828-028
Acide L-ascorbiqueMillipore SigmaA8960
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
Colonnes LSMiltenyi Biotec130-042-401
MatrigelCorning356237Utilisation 200 & micro ; L/puits en plaques de 48 puits
Acide aminé non essentiel MEM (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
MethoCult SF H4436StemCell Technologies04436
Séparateur MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
mTeSR1 moyenStemCell Technologies85850
Flacons cryogéniques NalgeneThermo Fisher Scientific5000-0020
Solution de paraformaldéhyde, 4 % dans du PBSThermo Fisher ScientificJ19943. K2diluer à la concentration requise à l’aide de PBS
PD0325901Sigma AldrichRéf. PZ0162reconstituer à 100 mM dans le DMSO
Pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Épisome pEP4 E02S EM2KAddgene20923Les plasmides ont été propagés dans TOP10  ;E.  ; coli (Invitrogen) et purifié avec les kits Maxi de plasmide QIAGEN.
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Industries biologiquesRéférence 02-023-1A
Cellules souches mésenchymateuses humaines Poietics  ;LonzaPT-2501750 000 cellules au passage 2 peuvent être décongelées et étendues selon les instructions du fabricant pour 1-2 passages avant utilisation ou inclinaison secondaire
PurmorphamineTige04-0009reconstituer à 10 mM dans le DMSO
Activine A recombinantePeprotech120-14Eresuspendre à  ; (100 et micro ; g/mL) dans du PBS stérile, 0,1 % d’albumine sérique humaine ou bovine
FGF2 humain recombinantPeprotech100 à 18 milliardsresuspendre à  ; (100 et micro ; g/mL) dans du PBS stérile, 0,1 % d’albumine sérique humaine ou bovine
FGF-basic humain recombinant (bFGF)Peprotech100 à 18 milliardsresupend à 100 µ ; g/mL dans 0,1 % de sérum bovin/albumine humaine dans le PBS
ligand FLT3 humain recombinantR& D Systèmes308-FKHB ou  ; 308F-GMPresuspendre à  ; (100 et micro ; g/mL) dans du PBS stérile, 0,1 % d’albumine sérique humaine ou bovine
insuline humaine recombinanteBiogemmes10-365
Kit-ligand humain recombinantR& D SystèmesBT-SCF ou BT-SCF-GMPresuspendre à  ; (100 et micro ; g/mL) dans du PBS stérile, 0,1 % d’albumine sérique humaine ou bovine
LIF humain recombinantPeprotech300-05resupend à 100 µ ; g/mL dans 0,1 % d’albumine sérique bovine/humaine dans le PBS
TGF&bêta humain recombinant ; 1Peprotech  ; 100-21resupend à 100 µ ; g/mL dans 0,1 % d’albumine sérique bovine/humaine dans le PBS
thrombopoïétine humaine recombinante  ;R& D Systèmes288-TPN ou 288E-GMPresuspendre à  ; (100 et micro ; g/mL) dans du PBS stérile, 0,1 % d’albumine sérique humaine ou bovine
transferrine humaine recombinanteMillipore SigmaRéf. T3705
BMP4 humain recommandéPeprotech120-05resuspendre à  ; (100 et micro ; g/mL) dans du PBS stérile, 0,1 % d’albumine sérique humaine ou bovine
SB431543SelleckchemS1067reconstituer à 10 mM dans le DMSO
SIGMAFAST, substrat de phosphatase alcaline, chromogène, compriméMillipore SigmaRéf. B5655dissoudre 1 comprimé dans 10 mL d’eau purifiée
Sélénite de sodiumMillipore SigmaS5261
Stemolécule Y27632 en solutionTige04-0012-02Inhibiteur de ROCK en solution (10 mM)
StemPro Accutase réactif de dissociation cellulaireThermo Fisher ScientificRéférence A11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)Thermo Fisher ScientificA1067501Préparez le milieu XF-MSC en mélangeant 5 ml de supplément StemPro MSC SFM XenoFree avec 500 ml de milieu de base StemPro MSC SFM. Le milieu aliquote peut être cryoconservé à -20° ;C.
StemSpan SFEMStemCell Technologies9600
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XAV939Sigma AldrichX3004reconstituer à 100 mM dans le DMSO
&bêta ;-mercaptoéthanolThermo Fisher Scientific21985-023sensible à la lumière

Références

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