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Article de méthode

Déplétion ciblée du nerf sensoriel cornéen par injection sous-conjonctivale : un modèle pour l’étude de l’adhésion bactérienne et des interactions neuro-immunes

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DOI :

10.3791/68614

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29 août 2025

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1New England College of Optometry

Dans cet article

Résumé

Cette étude établit un modèle affiné de la déplétion du nerf sensoriel cornéen à l’aide de la bupivacaïne, révélant son impact sur le nerf cornéen et l’adhésion bactérienne. Le modèle simule des affections neuropathiques, fournissant des informations sur les interactions neuro-immunes dans les infections oculaires et offrant des applications dans l’administration de médicaments, la neuroprotection, la modulation immunitaire et les études de modification génétique.

Résumé

Les nerfs sensoriels cornéens jouent un rôle central dans le soutien de l’intégrité de la surface oculaire et des mécanismes de défense immunitaire. La perte de cette innervation a été associée à une vulnérabilité accrue à l’invasion microbienne, mais la contribution précise de l’épuisement des nerfs à l’adhésion bactérienne sur la cornée reste insuffisamment caractérisée. Ici, nous présentons une méthode reproductible et contrôlée dans le temps pour la suppression sélective des nerfs sensoriels cornéens à l’aide de la bupivacaïne, un inhibiteur des canaux sodiques à action prolongée. En combinant les voies d’administration subconjonctivales et topiques, cette stratégie à double application permet d’obtenir une dénervation robuste et soutenue, permettant une étude précise de la façon dont l’entrée sensorielle altérée influence la susceptibilité de l’épithélium cornéen à la colonisation bactérienne.

À l’aide de ce modèle, nous étudions comment la dénervation sensorielle influence la dynamique d’adhésion microbienne pour Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et Pseudomonas aeruginosa, trois agents pathogènes cliniquement pertinents avec des mécanismes d’adhésion distincts. L’inoculation bactérienne standardisée par la méthode de tamponnage en laboratoire assure un dépôt uniforme sur la surface de la cornée, suivi d’une évaluation quantitative de l’adhésion bactérienne. L’épuisement nerveux induit par la bupivacaïne est corrélé à une diminution de la densité nerveuse cornéenne et à une augmentation de l’adhésion bactérienne, confirmant un lien fonctionnel entre l’épuisement sensoriel et la sensibilité microbienne.

En simulant des affections neuropathiques telles que la neuropathie diabétique et la kératite neurotrophique, cette approche fournit un nouveau cadre pour l’étude des interactions neuro-immunes dans les infections oculaires. Au-delà des modèles d’infection, cette stratégie d’injection sous-conjonctivale offre une plate-forme polyvalente pour l’étude de la pharmacocinétique oculaire des médicaments, des interventions neuroprotectrices et de la modulation immunitaire. De plus, il peut être adapté pour des études de modification génétique, y compris l’administration sous-conjonctivale de constructions CRISPR/Cas ou de vecteurs viraux, élargissant ainsi ses applications dans la recherche ophtalmique et thérapeutique.

Introduction

L’innervation sensorielle de la cornée joue un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la surface oculaire et de l’homéostasie immunitaire. La cornée est l’un des tissus les plus densément innervés du corps, principalement alimenté par la division ophtalmique du nerf trijumeau1. Ces nerfs sensoriels interviennent non seulement dans les réflexes de nociception et de clignement des yeux, mais régulent également la prolifération épithéliale, la cicatrisation des plaies et la surveillanceimmunitaire2,3. Toute perturbation de l’innervation sensorielle peut donc compromettre la barrière cornéenne, altérer le microenvironnement de la surface oculaire et augmenter la sensibilité aux infections microbiennes.

Le dysfonctionnement sensoriel de la cornée est associé à des affections systémiques telles que le diabète sucré et contribue à des pathologies oculaires, notamment la sécheresse oculaire, la kératopathie diabétique, la kératite neurotrophique et les complications post-chirurgicales 3,4,5,6,7,8,9,10 . L’insuffisance des nerfs sensoriels entraîne une réduction de la production de larmes, un amincissement de l’épithélium et un retard de cicatrisation des plaies, ce qui facilite la colonisation bactérienne11,12. Cependant, le lien mécaniste précis entre l’épuisement des nerfs sensoriels et l’adhésion bactérienne reste insuffisamment compris. Bien que des études aient démontré une augmentation de l’adhérence bactérienne après une dénervation cornéenne, il existe un manque de modèles normalisés permettant une investigation contrôlée de cette relation.

Pour combler cette lacune, nous avons développé un modèle ciblé de l’épuisement des nerfs sensoriels cornéens à l’aide de la bupivacaïne, un inhibiteur des canaux sodiques à action prolongée qui imite la neuropathie clinique sans causer de lésions nerveuses permanentes 13,14,15. Cette approche pharmacologique fournit une méthode contrôlée et reproductible pour étudier l’appauvrissement du nerf cornéen et ses effets sur la surface oculaire15. En intégrant ce modèle à des tests d’adhésion bactérienne, nous pouvons évaluer systématiquement l’impact de l’épuisement des nerfs sensoriels sur la colonisation microbienne, en imitant des aspects clés de la kératopathie diabétique et de la kératite neurotrophique.

L’adhésion microbienne est un événement précoce critique dans les infections cornéennes, influencée par la composition du film lacrymal, les propriétés de surface épithéliales et les réponses immunitaires de l’hôte. Parmi les divers agents pathogènes capables de coloniser la surface oculaire, S. aureus, S. epidermidis et P. aeruginosa représentent trois bactéries cliniquement significatives avec des mécanismes d’adhésion distincts. P. aeruginosa, une bactérie à Gram négatif très virulente, utilise des pili, des flagelles et des facteurs de virulence sécrétés pour adhérer rapidement aux cellules épithéliales cornéennes et les envahir, entraînant souvent une kératite ulcéreuse sévère16,17. En revanche, S. epidermidis, une bactérie commensale à Gram positif, exploite principalement les surfaces épithéliales perturbées et les altérations du film lacrymal pour établir des biofilms, contribuant ainsi à des infections persistantes et souvent subcliniques18,19. Les différences dans les stratégies d’adhésion entre ces espèces mettent en évidence la nécessité de comprendre comment l’épuisement des nerfs cornéens modifie le microenvironnement oculaire pour favoriser la colonisation bactérienne.

L’un des principaux défis de l’étude de l’adhésion bactérienne est le choix d’un modèle d’inoculation approprié. Le modèle conventionnel des blessures par égratignure, fréquemment utilisé dans les études d’infection, crée des défauts épithéliales pour faciliter l’adhésion bactérienne. Bien qu’efficace pour simuler les infections induites par un traumatisme, cette approche introduit d’importantes variables confondantes, notamment des lésions tissulaires excessives et une réponse inflammatoire exagérée, qui ne représentent pas avec précision les premiers stades de la colonisation bactérienne dans les cornées neuropathiques. De plus, la variabilité des lésions mécaniques rend difficile l’obtention de résultats reproductibles. Pour surmonter ces limitations, une méthode d’inoculation bactérienne plus contrôlée et physiologiquement pertinente est nécessaire.

La technique de transfert par essuyage en laboratoire offre une approche standardisée du dépôt bactérien, assurant une adhérence bactérienne uniforme sans perturber la barrière épithéliale20. Cette méthode imite étroitement les scénarios de susceptibilité du monde réel, où l’adhésion bactérienne se produit en l’absence de traumatisme mécanique manifeste, mais dans des conditions de composition lacrymale modifiée et d’homéostasie épithéliale. En éliminant la variabilité associée aux lésions mécaniques, la méthode de transfert par essuyage en laboratoire fournit une évaluation plus précise de la dynamique d’adhésion microbienne dans les cornées neuropathiques. De plus, il permet d’évaluer de manière contrôlée les contributions du film lacrymal à la colonisation bactérienne, ce qui est particulièrement pertinent en cas de dysfonctionnement sensoriel de la cornée où la sécrétion lacrymale est altérée.

Étant donné le rôle critique des nerfs sensoriels cornéens dans la régulation de la production de larmes et de l’homéostasie épithéliale, il est essentiel d’établir un modèle reproductible pour étudier les conséquences de l’épuisement des nerfs sensoriels sur l’adhésion microbienne. Cette étude vise à affiner un protocole de déplétion ciblée des nerfs sensoriels cornéens à l’aide de la bupivacaïne, un anesthésique local à action prolongée, afin d’évaluer ses effets sur la sécrétion lacrymale et l’adhésion bactérienne. En utilisant une combinaison d’application sous-conjonctivale et topique de bupivacaïne, cette approche garantit une déplétion sensorielle localisée et soutenue à un moment défini de l’efficacité maximale. À l’aide de ce modèle, nous étudions comment la dénervation sensorielle modifie la dynamique d’adhésion de S. aureus, S. epidermidis et P. aeruginosa, fournissant des informations précieuses sur la relation entre l’épuisement des nerfs, les altérations du film lacrymal et la susceptibilité microbienne. Ces résultats ont des implications plus larges pour la compréhension de la susceptibilité aux infections dans les affections neuropathiques telles que la kératopathie diabétique et la kératite neurotrophique et offrent une base pour de futures études sur les interactions neuro-immunitaires oculaires et les interventions thérapeutiques.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées conformément aux normes établies par l’Association for Research in Vision and Ophthalmology et ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du New England College of Optometry et ont adhéré à la politique de PHS sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire. Des souris C57BL/6J mâles et femelles âgées de six à huit semaines (de type sauvage, souche n° 000664) ont été obtenues du Jackson Laboratory, et les souris ont été élevées selon des rythmes circadiens normaux (un cycle lumière/obscurité de 12 heures) et ont reçu de la nourriture et de l’eau. Maintenir une technique stérile tout au long de toutes les procédures.

1. Préparation animale pour l’injection sous-conjonctivale

  1. Induisez l’anesthésie en utilisant 2-3 % d’isoflurane dans l’oxygène via un vaporisateur calibré. Surveillez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant l’absence de réponse réflexe à un léger pincement des orteils.
  2. Observez continuellement l’animal pour détecter tout signe d’inconfort ou de détresse grave.
  3. Si une détresse est observée, induire une anesthésie profonde avec 5 % d’isoflurane et confirmer l’absence de réponse.
  4. Effectuer une luxation cervicale pour assurer l’euthanasie.
  5. Sinon, effectuez immédiatement l’énucléation à l’aide d’une pince à énucléation incurvée pour les analyses en aval.

2. Bloc nerveux cornéen par injection sous-conjonctivale

REMARQUE : Mettre en œuvre un protocole en deux étapes impliquant l’injection sous-conjonctivale et l’application topique de bupivacaïne pour obtenir une déplétion ciblée du nerf sensoriel cornéen. Effectuer des injections sous-conjonctivales et des applications topiques dans un délai de 15 minutes afin de minimiser l’exposition à l’anesthésique systémique.

  1. Préparation du site et incision
    1. Créez une petite incision (~0,5 mm) au niveau de la région limbique suptemporale à l’aide d’une aiguille de 30 G. Évitez les vaisseaux sanguins et minimisez les traumatismes tissulaires. Utilisez l’incision pour accéder à l’espace sous-conjonctival pour l’administration contrôlée du médicament.
  2. Injection de bupivacaïne
    1. Préparez une solution de chlorhydrate de bupivacaïne à 0,5 % dans des conditions stériles.
    2. Chargez 5 μL de la solution dans une seringue Hamilton de 10 μL munie d’une aiguille émoussée à petit embase de 33 G (type de pointe 3).
    3. Injectez la solution dans l’espace sous-conjonctival à un angle de 15 à 20° pour minimiser le reflux et assurer une distribution uniforme.
    4. Observer la formation de bulles au site d’injection ; Laissez-le persister pendant 5 à 10 s et dispersez-le dans la poche sous-conjonctivale jusqu’à ce qu’il soit complètement absorbé.
  3. Renforcement topique de la désensibilisation cornéenne
    1. Appliquez 5 μL supplémentaires de bupivacaïne à 0,5 % directement sur la cornée centrale immédiatement après l’injection sous-conjonctivale.
      REMARQUE : Utilisez cette étape pour améliorer la désensibilisation des nerfs de surface et prolonger l’effet anesthésique local.
  4. Groupe témoin
    1. Administrer 5 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par injection sous-conjonctivale et application topique à des moments identiques pour les animaux témoins. Faites correspondre les étapes de la procédure et le volume pour tenir compte des effets liés à l’injection.
  5. Analyse de la durée du traitement et des points finaux
    1. Administrer un traitement à la bupivacaïne tous les deux jours pendant 15 jours pour obtenir une déplétion soutenue des nerfs sensoriels tout en minimisant la toxicité.
    2. Le 15e jour, euthanasier les souris 4 h après le traitement final à la bupivacaïne à l’aide d’isoflurane à 5 % d’oxygène à l’aide d’un vaporisateur calibré, suivi d’une luxation cervicale.
    3. Prélever immédiatement les cornées d’un groupe de souris (voir l’étape 5.5) pour évaluer les altérations de la densité nerveuse à l’aide de l’immunohistochimie (voir la figure 1 et la section 6 du protocole), et d’un autre groupe pour l’analyse de l’adhérence bactérienne (voir la figure 1 et la section 5 du protocole).

3. Préparation animale pour l’inoculation bactérienne

  1. Administrer de la kétamine intrapéritonéale (80-100 mg/kg) et de la dexmédétomidine (0,25-0,5 mg/kg) pour anesthésier les souris quatre heures après l’injection finale de bupivacaïne et l’application topique le 15e jour.
  2. Confirmez l’anesthésie profonde en vérifiant l’absence de réponses réflexes au pincement des orteils.
  3. Rincer la surface oculaire 3 fois à l’aide d’une pipette avec 5 μL de PBS stérile pour éliminer le liquide lacrymal résiduel et les débris, assurant ainsi une surface cornéenne propre pour les études d’adhésion bactérienne (voir Figure 1)
  4. Dans le groupe expérimental désigné, utilisez un chiffon de laboratoire non pelucheux pour éponger la surface de la cornée de manière normalisée.
    1. Pliez le papier de soie pour assurer une prise en main sûre.
    2. Essuyez doucement la cornée de la souris anesthésiée 4x, en commençant par la cornée centrale et en utilisant un mouvement de rotation vers la droite et la gauche pour inclure les régions périphériques20.
      REMARQUE : Appliquez une pression minimale pour éviter les blessures mécaniques tout en éliminant efficacement le liquide lacrymal pour faciliter l’adhésion bactérienne.

4. Préparation de l’inoculum bactérien et inoculation de la cornée

  1. Culture et préparation bactériennes
    1. Cultivez S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 et P. aeruginosa O1 sur une gélose tryptique de soja (TSA) et incubez à 37 °C avec de l’eau stérile placée dans l’incubateur pour maintenir l’humidité.
    2. Récoltez les colonies individuelles et suspendez-les dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Centrifugez la suspension à 5 000 × g pendant 5 minutes une fois pour éliminer les cellules mortes et les sous-produits métaboliques.
    3. Remettre en suspension la pastille bactérienne dans du PBS et ajuster la concentration à ~10¹¹ UFC/mL pour assurer une charge bactérienne élevée pour les études d’adhésion.
  2. Protocole d’inoculation cornéenne
    1. Appliquer une aliquote de 5 μL de la suspension bactérienne préparée sur la surface de la cornée une fois toutes les heures pendant 4 h sous anesthésie soutenue.
    2. Placez les souris à une légère inclinaison pour éviter le ruissellement et assurer une exposition constante à l’inoculum.
    3. Répéter l’inoculation à des intervalles d’une heure pour imiter l’exposition bactérienne persistante pertinente aux scénarios cliniques d’infection.
  3. Euthanasie post-inoculation et évaluation de l’adhérence bactérienne
    1. Après 4 h, administrer une injection intrapéritonéale de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg) pour assurer une anesthésie profonde.
    2. Effectuer une luxation cervicale pour euthanasier les souris sans cruauté.
    3. Énucléez les yeux à l’aide d’une pince stérile à bout incurvé tout en maintenant des conditions d’asepsie strictes pour éviter la contamination.
    4. Rincer la surface oculaire 5 à 6 fois avec 2 ml stériles de PBS dans une boîte de Pétri en secouant doucement pour éliminer complètement les bactéries non adhérentes.
    5. Homogénéiser les yeux énucléés dans 1 mL de PBS stérile à l’aide d’un homogénéisateur mécanique de tissus pour assurer une récupération bactérienne constante et maintenir des conditions aseptiques pour prévenir la contamination.
    6. Effectuer des dilutions sextuples en série de l’homogénat dans du PBS stérile.
    7. Déposer des aliquotes sur plaque de chaque dilution sur des plaques TSA et incuber toute la nuit à 37 °C pour permettre la croissance des colonies.
    8. Compter les unités formant colonies (UFC) et exprimer les résultats en log UFC par cornée à des fins de comparaison quantitative.

5. Immunohistochimie

  1. Euthanasier des souris par luxation cervicale le 15e jour après le traitement.
  2. Énucléez soigneusement les yeux et rincez-les une fois avec du PBS à température ambiante sous une rotation douce.
  3. Fixer les yeux énucléés dans du paraformaldéhyde (PFA) à 2 % pendant 1 h pour préserver l’intégrité structurelle
  4. Laver les yeux fixes 3 x 10 min dans 1 mL de PBS sous une rotation douce à température ambiante.
  5. Suivez le protocole de dissection cornéenne décrit précédemment21,22
    1. Disséquez les cornées dans une boîte de Pétri de 35 mm de large remplie d’une quantité minimale de PBS.
    2. Utilisez une pince à bord droit pour stabiliser l’œil énucléé et des ciseaux chirurgicaux pour créer une petite incision sur la face postérieure du globe.
    3. Utilisez le petit point d’incision pour couper soigneusement le long de l’aspect postérieur à 360°.
    4. Jetez la rétine murine, le nerf optique, le cristallin, le pigment de l’iris et toute autre structure tissulaire qui n’est pas la cornée.
    5. Retirez tout excès de tissu à l’aide d’une pince à règle droite ou en incisionnant soigneusement avec des ciseaux chirurgicaux en gardant la cornée intacte.
    6. Laver les cornées disséquées 3 x 10 min dans 1 mL de PBS placé dans des tubes de microcentrifugation sous une rotation douce à température ambiante.
  6. Incuber les cornées dans 1 mL de solution bloquante (3 % BSA + Triton X-100 dans PBS) pendant 1 h à température ambiante avec rotation continue.
  7. Améliorez la perméabilisation des tissus en incubant les cornées dans 1 mL d’EDTA à 20 % pendant une heure supplémentaire dans les mêmes conditions.
  8. Incuber les cornées pendant la nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire anti-β-tubuline III de lapin sous une rotation douce à température ambiante.
  9. Le lendemain, incubez les tissus avec l’anticorps secondaire IgG anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 488 et le DAPI pour la coloration nucléaire pendant 2-3 h à 4 °C dans l’obscurité.
  10. Laver les cornées 3 x 10 min avec du PBS sous une rotation douce.
  11. Suivez le protocole de montage à plat de la cornée décrit précédemment21,22
    1. Montez à plat les cornées colorées sur des lames de verre en plaçant la cornée sur le bord de la lame pour éliminer l’excès de liquide.
    2. Repositionnez la cornée au centre de la lame de microscope avec le côté épithélial vers le bas, en contact avec la surface de la lame.
    3. Faites quatre incisions droites (1 à 2 mm de longueur) du bord périphérique vers le centre à l’aide d’une lame de plume chirurgicale pour créer des demi-quadrants.
    4. Appliquez 20 μL de collant et placez une lamelle en verre de 8 mm sur la cornée.
    5. Appuyez doucement sur la lamelle pour éliminer les bulles d’air et éviter le plissement de la cornée.
    6. Conservez l’échantillon à température ambiante dans l’obscurité pour le séchage.
    7. Scellez les bords de la lamelle avec un protecteur d’ongles transparent pour éviter le séchage à l’air et stockez les lames dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’imagerie.

6. Imagerie

  1. Effectuez une microscopie confocale à l’aide d’un microscope confocal droit à deux photons avec un objectif d’immersion dans l’eau 20x/1,00 NA.
  2. Placez les échantillons montés à plat sur la platine du microscope et installez l’objectif à immersion dans l’eau 20x/1.00 NA.
  3. Tamisez les lumières de la pièce et couvrez le microscope d’un chiffon noir opaque pour minimiser les interférences de lumière externe pendant l’imagerie.
  4. Visualisez les nerfs cornéens à l’aide du canal laser Alexa Fluor 488 nm et détectez les noyaux cellulaires à l’aide du canal laser DAPI 405 nm.
  5. Réglez la taille de l’image sur 1 536 x 1 536, le sténopé sur 1 unité d’Airy (AU) et la vitesse de numérisation sur 1,02 μs. Activez le balayage bidirectionnel et appliquez une moyenne 2x.
  6. Ajustez le gain principal (~750 V) et minimisez l’intensité de la puissance laser pour éviter le photoblanchiment et la phototoxicité tout en assurant une capture d’image claire.
  7. Effectuez une imagerie Z-stack pour capturer toute l’épaisseur de la cornée. Réglez le premier plan focal sur l’aspect le plus antérieur et le dernier sur l’aspect le plus postérieur de l’échantillon.
  8. Acquérez des piles Z à des intervalles de pas de 0,8 μm ou 1,0 μm, en capturant environ 60 à 80 piles totales par échantillon.
  9. Évaluation de la densité nerveuse cornéenne
    1. Analysez la densité nerveuse cornéenne à l’aide du logiciel Imaris.
    2. Vérifiez l’épaisseur totale de l’image en vérifiant les dimensions du volume.
    3. Activez l’option de rendu volumique pour générer une reconstruction 3D.
    4. Créez une projection d’intensité maximale pour convertir la pile Z en une vue 2D pour la visualisation et la quantification.
    5. Évaluer la densité nerveuse cornéenne sur une échelle de 0 à 10 par des évaluateurs à l’aveugle pour assurer une évaluation objective.

7. Analyse statistique

  1. Évaluez la distribution des données à l’aide des tests Shapiro-Wilk et Kolmogorov-Smirnov.
  2. Si la majorité des données suivent une distribution normale, présentez les résultats sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET).
  3. Pour les comparaisons entre deux groupes, appliquez le test t de Student et utilisez l’ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey pour les analyses impliquant trois groupes ou plus.
  4. Considérons qu’une valeur p < 0,05 est statistiquement significative.

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Résultats

Sauf indication contraire, toutes les expériences ont été réalisées indépendamment en trois exemplaires, chaque répétition comprenant 3 à 4 souris par groupe.

Réduction significative de la densité nerveuse cornéenne après un traitement à la bupivacaïne
Afin d’évaluer systématiquement l’impact de la déplétion ciblée du nerf sensoriel cornéen, la densité nerveuse cornéenne a été évaluée à l’aide de l’immunomarquage et de la microscopie confocale. Des souris ont reçu des injec...

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Discussion

Les nerfs sensoriels cornéens jouent un rôle central dans le maintien de l’intégrité de la surface oculaire, la régulation de l’homéostasie épithéliale et la modulation des réponses immunitaires. La névrite cornéenne, caractérisée par une dégénérescence nerveuse et une inflammation, est fréquemment observée dans des affections systémiques telles que le diabète sucré, où l’hyperglycémie chronique contribue à la neuropathie périphérique, y compris la perte de nerfs cornéens. Des études ont...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution de chlorhydrate de bupivacaïne à 0,5 %  ;Pfizer INC. États-UnisNDC 00409-1162-01
Aiguille de 30 gFabricant : BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, États-Unis305106
Aiguille émoussée à petit moyeu 33 G (style de pointe 3)  ;Hamilton Company, Reno, NV, États-Unis7803-05
4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrateThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-UnisD1306
Albumine sérique bovineSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisA7906
Souris C57BL/6J (de type sauvage)Laboratoire Jackson. 000664
Rotateur CantrifugeThe Lab Depot, Inc. (Dawsonville, GA, États-Unis)R2020
Protecteur d’ongles transparentHumide et sauvageN/A
Microscope de dissection (SMZ-160-TLED Microscope stéréo (dissection) avec port trinoculaire)Stellar Scientific (Baltimore, MD, États-Unis)1.1002E+12
Acide éthylènediaminetétraacétiqueSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisE6511
Chèvre anti-Lapin IgG Alexa Fluor 488  ;Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-UnisA-11008
Hamilton 10-&mu ; Seringue LHamilton Company, Reno, NV, États-Unis7635-01
Micro-ciseaux de dissection de haute précisionThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-UnisRéférence 08-953-1B
L’isofluranePatterson Veterinary, États-Unis07-890-8115
Vaporisateur d’isofluraneKent Scientific, États-UnisVETFLO1205S
Chlorhydrate de kétamineDechra Veterinary Products, Overland Park, KS, États-UnisDP00050
Papier de soie non pelucheux KimwipeKimberly-Clark Professionnelle, Roswell, GA, États-Unis34155
Pince de micro-dissection incurvée à l’avant (pour l’énucléation)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisRéférence F4142-1EA
Pince à micro-dissection droite à l’avantSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-UnisRéf. F4017
Boîtes de Pétri (100 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis263991
Boîtes de Pétri (35 mm)Avantor, via VWR International (Radnor, Pennsylvanie, États-Unis).25373-041
Saline tamponnée au phosphate  ;Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, États-UnisC987D24
Montage anti-décoloration ProLong GoldThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-UnisRéf. P36930
Lapin anti-&beta ;-Tubuline IIISigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis)  ;Réf. T2200
Couvercle rond en verre allemand (8 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis50-949-314
Manches de scalpelSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis)  ;S2896-1EA
Lames de microscopeSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis)  ;S8902-1PAK
Tubes de microcentrifugation à faible rétention Snap CapThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis3453
Sorvall Instruments RT6000B centrifugeuse de paillasseThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis3367898
Lames de plumes chirurgicalesWorld Precision Instruments (Sarasota, Floride, États-Unis)504169  ;
Gélose tryptique de sojaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis)  ;22091
Xylazine  ;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis1236-20-8

Références

  1. Belmonte, C. Pain, dryness, and itch sensations in eye surface disorders are defined by a balance between inflammation and sensory nerve injury. Cornea. 38 (Suppl 1), S11-S24 (2019).
  2. Müller, L. J., Marfurt, C. F., Kruse, F., Tervo, T. M. T. Corneal nerves: Structure, contents and function. Exp Eye Res. 76 (5), 521-542 (2003).
  3. Gao, N., Me, R., Yu, F. S. X. Diabetes exacerbates Pseudomonas aeruginosa keratitis in streptozotocin-induced and db/db mice via altering programmed cell death pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (7), 14(2023).
  4. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  5. Asiedu, K., et al. Tear film and ocular surface neuropeptides: Characteristics, synthesis, signaling and implications for ocular surface and systemic diseases. Exp Eye Res. 218, 108973(2022).
  6. Zhou, T., Lee, A., Lo, A. C. Y., Kwok, J. S. W. J. Diabetic corneal neuropathy: Pathogenic mechanisms and therapeutic strategies. Front Pharmacol. 13, 816062(2022).
  7. Yu, F. S. X., et al. The impact of sensory neuropathy and inflammation on epithelial wound healing in diabetic corneas. Prog Retin Eye Res. 89, 101039(2022).
  8. Bron, A. J., et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf. 15 (3), 438-510 (2017).
  9. Belmonte, C., et al. TFOS DEWS II pain and sensation report. Ocul Surf. 15 (3), 404-437 (2017).
  10. Vereertbrugghen, A., Galletti, J. G. Corneal nerves and their role in dry eye pathophysiology. Exp Eye Res. 222, 109191(2022).
  11. Gonzalez, O. A., et al. Antimicrobial peptides: Defending the mucosal epithelial barrier. Front Oral Health. 1 (3), 958480(2022).
  12. Fusco, A., Savio, V., Perfetto, B., Mattina, R., Donnarumma, G. Antimicrobial peptide human β-defensin-2 improves in vitro cellular viability and reduces pro-inflammatory effects induced by enteroinvasive Escherichia coli in Caco-2 cells by inhibiting invasion and virulence factors' expression. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1009415(2022).
  13. Nau, C., Vogel, W., Hempelmann, G., Brä, M. E. Stereoselectivity of bupivacaine in local anesthetic-sensitive ion channels of peripheral nerve. Anesthesiology. 91, 786-795 (1999).
  14. Valenzuela, C., Snyders, D. J., Bennett, P. B., Tamargo, J., Hondeghem, L. M. Stereoselective block of cardiac sodium channels by bupivacaine in guinea pig ventricular myocytes. Circulation. 92 (10), 3014-3024 (1995).
  15. Becker, D. E., Reed, K. L. Local anesthetics: Review of pharmacological considerations. Anesth Prog. 59 (2), quiz 103-103 90-102 (2012).
  16. Khalifa, A. B. H., Moissenet, D., Thien, H. V., Khedher, M. Virulence factors in Pseudomonas aeruginosa: Mechanisms and modes of regulation. Ann Biol Clin (Paris). 69 (4), 393-403 (2011).
  17. Laventie, B. J., et al. A surface-induced asymmetric program promotes tissue colonization by Pseudomonas aeruginosa. Cell Host Microbe. 25 (1), 140-152.e6 (2019).
  18. Büttner, H., Mack, D., Rohde, H. Structural basis of Staphylococcus epidermidis biofilm formation: Mechanisms and molecular interactions. Front Cell Infect Microbiol. 5 (17), 14(2015).
  19. Brescó, M. S., et al. Pathogenic mechanisms and host interactions in Staphylococcus epidermidis device-related infection. Front Microbiol. 8, 1401(2017).
  20. Wan, S., et al. Nerve-associated transient receptor potential ion channels can contribute to intrinsic resistance to bacterial adhesion in vivo. FASEB J. 35 (10), e21899(2021).
  21. Datta, A., et al. TRPA1 and TPRV1 ion channels are required for contact lens-induced corneal parainflammation and can modulate levels of resident corneal immune cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (11), 21(2023).
  22. Datta, A., et al. Contact lens-induced corneal parainflammation involving Ly6G+ cell infiltration requires IL-17A and γδ T cells. Ocul Surf. 28, 79-89 (2023).
  23. Datta, A., Orallo, G. K., Nelson, N. Corneal sensory nerve loss induced by repeated subconjunctival and topical bupivacaine disrupts tear secretion and enhances bacterial adhesion via neuropeptide modulation. PLOS ONE. , In Press (2025).
  24. Schultz, R. O., Peters, M. A., Sobocinski, K., Nassif, K., Schultz, K. J. Diabetic keratopathy as a manifestation of peripheral neuropathy. Am J Ophthalmol. 96 (3), 368-371 (1983).
  25. Belmonte, C., Acosta, M. C., Gallar, J. Neural basis of sensation in intact and injured corneas. Exp Eye Res. 78 (3), 513-525 (2004).
  26. Sitompul, R. Corneal sensitivity as a potential marker of diabetic neuropathy. Acta Med Indones. 49 (2), 166-172 (2017).
  27. O'Brien, P. D., Hur, J., Hayes, J. M., Backus, C., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analyses. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
  28. Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin-and leptin receptor-deficient rodent models: Relevance for human type 2 diabetes. Curr Diabetes Rev. 10 (2), 131-145 (2014).
  29. Islam, M. S. Animal models of diabetic neuropathy: Progress since 1960s. J Diabetes Res. 2013, 149452(2013).
  30. Ma, L., et al. CGRP released by corneal sensory nerve maintains tear secretion of the lacrimal gland. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (4), 30(2024).
  31. Bower, J. J., Song, Z., Song, L. Subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models. J Vis Exp. (181), e63532(2022).
  32. Jumelle, C., Gholizadeh, S., Annabi, N., Dana, R. Advances and limitations of drug delivery systems formulated as eye drops 1. J Control Release. 321, 1-22 (2020).

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